各种显微技术——制片——染色

微生物制片显微观察及检测技术微生物是一类不能看见的生物体，它们很小、很微弱。

为了观察和检测微生物，科学家们开发出了多种显微观察和检测技术。

本文将介绍一些常用的微生物制片技术及显微观察和检测技术。

微生物制片技术主要是将微生物样本制备成薄片以便进行显微观察。

常用的制片技术包括固定、包埋和切片。

固定是将微生物样本中的细胞或细菌固定在载玻片上，常用的方法有热固定、酒精固定和甲醛固定等。

包埋是将固定的微生物样本包裹在固体介质中，通常用于切片前的处理，常用的方法有冰冻包埋和石蜡包埋。

切片是将包埋的微生物样本切成薄片，常用的方法有冷冻切片和石蜡切片。

显微观察技术是利用显微镜观察微生物样本的细节和特征。

常用的显微观察技术包括光学显微镜和电子显微镜。

光学显微镜是利用光线通过样本并经过透镜放大观察，主要适用于观察细菌、真菌、原生动物等较大的微生物。

电子显微镜是利用电子束通过样本并经过电磁透镜放大观察，主要适用于观察细菌、病毒等较小的微生物。

电子显微镜分为扫描电子显微镜和透射电子显微镜两种，扫描电子显微镜适用于表面观察，透射电子显微镜适用于内部观察。

检测技术是用于检测微生物样本中的特定组分或特定物质。

常用的检测技术有免疫荧光检测法、酶联免疫吸附检测法和聚合酶链反应检测法等。

免疫荧光检测法是利用荧光染料标记的抗体与特定抗原结合形成复合物，通过显微镜观察荧光信号来检测微生物样本。

酶联免疫吸附检测法是利用酶标记的抗体与特定抗原结合形成复合物，通过显色反应来检测微生物样本。

聚合酶链反应检测法是利用特定的引物和酶来扩增微生物样本中的特定基因片段，通过电泳分析来检测扩增产物。

除了上述的微生物制片技术、显微观察和检测技术，还有一些其他的辅助技术可以提高微生物观察和检测的效果。

例如，染色技术可以通过染色一些特定物质来突出显示微生物样本中的细节和结构。

常用的染色技术有普鲁士蓝染色、格拉姆染色和伊汀染色等。

荧光标记技术可以通过标记荧光染料来突出显示微生物样本中的特定组分。

植物制片的染色及显微化学鉴定方法植物制片是植物解剖学研究的基础，主要包括了样品的采集、处理、包埋和切片等步骤。

制片的质量直接影响着后续染色和显微化学鉴定结果的准确性和可靠性。

以下是植物制片的一般步骤：1.采集样品：根据研究需要，采集符合实验要求的植物部件，如叶片、茎、花粉等。

2.处理样品：对采集到的植物样品进行初步处理，如去除杂质、保持新鲜等。

3.包埋样品：将处理后的样品进行包埋，使用适宜的包埋剂，如石腊、低熔点石蜡等。

4. 切片样品：将包埋好的样品进行切片，使用微tome等工具进行切割，制备出适当厚度的切片。

一旦制片完成后，接下来需要进行染色和显微化学鉴定。

染色方法可以增强显微镜下的观察效果，常见的染色方法包括常规染色和特殊染色。

1.常规染色方法：最常用的染色方法是使用苏丹精、碘红等生物染料，用于染色细胞壁、细胞核等常见组织结构。

常规染色方法可以提供植物组织的基本信息。

2.特殊染色方法：特殊染色方法主要用于特定的组织结构或化学物质的染色。

如使用苏木精-伊红染色对木质部和木质纤维进行染色，使用布氏染色对淀粉进行染色等。

显微化学鉴定方法是通过对制片样品进行特定试剂处理，以便于观察和检测特定化学物质的存在与否。

常用的显微化学鉴定方法包括：1.反应性染色：使用生化试剂或化学试剂与组织中的化学物质进行反应，产生特定的颜色或沉淀。

如使用碘酸钾溶液对淀粉进行碘反应形成蓝色物质。

2.酶反应：通过加入适当的酶试剂，使显色底物发生氧化还原反应，形成显色产物。

如使用过氧化氢试剂对过氧化物酶进行酶反应产生氧气和水。

3.化学反应：使用特定化学试剂，对特定化学物质进行识别。

如使用铁氰化钾试剂对根际紧矿质进行化学反应，生成蓝色的沉淀。

植物制片的染色及显微化学鉴定方法，通过染色和试剂处理等手段，可以使植物组织结构变得更加清晰和可见，从而更好地研究和识别植物的组织结构、化学成分和功能。

这些方法对于植物科学研究和植物学教学有着重要价值。

形态学研究技术一、显微镜介绍（PPT 3~18）二、固定（PPT 19~20）三、组织切片（PPT 21~25）四、组织染色（PPT 26~30）五、免疫组织化学/免疫细胞化学（PPT 31~56）六、荧光染料（PPT 57~65）七、定量分析（PPT 66~77）八、应用（PPT 78~88）九、电子显微镜（PPT 89~102）一、显微镜的介绍★四种光学显微镜：亮视野；相差；微分干涉相差；暗视野（用的非常少，比如原位杂交中同位素标记的点是亮的，用暗视野显微镜在暗背景下看到的亮点会更清楚）★倒置显微镜：可操作空间大，可以做电生理等实验，最常用的观察方法是相差，由于此方法不需要染色，因此是观察活细胞的理想方法，分辨率不如正置组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，倒置显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。

