大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol

大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol一、大鼠神经干细胞分离和传代步骤手术前准备1. 水浴锅温度调至37°C。

2.组织解离液置95%O2 5%CO2 培养箱中10min。

3. 用95%乙醇消毒解剖区。

4. 用消毒溶液消毒解剖器械（戊二醛，后用无菌dH2O 冲洗，浸泡在95%乙醇中）。

5.在3 个60 ×15 mm 皿中各加3ml 的组织解离液。

提示：除无菌显微解剖器材外，还要三套消毒器械，分别用于剥离皮肤、颅骨和脑，减少用手污染的机会。

消毒过的解剖器械可以浸泡在无菌组织剥离液中，以避免乙醇接触组织。

分离脑组织6.新生SD大鼠(出生48h内)直接断头。

7.剃去头顶的毛发。

8.用浸泡过聚维酮碘消毒的纱布擦洗头部并且去除松散的毛发。

9.用泡过95％乙醇消毒纱布擦洗头部。

10.用手术刀片延中线全长切开头皮。

11.掀开皮肤显现出头盖骨。

12.从双耳后切开头皮暴露头盖骨侧面。

13.用小剪刀在两边切开头盖骨（打开头盖骨上部，避免损伤脑组织）。

14.用镊子掀开头盖骨。

注意：不能用表面有乙醇的解剖工具接触脑组织。

乙醇能使组织固定。

15.用弯镊在脑底部滑动以切断连接脑底部的脊髓、血管和颅神经。

提示：用弯镊时轻微向下用力抵住脑下面的颅底。

来回滑动松动脑组织。

16.取脑组织，D-Hanks液充分漂洗后.17.用同一个弯镊将脑移到盛有解离液的60mm 皿中。

18.剥离大脑表面的脑膜，冲洗干净，把脑放入第二个盛有解离液的60mm 皿中。

提示：在解剖显微镜下很容易剥离脑膜。

19.解剖镜下，沿中线切开大脑，精细镊分离海马。

20.将分离组织放置于第三个盛有解离液的60mm 皿中。

21.用10 号弯头手术刀将组织切成小块（约1 mm3）分散脑组织22.将盛有小块组织的培养皿移到超净台，然后用移液管将组织块移到5ml 的圆底聚丙烯管中。

23.250g 离心1min。

24.弃上清，加入酶混合液（1ml）。

25.将试管水浴至少40min，每隔20 分钟用移液管适当吹打。

26. 250g 离心5min，弃上清。

27.加入4ml 蛋白酶抑制剂。

28.用移液管吹打10 次以分散沉淀，注意尽量别产生气泡。

29. 水浴10min。

30. 500g 离心5min，弃上清。

31.用0.5ml SFM 重悬细胞，充分吹打以产生单细胞悬液。

提示：建议用火焰钝化的小抢头制备单细胞悬液。

接种细胞32. 用血细胞计数器计数并调整活细胞浓度。

台盼兰染色排除死细胞。

提示：接种10-15 cells/ul有利于建立单个神经球的培养。

如果不做克隆分析且想获得更多神经球，可提高接种密度（如50-100 cells/ul）。

高密度接种可加快神经球的形成，并缩短首次传代时间间隔。

用血细胞计数器和台盼兰测定细胞活性在24 孔板每孔中加入0.5ml 含细胞SFM。

33. 在24 孔板每孔中加入0.5ml 含细胞SFM。

34. 37°95% air 5% CO2 培养。

神经球的传代提示：在合并培养物前应检查每个孔是否污染，特别是在第一次传代时。

严重污染使PH 值降低，培养液颜色明显改变（变黄）。

轻微污染也较常见，无法通过观察培养液颜色判断，需在相差显微镜下观察。

如果你忽略了一个污染孔，下一代的所有孔都会被污染！1.将所有神经球和培养液移到15ml 锥形管。

2. 200g 离心5min。

3.弃上清，加入2ml TrypLETM。

4.用移液管混合神经球和TrypLETM。

5. 37°水浴20min。

6. 500g 离心5min。

7.弃上清，加0.5ml SFM 重悬细胞。

8.用移液管吹打（60－70 次）提示：吹打过程中避免产生气泡。

过多气泡会降低活细胞数并增加污染机会。

9. 用台盼兰计数细胞密度，排除死细胞，按所需密度接种到新24 孔板。

95% air 5% CO2 37°培养。

提示：神经球传代的最佳时间常根据试验需要和时间安排确定。

如果平均每孔至少25 个神经球，那么可以传2 个板。

如果有50 个神经球，那么很容易从原24 孔板传3 个板。

镜台测微尺可标准化相差显微镜的目镜焦距。

便于快速确定神经球的大小。

神经球的冻存和复苏1. 将含有神经球的培养液从24 孔板移入15ml 圆锥管。

2. 200g 离心5min。

3. 弃上清，用10ml 含15％DMSO 的SFM（不含EGF 和FGF）重悬细胞。

4.用移液管轻轻混匀，分装1.5ml 每管（聚丙烯冷冻管）。

5. －80°冰箱过夜。

6. 次日晨转移至液氮罐保存。

提示：如果不能使用液氮，神经球可以在－80°保存几周。

活神经球数量会随－80°存放时间延长而减少。

7.准备复苏神经球，将冷冻管从液氮中取出，在超净台内回复至室温。

8.将冷冻管内容物转入含有10ml SFM 的15ml 圆锥管中。

9. 200g 离心5min，弃上清。

10.用4ml SFM 轻轻混匀。

11. 按每孔0.5ml 种8 个孔（24 孔板），37°95% air 5% CO2 条件下培养。

提示：小神经球比大神经球（直径大于100um）更易复苏成活。

在组织培养基中，神经球复苏成活率很低（小于20％）。

建议每孔至少种50－100 个神经球。

通过提高冷冻神经球密度或在冷冻液中加入20％胎牛血清可提高复苏成活率。

