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ｌＯ×ＴａｑＢｕｆｆｅｒｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各１０ｍＭ）ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（２Ｕ／ｕ１）ｅＤＮＡ模板ＩＦＮ—ＦＩ（１０ｕＭ）ＩＦＮ－ＲＩ（１０ｕＭ）５ｕｌｌｕｌｌｕｌ２ｕｌ２ｕｌ２ｕｌ加水至５０ｕｌ上下游特异性引物分别为：ＩＦＮ—Ｆｌ：５’一ＡＡＧＧＡＡＡ：ＩｂＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＪ气Ｔ－３’ＩＦＮ－Ｒｌ：５７．１ＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣＣＴＣ．３（２）反应条件９４℃９４℃５５℃７２℃７２℃，ｍｉｎ．３０ｓｅｅ．３０ｓｅｅ．１ｍｉｎ８ｒａｉｎ阿面］Ｉ．．．．．．．．．．．．．．．．．一反应结束后，取ＰＣＲ反应液８ｕｌ进行琼脂糖凝胶电泳，确认ＰＣＲ反应产物。
２．结果与讨论对提取的３组模板做ＲＴ－ＰＣＲ，分析图如下７５０ｂｐ—・——一５００ｂｐ＿－２５０ｂｔ口——・－－一７５０ｂｖ。
‘—。
一Ｓ００ｂｐ。
‘——一２５０ｂｐ—＿。
——一图５２组诱导组ＰＴ－ＰＣＲ产物电泳图，组织依次为肝脏、脑、头肾、心肌、脾脏和鳃上部分为ｐｏｌｙＩ：Ｃ诱导组：下部分为草鱼出血病病毒诱导组ｒ＿ｌＩＪＨｉｎｄⅢＸｈｏＩＧｃＩＦＮ图６酵母胞内表达载体ＩＦＮ—ｐＹＥＳ２的构建２．１．２ＧｅＩＦＮ基因酵母转化载体的鉴定２．１．２．１目的基因（ＧｃｌＦＮ基因）的ＰＣＲ扩增采用引物ｐＹＥＳ２－－Ｆ和ｐＹＥＳ２－－Ｒ，以质粒［ＦＮ－－ｐＹＥＳ２为模板，进行ＰＣＲ扩增，同时以质粒ｐＹＥＳ２为阴性对照。
若以ｐＹＥＳ２空质粒为模板，有２００ｂｐ的条带；在插入ＧｃｌＦＮ基因后，则出现７６０ｂｐ的条带。
ＰＣＲ扩增如图７所示：＂ｏｂＰ—－－｝图７目的基因的菌落ＰＣＲ鉴定图ｖＩ如图所示，我们挑取的大多数为重组子，证明载体构建过程中重组效率较高。
２．１．２．２含ＧｃＩＦＮ基因的质粒ＩＦＮ－－ｐＹＥＳ２酶切鉴定用ＨｉｎｄＩＩＩ和ＸｈｏＩ将质粒ＩＦＮ－－ｐＹＥＳ２进行双酶切反应，酶切片断大小约为５５０ｂｐ与预期大小相同。
ｓＳ０ｂｐ—÷图８质粒ＩＦＮ－－ｐＹＥＳ２经ＨｉｎｄＨＩ和ＸｈｏＩ双酶切鉴定图２．２ＧｅＩＦＮ基因转化酿酒酵母ＩＮＶＳＣｌ菌株２．２．１酵母电转化将ｐＹＥＳ２空质粒以及ｐＹＥＳ２－－ＩＦＮ重组质粒分别电转酵母ＩＮＶＳＣｌ，３０。
武汉轻工大学毕业论文2013届毕业论文题目：草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定与中西药物敏感性分析姓名蔡庐山学号090702228院（系）动物科学与营养工程学院专业水产养殖学年级2009级指导教师刘洪明武汉轻工大学制2013 年05 月目录摘要 (1)1、前言 (2)2、材料与方法 (9)2.1细菌分离 (9)2.2病原菌的生理生化鉴定 (9)2.3待测细菌WH125的分子生物学鉴定 (11)2.4 细菌的药物敏感性测定 (12)3、结果 (13)3.1病鱼症状 (13)3.2病原菌的生理生化鉴定 (13)3.3分子生物学鉴定结果 (16)3.4菌种判定 (18)3.5药敏试验结果 (18)4、讨论 (19)参考文献 (22)草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定摘要本文从实验室患病草鱼身上分离得到一株致病菌，通过对细菌分离培养与纯培养、形态与菌落特征、理化特性等表观分类学指征鉴定的测定；同时择代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定，测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树；以表型性状鉴定结果，及细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属判定。
结果表明所检鱼病的致病菌为草鱼烂尾病病原细菌Y2。
同时还对该病菌进行了药物敏感性测定，明确了该菌对各种中西药的敏感性，为治疗由草鱼烂尾病病原细菌Y2所引起的水产动物疾病提供了理论基础。
