ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。

这样每100 ul溶液含1x106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5x106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4x106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

将2管混在一起，共800 ul。

7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。

共14次。

二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。

去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。

3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）前面的文章中已经向大家介绍了免疫共沉淀技术（IP）的原理和方法，这一技术可以帮助我们便捷地探究蛋白与蛋白之间的互相作用。

但若研究的靶蛋白可能发挥组蛋白修饰酶的功能，或是可能作为某种转录因子发挥作用，那么就要应用染色质免疫共沉淀技术（chromatin-immunoprecipitation，ChIP）方法来探究其与DNA 的直接调控了。

ChIP可以真实、完整地反映结合在DNA启动子区上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。

接下来，我们一起来学习一下ChIP技术吧！1ChIP基本原理ChIP是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP不仅可以检测转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

基因的转录是从启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程通常需要一些特异的转录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平。

此外，基因的转录还会受到表观遗传的调控，如组蛋白甲基化修饰、乙酰化修饰等，组蛋白特异位点的修饰均可以直接影响基因的转录水平。

因此，ChIP主要用于研究特异的转录因子或组蛋白修饰酶与下游基因启动子区的结合，如果ChIP发现二者可以结合，那么这说明该基因可能是其下游基因。

要想进一步证明，还要做高低表达和荧光素酶等实验。

目前，ChIP与一些高通量测序的结合，扩大了其应用范围：比如，ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-ChIP已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合，可分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

楼上说的准确的叫Co-IP。

IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。

其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。

而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。

抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。

2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。

3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。

4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。

5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。

800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。

步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。

裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。

步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。

2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。

3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。

步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。

(2)、在超声池中注入一定量的冰水。

ChIP实验常见问题解析ChIP实验常见问题解析1.染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，如何进行优化？染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑:（1）重复已发表文献中的剪切方案时建议进行优化。

尤其是当仪器不同于文献中所使用的仪器时。

（2）使用基于探头的超声破碎仪时，探头要适于样品体积。

（3）在任何情况下，剪切参数都应当根据样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。

（4）优化应当包括功率设置（超声时间 vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数；（5）注意时间和功率设置。

过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。

降低染色质免疫共沉淀（ChIP）信号。

（6）始终保持裂解液冰冷，间断超声（而非连续），因为超声处理产生热量会使染色质变性。

（7）在超声破碎过程中避免气泡。

泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。

为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。

（8）在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。

剪切不足所产生大的不溶复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。

通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。

2.染色质免疫共沉淀（ChIP）实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？染色质免疫共沉淀（ChIP）实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高且较稳定，转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达。

所以组蛋白相对研究起来更为容易，一般需要105-106个细胞即可完成一个染色质免疫共沉淀（ChIP）反应。

研究起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。

另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，不太适合使用酶法的处理方式，建议使用超声断裂染色质的方法。

染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。

染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。

下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。

检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。

ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。

ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案染色质免疫沉淀-芯片试剂盒染色质免疫沉淀(芯片)的完整溶液是研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，将其随机切割成一定长度范围内的小染色质片段，然后通过免疫学方法沉淀复合物，特异性富集与靶蛋白结合的DNA片段。

通过目标片段的纯化和检测，可以获得关于蛋白质和DNA之间相互作用的信息。

芯片不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态相互作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

此外，芯片与其他方法的结合扩大了其应用范围:通过芯片与基因芯片的结合建立的芯片-芯片法已广泛用于高通量筛选特异的反式因子靶基因；芯片结合体内足迹法寻找反式因子的体内结合位点；核糖核酸芯片用于研究核糖核酸在基因表达调控中的作用因此，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

就目前国内研究状况而言，教师在研究领域有分化、转录、发育、诱导多能性、肿瘤干细胞、表观遗传学等。

会做ChIP实验，一些老师会自己购买抗体，手动配置试剂。

然而，因为实验本身具有复杂的实验步骤，并且其中许多步骤非常关键，需要更多的试剂，所以很容易导致配置之间的错误，并且实验周期长。

如果没有设置阴性和阳性对照，结果就无法分析，从而导致无休止的混乱。

经典染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002):提供细胞样品上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂此外，试剂盒包含阳性对照抗体(核糖核酸聚合酶2抗体)、阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)和GAPDH引物(可用作阳性对照，以确保试剂盒中的试剂和操作步骤没有问题)在大多数生长中的哺乳动物细胞中，核酸聚合酶II富集在GAPDH基因启动子上，为启动转录做准备，因此启动子可以与核酸聚合酶II进行免疫沉淀反应，但不能与正常的小鼠IgG进行免疫沉淀反应。