但要牢记胎牛血清可以诱导分化。

二、大鼠神经干细胞增殖能力检测将BrdU溶于SFM 培养基，过滤除菌后加入神经球形成后分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。

三、大鼠神经干细胞分化能力检测选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的SFM 培养基)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin 免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。

另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、免疫细胞化学染色。

注：1) TuJ1是一种被认为参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白。

2) GFAP是神经系统星形胶质细胞活化的标志物。

3)Nestin是巢蛋白，是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物；可能对神经元的分化有作用。

Nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止。

为神经干细胞的特征性标志物。

4)神经球转入含血清培养液的24孔板, 24 h 后大部分贴壁; 可见有单个细胞从神经球内游出,贴壁生长,分散存在,可向四周发出放射状条索,与周围细胞互相联接。

2 d后突起不断增粗和伸长,形态不规则; 5 d左右克隆基本分化成形态不一, 分散成突起多少不等的三种类型细胞: ①细胞体呈圆形或椭圆型、突起少但很长、折光性强的神经元样细胞, TuJ1免疫染色呈阳性反应,表明神经干细胞已部分分化为神经元; ②胞体较大、突起较多较粗、细胞数量较多的星形胶质样细胞,其折光性弱, GFAP免疫染色呈阳性反应;③细胞胞体最小,数量也最少,具有多个细胞突起,突起较短、较细、且不断分枝,考虑为少突胶质细胞样细胞。

NSCs由BrdU掺入后,分化培养的细胞中大多数显微镜下可见BrdU免疫染色阳性。

表一、所需仪器列表仪器名称数量CO2 1解剖显微镜 1水浴锅 1显微分离器材4套手术刀片1套生物安全柜 1台式离心机 1相差显微镜 1表二、所需耗材列表耗材名称数量公司货号报价（元）60×15 mm 组织培养皿40个Falcon cat. no. 353002122.824孔细胞培养板10个Falcon cat. no. 3530471625 ml 聚丙烯圆底管20个Falcon cat. no. 352063137.415 ml 聚丙烯圆椎管20个Falcon cat. no. 352095174.650 ml 聚丙烯圆椎管10个Falcon cat. no. 352070114.8表三、组织解离液配方组织解离液2.0M NaCl 15.5ml1.0M KCl 1.25ml1.0M MgCl2 0.8ml155mM NaHCO3 41.9ml1.0M Glucose2.5ml108mM CaCl2 0.23ml蒸馏水188.0ml此分离液在4度过滤和储存在使用之前在95% O2和5% co2中充气10分钟。

表四、消化酶混合液配方消化酶混合液报价（元）Trypsin(sigma. cat.no.T5266) 0.04g 534.69Type-1-S Hyaluronidase(sigma. cat.no.H3506) 0.02g 1,075.23 Kynurenic acid(sigma. cat.no.K3375) 0.004g 1,387.62此消化酶溶液溶解于30ML组织分离液中，并用0.22um的膜过滤，分装成1ML，储存于-20度冰箱。

表五、无血清培养液配方无血清培养液（SFM 100ml）报价（元）DMEM/F12(Invitrogen cat. no. 11330-032)94.3ml 404 30% Glucose 2.0 ml1.0M Hepes Buffer 0.5ml孕酮（1000X） (Sigma cat. no. P-8783)0.1mlPutrescine（100X）(Sigma cat. no. P5780) 1.0ml 286.65 B27 Growth supplement (Invitrogen cat. no. 17504-044) 2.0 ml 1190 EGF(Sigma cat. no. E4127)20ul 1728.09 FGF(Sigma cat. no. F0291)20ul 1,291.68 TSITSS(Cyagen cat. no. ITSS-10201-10) 100ul 490 肝素(Sigma cat. no. H3149)7.32ul 4,829.76新开封的DMEM/F12（500ml）培养基中需要增加8ML 15%的NaHCO3溶液并储存于4度表六、抗体和试剂列表抗体名称数量公司货号报价（元）Nestin 1Abcam-ab931574,189TuJ1 1Abcam-ab145454,595GFAP 1Abcam-ab72604,443Brdu 1Abcam-ab63264,443 TrypLETM express 1 Invitrogen-12604-021 605BrdU Labeling Reagent 1Invitrogen- 00-0103713实验风险：1.神经球的形成：此实验即使严格按照protocol来操作，也会伴随着很多不确定的风险。