关键词：草鱼烂尾病病原细菌Y216S rRNA 药物敏感性Isolation and identification of pathogenic bacteria Y2 of Grasscarp tail rotAbstractIn this paper, a pathogenic bacteria strains were isolated from laboratory sick grass carp. Cultivation of bacteria and pure culture, morphology and colony characteristics, physical and chemical properties such as apparent taxonomical indications identified measurement. In addition, molecular identification of analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene were applied, the 16S rRNA gene were sequenced and the phylogenetic tree representing genetic relatedness among the isolates and publicly available 16S rRNA gene sequence from GenBank database was constructed; the results showed that the isolates were Aeromonas veronii. The Antimicrobial susceptibilities of selected strains to antimicrobial agents were determined,Results show that the pathogenic bacteria for grass carp fish disease are lousy tail disease pathogen bacteria Y2, and the sensitive agents were selected in this study, For treatment of grass carp lousy tail disease caused by pathogenic bacteria Y2aquatic animal diseases provides a theoretical basis Keywords:Grass carp lousy tail disease pathogen bacteria Y2 16S rRNA Antimicrobial susceptibility test (AST)1前言烂尾病是一种常见病，无论是在养鱼池、水族箱、网箱、网围、网栏、水库中养殖的草鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼、鳗鲡、暗纹东方鲀、鲤、鲫等多种淡水鱼都经常可以发生。
2019.102018年笔者对泗阳县运河北片草鱼养殖进行了疫病监测与流行病学调查，并对具有典型症状的发病草鱼进行了病原菌株分离和鉴定，将鉴定出的嗜水气单胞菌进行了常用抗菌药物敏感性试验，旨在为嗜水气单胞菌病原引起的草鱼细菌性疾病有效检验与防控及相对应的有效治疗提供依据。
一、材料与方法1.试验材料(1)2018年4－10月在草鱼养殖场的不同发病塘口，选取具有典型发病症状草鱼进行分离，分离部位为血液，采样时间、地点、症状、API－20E 生化反应编号、菌株种类详细情况见表1。
(2)营养肉汤、营养琼脂、TCBS 琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京陆桥。
肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(英文名API 20E)购于梅里埃诊断产品(上海嘉合)有限公司。
动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司。
2.试验方法细菌分离鉴定和菌株对药物感受性试验在县水产站病害检测无菌操作室内进行。
试验操作遵循《鱼类细菌病检疫技术规程(SC/T 7201.1－2006、SC/T 7201.1－2006)》和梅里埃API－20E 试剂条鉴定及南京菲恩动物用药敏分析试剂板操作流程。
二、试验结果1.嗜水气单胞菌分离及形态特征观察从病鱼血液分离到的嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，28℃培养18～24小时，形成圆形光滑、边缘整齐、湿润、微凸、微白色菌落，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、湿润，周围出现清晰的溶蛋白透明圈，革兰氏染色阴性，油镜视野下短杆状。
2.嗜水气单胞菌的氧化酶试验和生理生化鉴定对分离的细菌进行生理生化检测，结果判定为嗜水气单胞菌的具体生理生化特征见表2。
