遗传毒性杂质的警示结构0

01、何为基因毒性杂质基因毒性杂质（或遗传毒性杂质，Genotoxic Impurity，GTI）是指能直接或间接损害DNA，引起DNA突变、染色体断裂、DNA重组及DNA 复制过程中共价键结合或插入，导致基因突变或癌症的物质（如卤代烷烃、烷基磺酸酯类等）。

潜在基因毒性杂质（Potential Genotoxic Impurity ，PGI）结构中含有与基因毒性杂质反应活性相似的基团（如肼类、环氧化合物、N-亚硝胺类等），通常也作为基因毒性杂质来评估。

基因毒性杂质主要来源于原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物。

此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能会降解产生基因毒性杂质。

除此之外，有些药物通过激活正常细胞而产生基因毒性物质导致突变，如化疗药物顺铂等。

02、何为基因毒性杂质“警示结构”由于杂质结构的多样性，一般很难进行归类，因此，在缺乏安全性数据支持的情况下，法规和指导原则采用“警示结构”用来区分普通杂质和基因毒性杂质。

所谓“警示结构”，是指杂质中的特殊基团可能与遗传物质发生化学反应，诱导基因突变或者染色体断裂，因此具有潜在的致癌风险。

对于含有警示结构的杂质，应当进行（Q）SAR预测和体内外遗传毒性和致癌性研究，或者将杂质水平控制在毒理学关注阈值（TTC）之下。

但是含有警示结构并不能说明该杂质一定具有遗传毒性，而确认有遗传毒性的物质也不一定会产生致癌作用。

杂质自身性质和结构特点会对其毒性产生抑制或调节作用。

警示结构的重要性在于它提示了可能存在的遗传毒性和致癌性，为进一步的杂质安全性评价与控制指明方向。

（关于基因毒杂质警示结构的详细信息可参考欧盟发布的警示结构《Development ofstructure alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents》）。

03、基因毒性杂质严格控制的必要性基因毒性杂质最主要的特点是在极低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，导致基因突变并促使肿瘤发生。

在原料药（Q3A）和药物制剂（Q3B）的杂质指导原则中，杂质限度确定的依据包括各个杂质的生物安全性数据或杂质在某特定含量水平的研究概况。

而对于遗传毒性杂质限度的确定，通常都认为是特别关键的问题，但目前尚无相关的指导原则。

2. 适用范围本指导原则阐述了如何处理新原料药中遗传毒性杂质的一般框架和实际方法。

该指导原则也适用于已有原料药的新申请，如果其合成路线、过程控制和杂质研究尚无法确保不会产生新的或更高含量的遗传毒性杂质（与EU目前批准的相同原料药相比）。

该指导原则同样适用于已上市原料药有关合成方面的补充申请。

除非有特殊原因，本指导原则不适用于已上市的产品。

3. 毒理学背景根据目前的研究实践，具有（体内）遗传毒性的化合物在任何暴露量下都有可能对DNA 产生损伤，而这种损伤可能会引发肿瘤。

因此，对于遗传毒性致癌物质，应谨慎认为不存在明确的阈值，任何暴露量下都存在风险。

然而，对于一些遗传毒性事件，其产生生物学意义的阈值效应的机理正越来越为人所了解。

对于非DNA靶点的化合物和潜在致突变剂更是如此，因为它们在与关键靶点接触前就已经去毒化了。

对于这些化合物，研究的基础可以是确定关键的未观察到影响的剂量（NOEL）和采用不确定因子。

即使对能与DNA分子发生反应的化合物，由于低剂量时有多种有效的保护机制存在，而不能将高剂量下的影响以线性方式外推到很低的（人）暴露水平。

不过，目前要用实验方法证明某诱变剂的遗传毒性阈值仍然非常困难。

所以，在缺乏恰当的证据支持遗传毒性阈值存在的情况下，确定安全剂量很困难，因此非常有必要采用一个可接受风险的暴露水平概念。

正如Q3A指导原则所述，根据合理的化学反应机理分析，在新的原料药合成、纯化和贮存过程中很有可能产生实际的和潜在的杂质。

依据现有的“可能引起遗传毒性的结构”数据库，潜在的遗传毒性杂质应能被确认。

如果潜在的杂质含有可引起遗传毒性的结构单元，该杂质应考虑进行遗传毒性试验（一般是细菌回复突变试验）（Dobo等，2006）。

遗传毒性致癌物发生致癌和致突变的作用，第一步一般认为都是和DNA发生反应。

从机理上理解基因毒性杂质的作用原理，不用死记硬背，就能轻松记住所有的基因毒性杂质。

根据Miller的理论：致癌物要么是亲电试剂，要么可以代谢成亲电试剂。

然后和DNA的亲核基团发生反应。

DNA的亲核活性基团主要有：•碱基上的氮•碱基上的氧•磷酸酯骨架先来看一下DNA的结构双螺旋的DNA主要含有四个碱基，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及磷酸酯的串联骨架。