在该染色质免疫沉淀反应中，细胞与甲醛偶联以提取其中的染色质染色质被适当破坏，然后加入微孔中，与吸附在微孔表面的抗体反应特异性结合在微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物中释放出来，通过我们公司专门设计的高速离心柱进行翻转和纯化。

一、超声剪切染色质1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min，使DNA与蛋白质交联2.终止交联，加入终浓度为0.125M的甘氨酸3.用预冷的PBS洗2次4.用PBS将细胞刮下（5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶）5.4500rpm5min（此阶段细胞沉淀可储存于-80℃）6.弃上清，按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer（现加PMSF&coktail），冰上10min（4℃rotation 30min）7.27G针头注射器吹打3遍，若有气泡离心8.超声：不可有气泡，超两次后放到冰上9.离心：4℃，12000rpm，20min，上清转移到15ml离心管二、Ab沉淀目的染色质1.用dilution buffer稀释至1ml2.取50ul Input（也可取少量做lgG阴性对照，RNaseⅡ阴性对照）备注：取450ul做lgGcontrol，剩余500ul3.剩下的加一抗（5ul/ml），4℃rotate过夜4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads，4℃rotate2h，之后可在冰上沉淀一会5.离心，1000rpm1min，留上清6.洗珠子，1ml/5min/次，在4℃rotate，再在冰上静置5min，1000rpm1min。

洗涤顺序为：低盐溶液→高盐溶液→LicL（之前在4℃）→TE→TE（室温）三、去除蛋白质1.Elution buffer（1%SDS、0.1MNaHCO3；0.5gSDS，0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20）+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清（收集）→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清（收集）2.上清+20ul5M NaClInput+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl65℃6-7h或过夜3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K（50℃1h）？四、提纯DNA1.加等体积（500ul）Tris-饱和酚，剧烈混匀，14500rpm10min，取上清，加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min，取上清后再加入tRNA60ug （200ug/ml，3ul），加异丙醇500ul，离心14500rpm20min 弃上清2.加70%酒精洗一遍，14500rpm5min，（要去掉上清，先倒掉，倒掉之后离心一下再扔掉液体）将管子倒扣空气晾干。

植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒产品说明书主要用途植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋白的目标DNA序列的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。

广泛应用于定性检测各种植物组织（花瓣、叶片、种子等）DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白（例如转录因子）及其突变形成等。

产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。

技术背景DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。

染色质免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA和蛋白质的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。

CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第三，分析目标DNA和蛋白的修饰。

其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达到控制基因表达。

产品内容清理液（Reagent A）毫升固着液（Reagent B）毫升终止液（Reagent C）毫升裂解液A（Reagent D）毫升裂解液B（Reagent E）毫升裂解液C（Reagent F）毫升核溶液（Reagent G）毫升稀释液（Reagent H）毫升结合液（Reagent I）毫升低盐液（Reagent J）毫升高盐液（Reagent K）毫升平衡液（Reagent L）毫升缓冲液（Reagent M）毫升洗脱液（Reagent N）毫升解联液（Reagent O）毫升酶解液（Reagent P）微升萃取液（Reagent Q）毫升浓缩液（Reagent R）毫升沉淀液（Reagent S）毫升净化液（Reagent T）毫升扩增液（Reagent U）微升补充液（Reagent V）毫升说明书1份保存方式保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent G）、稀释液（Reagent H）、结合液（Reagent I）、解联液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、萃取液（Reagent Q）、浓缩液（Reagent R）和扩增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月用户自备特异抗体：用于目标蛋白的结合特异引物：用于目标DNA的扩增或测序1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器2毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器50毫升锥形离心管：用于植物组织处理的容器恒温水槽：用于孵育反应物震荡器：用于混匀反应物4℃微型台式离心机：用于沉淀样品4℃台式离心机：用于沉淀样品平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织细胞超声仪：用于裂解植物组织细胞核PCR仪：用于扩增反应电泳仪：用于检测扩增产物实验步骤实验开始前，准备好待测植物的预处理：药物处理等。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。

此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。

例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。