依据《伯杰氏鉴定细菌学手册》(1994)“气单胞菌属细表1菌株分离清单汇总442019.10表312株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)对照毫克/升菌种间特征鉴别表”对分离到的嗜水气单胞菌进行Ⅰ和Ⅱ分类，并分别命名为Ⅰ－1、Ⅰ－2、Ⅰ－3和Ⅱ－1、Ⅱ－2、Ⅱ－3、Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅱ－6、Ⅱ－7、Ⅱ－8、Ⅱ－9。
文章编号押2096-4730穴2020雪05-0409-06普通冻藏温度下金枪鱼生鱼片中特定腐败菌筛选及货架期预测模型研究马锦涛,霍健聪(浙江海洋大学食品与药学学院,浙江舟山316022)摘要：以大眼金枪鱼赤身部位鱼肉为原料,研究了不同冻藏温度(-18、-10和0℃)对生鱼片的挥发性盐基氮(TVBN)、菌落总数及色度等品质指标的影响,通过对金枪鱼生鱼片中微生物的纯化分离鉴定,完成了金枪鱼生鱼片货架期模型的构建。
结果表明:假单胞菌属微生物是金枪鱼生鱼片的主要腐败微生物;构建的Gompertz模型能够很好拟合-18~0℃温度下生鱼片中微生物数量状态,为金枪鱼生鱼片在普通冻藏温度下货架期的确定提供预测手段。
关键词：金枪鱼生鱼片;普通冻藏;腐败菌;货架期中图分类号：TS254.1文献标识码：AStudy on Special Putrid Bacteria during Common Cold Storage of and Predictive Model of Shelf-life Tuna SashimiMA Jin-tao,HUO Jian-cong(School of Food and Pharmacy of Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China)Abstract:This paper studied the changes of some quality characters,including total number of bacterial colony,chroma and TVBN under the common condition of0℃,-10℃,-18℃with Tuna Sashimi as material. The purification of special bacteria and the predictive model of shelf-life of sashimi were also studied.The re-sults showed that the main microorganism was pseudomonas,and the model of Gompertz was well constant with the total number of bacterial colony under the condition of-18-0℃in sashimi.The model fixed by experi-ment could predict precisely the shelf-life of sashimi in-18-0℃.Key words:tuna sashimi;common cold storage;special putrid bacteria;model of shelf-life金枪鱼(tuna)是一种大型远洋性重要商品食用鱼,金枪鱼肉色鲜红,生活海域水体高度净洁,使其成为一类肉味鲜美,营养丰富,食用安全性高的高品质海水鱼,被国际营养学会列为世界三大营养鱼类之一[1-3]。
草鱼鱼整片中热杀索丝菌的生长预测模型作者：宋志强刘超群侯温甫来源：《肉类研究》2013年第05期摘要：为了研究热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）的生长动态，建立了5、10、15、20℃四种不同温度下草鱼鱼整片中的热杀索丝菌的预测模型。
利用Gompertz方程获得热杀索丝菌的生长预测值，根据预测值和恒定温度下的活菌数，绘制实际和预测生长曲线，曲线重合度较好。
利用平方根模型描述温度对最大比生长速率和延滞期的影响。
通过计算准确因子和偏差因子对一级模型进行了验证，结果准确因子AF值均在1左右，偏差因子BF值在0.7～1.1之间。
利用F统计量对二级模型进行验证，得到的P值小于0.05。
得到的预测模型能很好的预测热杀索丝菌在草鱼鱼整片中的生长动态，为水产品的预报模型在实际生产和流通过程中的提供一定参考。