这些嘧啶和嘌呤上面的氮氧都富有电子，如果遇见一些缺电子的试剂，很容易发生取代等反应。

事实上，DNA的反应种类除了只反应某一处位点外，还会有一些比较复杂的反应类型：•可以看到有的碱基上不仅含有一个亲核位点，如果一个致癌物有两处亲电位点，反应一处后，还会和碱基的另外一个位点反应，生成一些小环。

•双亲电基团的另外一个基团也有可能和两个不同的碱基链接，甚至可以和两个螺旋上的不同碱基链接。

•也会有可能另外一个基团和蛋白质反应，造成DNA-蛋白质的链接。

DNA的反应活性除了亲核性之外，主要受空间结构的影响。

Guanine中的N7位置位于DNA双螺旋的大沟槽处，空间较大，容易和亲电试剂接触，反应活性显然要比Adenine中处于小沟槽中的N3（红色数字）要高。

当然根据结构也能预知，Adenine的N1和Cytosine的N3（绿色数字）位置处于狭窄的分子空间内，又有氢键相连，所以基本上没有反应活性。

DNA反应并不都是反应在氧和氮上，比如粉红色的C8位置也能发生反应，不过该反应也是先和相邻的N7反应然后重排到C8。

纯粹的理论说明略显枯燥，下面会详细介绍每一类含有警示结构的致癌物。

酰化试剂酰基卤化物酰基卤化物由于卤原子电负性较大，吸引电子，导致羰基碳非常缺电子，一旦和DNA接触，会和腺嘌呤的羰基氧发生酯化反应。

二甲氨基甲酰氯和二乙氨基甲酰氯被IARC归为致癌物2A类。

异氰酸酯是具有多种商业应用的高活性化合物。

化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE第30卷，第1期2021年1月V ol. 30，No. 1Jan. 202159doi ：10.3969／j.issn.1008–6145.2021.01.012高效液相色谱荧光检测法测定药物中的氯乙酰氯汤加园，陈向明(滨州医学院药学院，山东烟台　264003)摘要　建立测定药物中氯乙酰氯含量的高效液相色谱–荧光检测方法。

以吖啶酮乙酰肼为荧光标记试剂，对氯乙酰氯进行柱前衍生。

在室温下反应15 min ，衍生产率达到最大。

衍生溶液在XDB–C 18柱上，以水和乙腈为流动相进行分析，激发波长和发射波长分别为255 nm 和429 nm 。

氯乙酰氯浓度在1～1 000 nmol ／L 范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，线性相关系数r =0.999 9。

方法的检出限为0.35 nmol ／L ，仪器精密度和方法精密度分别为0.52%和0.67%(n =6)。

样品加标回收率为92.5%～95.6%。

该方法简单、准确，精密度良好，可用于测定药物中氯乙酰氯的残留量。

关键词　高效液相色谱；荧光检测；氯乙酰氯中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008–6145(2021)01–0059–04Determination of chloroacetyl chloride in drug substance by high performanceliquid chromatography with fluorescence detectionTang Jiayuan ， Chen Xiangming(School of Pharmacy ， Binzhou Medical University ， Yantai 264003， China)Abstract A high performance liquid chromatography method coupled with fluorescence detection to determine chloroacetyl chloride in drug substance was developed. Acridone acetyl hydrazine was used as fluorescence labeling reagent and chloroacetyl chloride was derived before column. Optimum derivatization was obtained at room temperature for 15 min. The derivative was separated on a reversed-phase XDB–C 18 column in conjunction with water and acetonitrile as mobile phase. The excitation and emission wavelengths were 255 nm and 429 nm respectively. The concerntration of chloroacetyl chloride had good linear ralationship with the chromatographic peak area in the range of 1–1 000 nmol ／L, the linear correlation coefficient r =0.999 9. The instrument precision and method precision were 0.52%, 0.67%(n =6)，respectively. The detection limit of the method was 0.35 nmol ／L ，and the recoveries were in the range of 92.5%–95.6%. The method is simple ，accurate and showed good repeatability ，which can be used to determine the content of chloroacetyl chloride in drug substance.Keywords high performance liquid chromatography; fluorescence detection; chloroacetyl chloride药物中的遗传毒性杂质是一类能损伤细胞遗传物质并引起基因突变或体内诱变的物质，较少的摄入量就能够对身体健康产生严重的损害［1–2］。