关键词：鱼整片；热杀索丝菌；预测模型Establishment and Validation of Predictive Model of Brochothrix thermosphacta from Grass Carp Fish FilletSONG Zhi-qiang，LIU Chao-qun，HOU Wen-fu*，（College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）Abstract：The present work aimed to characterize the growth of Brochothrix thermosphacta and establish predictive models in grass carp fish fillet at different temperatures （5， 10， 15 ℃ and20 ℃）. Predictive growth curves were fitted by using Gompertz model， which showed good coincidence with the actual ones. The relationships between temperatu re and μmax or Lag time were well described by Belehradek model. The developed first-order models were validated by calculating average accuracy factors （AF） and bias factors （BF）， and both were close to 1 and ranged between 0.7 and 1.1， respectively. F statistical analysis was used to validate the second-order models established in this study， and P values smaller than were obtained. Accordingly， the proposed predictive models could accurately describe the growth of Brochothrix thermosphacta in grass carp fish fillet.Key words：fish fillet；Brochothrix thermosphacta；prediction model中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）05-0001-04草鱼（grass carp）属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、草鱼属。
草鱼俗称鲩、黑青鱼等。
栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域，是中国淡水养殖的四大家鱼之一。
草鱼生长快、个体大、肉质鲜嫩、味鲜美，而且有暖胃和中之功效，所以被人们所喜爱。
随着人们生活水平的提高，人们对鱼类鲜度的要求不断提高。
但冷鲜鱼肉极易腐败，为实际生产和流通过程增加难度。
腐败的原因主要是自我分解、细菌生长和新陈代谢过程中导致了不良风味组分的形成、酯类化学氧化等，其中影响鱼类品质的最主要因素是微生物的活动[1]。
但水产品中所含的微生物只有部分微生物参与腐败过程[2]。
这些产生腐败臭味和代谢产物的微生物，就是该产品的特定腐败菌[3]。
所以建立一种快速评估和预测冷鲜鱼肉品质的方法尤为重要。
Dalgaard认为目前最为有效的方法就是特定腐败菌的生长动力学模型的建立。
虽然目前已有报道不同来源[4-7]不同种类微生物[7-10]的生长预测模型，但是国内外有关冷鲜鱼肉中微生物生长预测模型的研究很少。
相关研究表明，冷鲜鱼肉在冷藏过程中的主要腐败菌是热杀索丝菌[11-15]。
本实验以新鲜草鱼鱼整片中热杀索丝菌为研究对象，研究其在5～20℃条件下的生长情况，应用修正的Gompertz函数和平方根模型，建立其生长预测模型，为微生物预报模型在冷鲜鱼肉实际生产和流通过程中的应用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 样品预处理新鲜草鱼市购，草鱼即杀后，进行精细分割制成草鱼鱼整片产品，置于托盘中并用保鲜膜封口，然后分别置于5、10、15、20℃四个恒定温度下贮藏。
所有操作均在经清洗、臭氧消毒后的良好卫生条件下进行。
1.2 培养基与试剂配制STAA琼脂培养基青岛高科技园海博生物技术有限公司；氯化钠（优级纯）国药集团化学试剂有限公司。