1EMEA人用药品委员会(CHMP)《遗传毒性杂质限度指导原则》原文：European Medicines Agency: Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities. CPMP/SWP/5199/02。

EMEA/CHMP/QWP/251344/2006。

London, 28 June 2006关键词：杂质；遗传毒性；毒理学担忧阈值(TTC)；构效关系(SAR)摘要遗传毒性杂质的毒理学评估和药物原料中此类杂质的可接受限度确定是难题，现有ICHQ3X指南中未充分说明。

常用遗传毒性杂质数据库差异很大，而数据库是决定(dictates)可接受限度评估所用方法的主要因素。

当运用已建立风险评估方法所需资料缺乏时，包括致癌性长期试验资料或提供遗传毒性阈值机制证据的资料等，建议采用毒理学担忧阈值(TTC)所定义的普遍适用方法。

对大部分药物(Pharmaceuticals)，认为TTC值为遗传毒性杂质摄入量1.5µg/天时相关的风险可接受(一生中额外的癌症风险<1/100000)。

根据该阈值，药物原料中允许水平可根据预计每日剂量计算得到。

短期暴露等特定情况下可能有理由提高限度。

1.1前言在原料药（Q3A，新药物原料中的杂质）和药物制剂（Q3B，新药物制剂中的杂质）的指导原则中描述了杂质限度确定的一般概念，将限度确定定义为确定在特定水平下单个杂质或给定杂质谱的生物学安全性的资料的获得和评价过程。

对于有遗传毒性潜力的杂质，确定可接受剂量水平通常被认为是特别重要的问题，现有指导原则尚未专门涵盖。

1.2适用范围本指导原则阐述了如何处理新药物原料中遗传毒性杂质的一般框架和实践方法。

若新申请的已有药物原料经合成路线、过程控制和杂质谱评估未提供合理保证，证明与EU已批准的含相同药物原料的药品相比，未引入新的或更高水平的遗传毒性杂质，本指导原则也适用于已有药物原料的新申请。

遗传毒性杂质遗传毒性：泛指各种因素（物理、化学因素）与细胞或生物体的遗传物质发生作用而产生的毒性。

1、致突变性：与DNA相互作用产生直接潜在的影响，使基因突变（bacteria reverse mutation（Ames）试验）2、致癌性：具有致癌可能或倾向（需要长期研究！）3、警示结构特征：一些特殊的结构单元具有与遗传物质发生化学反应的能力，会诱导基因突变或者导致染色体重排或断裂，具有潜在的致癌风险。

遗传毒性物质：在很低的浓度下即可诱导基因突变以及染色体的断裂和重排，因此具有潜在的致癌性。

EMA通告（1）、具体事项：1、哪些品种中会出现甲磺酸酯（或甲磺酸烷基酯）。

特别是甲磺酸盐等形式的API或其合成中用到甲磺酸的API，甲磺酸烷基酯-甲磺酸甲酯、乙酯、其它低级醇酯，应认定为潜在杂质。

2、羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐的API。

应说明类似物质磺酸烷基酯或芳基酯污染的危险。

3、限度要求：无其它毒性数据时，这些高风险杂质应依据TTC设定限度。

1.5μg÷以g为单位的最大日剂量得ppm限度。

4、法律依据：EP专论要求凡以甲磺酸盐和羟乙基磺酸盐形式存在的API，均应在其生产过程中采取以下安全措施：必须对生产工艺进行评估以确定家磺酸烷基酯（羟乙基磺酸烷基酯）形成的可能，特别是反应溶媒含低级醇的时候，很可能会出现这些杂质。

必需时需对生产工艺进行验证以说明在成品中未检出这类杂质。

（2）、落实措施：1、API生产是否涉及在甲磺酸（羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸等低分子量磺酸）或相应酰氯存在下，使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等低级脂肪醇（如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等）。

2、对相应酯形成的可能性是否降到最低。

3、是否有有效的清除精制步骤。

设备清洗-是否设计的低级脂肪醇的使用（方法，TTC限度）？起始物料（低分子量磺酸盐或酰氯）中是否控制了其低级脂肪醇酯（方法，TTC限度）？当被磺酸酯或相关物质污染的磺酸用于API合成时能否保证其中潜在的遗传毒性杂质不超过TTC？应考虑各种烷基或芳基磺酸酯杂质累积的风险。

遗传毒性杂质控制指导原则遗传毒性杂质控制指导原则用于指导药物遗传毒性杂质的危害评估、分类、定性和限值制定，以控制药物中遗传毒性杂质潜在的致癌风险。

为药品标准制修订，上市药品安全性再评价提供参考。

一、总则遗传毒性（Genotoxcity）是指遗传物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，又称为基因毒性。

遗传毒性杂质（Genotoxic Impurities，GTIs）是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其它类型的无致突变性杂质。

其主要来源于原料药的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。

致突变性杂质（Mutagenic Impurities）指在较低水平时也有可能直接引起DNA损伤，导致DNA突变，从而可能引发癌症的遗传毒性杂质。

本指导原则主要关注致突变机制的遗传毒性杂质，非致突变机制的遗传毒性杂质在杂质水平的剂量下，一般可忽略其致癌风险。

药品生产、药品标准提高及上市药品再评价过程中发现杂质后，可按本指导原则进行风险评估，确定其是否为遗传毒性杂质，尤其是致突变性杂质。

如果一个杂质被鉴定为具有潜在的致癌风险，应制定相应的限值。

在制订可忽略致癌风险的杂质限值时，应进一步分析生产工艺，兼顾安全性和质量风险管理成本两方面的因素，综合考虑制定合适的限值。

本指导原则包括危害评估方法、可接受摄入量计算方法和限值制定方法。

本指导原则中描述的对杂质潜在致突变性的评估方法不适用于以下类型的原料药和制剂：生物/生物技术制品、肽类、寡核苷酸、放射性药物、发酵产品、中药和动物或植物来源的粗制品。

也不适用于已上市药物中使用的辅料、调味剂、着色剂和香料，以及与药物包材相关的可浸出物。

本指导原则中对杂质潜在致突变性的评估方法不适用于用于晚期癌症适应症的原料药和制剂，以及用于其它适应症但本身在治疗剂量下就具有遗传毒性，且预计可能与癌症风险增加有关的原料药。

在这些情况下，致突变性杂质不会显著增加原料药的致癌风险。

遗传毒性杂质控制指导原则遗传毒性杂质控制指导原则用于指导药物遗传毒性杂质的危害评估、分类、定性和限值制定，以控制药物中遗传毒性杂质潜在的致癌风险。

为药品标准制修订，上市药品安全性再评价提供参考。

一、总则遗传毒性（Genotoxcity）是指遗传物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，又称为基因毒性。

遗传毒性杂质（Genotoxic Impurities，GTIs）是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其它类型的无致突变性杂质。

其主要来源于原料药的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。

致突变性杂质（Mutagenic Impurities）指在较低水平时也有可能直接引起DNA损伤，导致DNA突变，从而可能引发癌症的遗传毒性杂质。

本指导原则主要关注致突变机制的遗传毒性杂质，非致突变机制的遗传毒性杂质在杂质水平的剂量下，一般可忽略其致癌风险。

药品生产、药品标准提高及上市药品再评价过程中发现杂质后，可按本指导原则进行风险评估，确定其是否为遗传毒性杂质，尤其是致突变性杂质。

如果一个杂质被鉴定为具有潜在的致癌风险，应制定相应的限值。

在制订可忽略致癌风险的杂质限值时，应进一步分析生产工艺，兼顾安全性和质量风险管理成本两方面的因素，综合考虑制定合适的限值。

本指导原则包括危害评估方法、可接受摄入量计算方法和限值制定方法。

本指导原则中描述的对杂质潜在致突变性的评估方法不适用于以下类型的原料药和制剂：生物/生物技术制品、肽类、寡核苷酸、放射性药物、发酵产品、中药和动物或植物来源的粗制品。

也不适用于已上市药物中使用的辅料、调味剂、着色剂和香料，以及与药物包材相关的可浸出物。

本指导原则中对杂质潜在致突变性的评估方法不适用于用于晚期癌症适应症的原料药和制剂，以及用于其它适应症但本身在治疗剂量下就具有遗传毒性，且预计可能与癌症风险增加有关的原料药。

在这些情况下，致突变性杂质不会显著增加原料药的致癌风险。