STAA琼脂培养基使用前处理：准确称取STAA琼脂培养基7.4g、甘油3.0g、蒸馏水200mL，摇匀后高压灭菌待用，使用前加入STAA添加剂；氯化钠溶液：取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中。
1.3 仪器与设备SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；BMJ-160霉菌培养箱、立式压力蒸汽灭菌器（灭菌锅）上海博讯实业有限医疗设备厂；MIR-154低温恒温培养箱三洋电机株式会社；DNP-9082型电热恒温培养箱上海精宏试验设备有限公司；HPX-9028 MBE电热恒温培养箱、DHP-9082型电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司； HBM-400系列样品均质器天津市恒奥科技发展有限公司。
1.4 微生物培养将贮藏在5、10、15、20℃条件下的样品分别剪取25g，剪碎后放入无菌均质袋中，加入225mL生理盐水，放入均质器中，以7次/s的速度拍击2min。
取出均质袋，将均质袋内的样液倒入烧杯中，吸取1mL进行稀释，选择3个合适的稀释梯度，每个稀释梯度做3个平行。
将STAA添加剂加到培养基中摇匀，用STAA选择性培养基倾注平板，放冷凝固。
凝固后放在30℃培养箱内倒置培养，48h后进行菌落计数[16-17]，此为第0天。
5℃和10℃的样品每隔24h 测定1次，15℃和20℃的样品每隔12h测定一次。
1.5 模型的拟合与验证一级模型和二级模型的拟合与验证均参考刘超群等[18]的方法。
2 结果与分析2.1 一级模型的拟合及其验证2.2.1 一级模型的拟合应用SAS 9.1统计软件，将不同温度下获得的热杀索丝菌生长数据，用Gompertz模型拟合其生长动态。
表1为不同温度下热杀索丝菌的的生长动力学模型和参数。
表 1 不同温度下热杀索丝菌的生长动力学模型和参数Table 1 Growth kinetics model and parameters of Brochothrix thermosphacta at different temperatures温度/℃热杀索丝菌生长动力学模型 U LPD Nmax R2 P值5 lg（Nt）=3.348+4.092exp{-exp[-0.5876（t-2.8805）]} 0.8845 1.1787 7.3829±0.0369 0.995810 lg（Nt）=3.523+4.670exp{-exp[-0.9088（t-2.1955）]} 1.5613 1.0951 7.7782±0.04090.996915 lg（Nt）=3.527+4.339exp{-exp[-1.6271（t-1.2449）]} 2.5970 0.6303 7.7188±0.02910.996620 lg（Nt）=3.447+4.392exp{-exp[-2.8989（t-0.8377）]} 4.6836 0.4927 7.8173±0.05010.9970注：Nmax为稳定期的最大菌数；*a=0.05；U为最大比生长速率；LPD为迟滞期；t为时间；Nt为时间为t时的菌落数。
由表1可以看出，判定系数R2的值均在0.99以上，表明Gompertz模型能很好描述不同温度下热杀索丝菌的生长。
同时P值均小于0.0001，所以在显著性差异上也说明这一结论。
利用Gompertz模型求得的热杀索丝菌生长动力学参数显示：从5℃升高至20℃后，最大比生长速率从0.8845d-1升高至4.6836d-1。
由表1可知，当温度超过5℃后最大比生长速率快速增长，所以高温可引起鲜切鱼肉快速腐败。
有相关文献表明，微生物的延滞期随着温度增加而缩短[19]，本实验延滞期的变化也证实这一结论。
根据热杀索丝菌在恒定温度下的活菌计数结果和利用Gompertz模型求得的预测结果，绘制的5、10、15、20℃温度下实际值和预测值的时间-菌落数曲线，得到不同温度条件下热杀索丝菌的生长趋势，结果见图1。
A. 贮藏温度5℃B. 贮藏温度10℃C. 贮藏温度15℃D. 贮藏温度20℃图 1 不同温度下热杀索丝菌生长的预测值与实际值Fig.1 Predicted and observed growth curves of Brochothrix thermosphacta at different temperatures从图1可以看出，温度对热杀索丝菌的生长速率有较大的影响，温度越高，热杀索丝菌生长速度越快。
贮藏在5℃条件下的样品从第0～8天增长较为缓慢；贮藏在10℃的样品第1天后热杀索丝菌呈快速增长趋势，到第3天趋于平缓，可能已经到达稳定期；贮藏在15℃条件下的热杀索丝菌从第0.5天后呈极速增长趋势；贮藏在20℃的样品也在第0.5天后呈极速增长，到第2天达到最大值，之后逐渐趋于平缓并呈下降趋势，说明已经到达衰亡期。
通过直观判断利用Gompertz方程获得热杀索丝菌的生长预测曲线与实际生长曲线重合的较好。