只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。

目镜的作用与放大镜一样。

所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

★体视显微镜：视野大可作精细解剖和/或胚胎，分辨率不如正置1．双目镜筒中的左右两光束不是平行的，而是具有一定的夹角——体视角（一般为12度---15度），因此成像具有三维立体感；2．像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故；3．虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长4．焦深大，便于观察被检物体的全层。

5．视场直径大。

★荧光显微镜：光源是汞灯,有滤镜。

固定后的细胞、组织用荧光染料；活体细胞用荧光蛋白。

荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.光源为汞灯紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，以保护人目。

染色技术由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。

所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。

但是，任何一项技术都不是完美无缺的。

染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。

包括四部分：一、染色的基本原理二、染料的种类和选择三、制片和染色的基本程序四、染色方法一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。

物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。

化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。

酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。

如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。

但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。

相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。

细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。

因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。

所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。

影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。

此外，培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。

二、染料的种类和选择染料分为天然染料和人工染料两种。

天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。

中药粉末显微鉴别技术中药粉末显微鉴别技术第一取样、制片、染色节一、取样取样的代表性直接影响到结果的判断准确，因此必须重视取样的各个环节。

（一）对照品对照品粉末是检定供试品的参照物，其制备是显微鉴别的先决条件。

有经验者，可自取标本，鉴定后制作，或购买药材经品种基原鉴定。

还应注意有些药材的显微特征受生长年限及环境的影响，会产生一定的波动，所以对于供试品的产地、采收期、加工方法等也应当认真记录。

（二）供试品中药材原药材应注意基原、产地、规格的完整性、清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，并详细记录。

（1）从同批药材包件中抽取有代表性的检定用样品。

（2）对破碎的、粉末状的或大小在1cm以下的药材，一般药材100g-500g；粉末状药材25g；贵重药材5g-10g；个体大的药材，根据实际情况抽取代表性的样品。

（3）将所取有代表性样品混合均匀，即为总样品量。

（4）前处理：将供试品捡净后，用量较小时，可以用乳体或小型电磨粉碎过《中国药典》6号筛（1.0μm-250μm）备用。

1、中成药（1）取样：从各批号的箱、包、瓶中随机取样，记录好厂家、批号，从各包装盒中任意取1丸，每批号不得少于3次。

各供试品留样保存，保存期限至少1年。

水丸无包衣时，可直接取2丸-3丸，乳钵中研成细粉后，取少量置裁玻片上，滴加规定的试液，搅拌均匀，使粘结的细胞、组织分离，再按粉末特征加水合氯醛试液或其他适当试液处理后观察。

水蜜丸或大蜜丸；可直接用刀片横向切开取一薄片，或用小钢铲取一小块（约15mg）放置在载玻片上制片观察。

（1）去包衣：中药片剂常见包衣为糖衣，隔离层常使用胶浆、糖浆和滑石粉。

水丸和糊丸等（挂）衣的材料有滑石、蔗糖、朱砂、雄黄、青黛、百草霜、礞石、赫石等。

可用刀片将包衣剥去，简单的办法也可将片剂或丸剂断为两半，直接取内心，粉碎进行观察。

（2）添加剂：为便于观察，可对中成药的制造过程中使用的添加剂做适当的前处理。

除去水溶性干扰物：将检品置于蒸馏水中研匀，离心处理，取沉淀物检查。

植物制片的染色及显微化学鉴定方法一、目的与要求1、学习植物制片的一般染色方法。

2、学会并掌握常用显微化学鉴定法，即细胞壁化学组成及细胞内主要后含物性质的鉴定方法。

二、材料和用品1、自备材料：植物叶片、芹菜叶柄、土豆块茎、花生种子等等，解剖器、剃刀或双面刀片。

2、其它材料和用品：显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、吸水纸、蒸馏水、染色缸；0.1%番红、0.1% 固绿或1%苯胺蓝等染液、中性树胶、二甲苯、酒精、碘—氯化锌、盐酸—间苯三酚、苏丹Ⅲ、碘—碘化钾、10%氯化铁、盐酸等。

三、实验内容1、植物制片的染色方法2、常用显微化学鉴定法四、实验方法1、植物制片的染色方法用徒手切片法切得的薄片，如果仅仅是为了临时观察，制成临时装片即可，这种临时制片不能长久保存，只能作临时观察之用，又由于没经过染色，结构显示的也不够清晰。

为了求得更清晰地显示其细微结构及化学成分，并能够较长时间的保存，可以进一步染色及其它处理以至封片，从而可制成半永久或永久制片。

常用的染色方法是番红—苯胺蓝（或固绿）二重染色法，具体操作方法有二：方法一：（1）将植物切片材料放入30%酒精中，5分钟后移入水中。

（2）用0.1%番红水溶液染色12—24小时。

（3）倒去番红液，用清水冲洗数次后，再放回50%酒精中浸泡5分钟。

（4）将材料从50%酒精中转入70%酒精中脱色，直至硬木质化的细胞壁呈现红色，其它部分呈粉红色或近于无色时为止。

（5） 1%苯胺蓝（用70%酒精配制）对染2—5分钟。

若用0.1%固绿对染，则仅需半分钟左右即可。

注意：此步染色，要不时地在显微镜下检视，切忌染色过深，当木质化细胞壁呈红色，其它部分为淡蓝或淡绿色时，即可停止。

（6）用95%酒精冲去多余染液，再经无水酒精脱水5分钟。

（7）放入等量无水酒精与二甲苯溶液中及纯二甲苯中透明各3分钟。

（8）将切片材料移入载玻片上，在二甲苯未干时立即加一滴中性树胶封片，尔后将玻片平放，自然凉干或置于摄氏35度温箱中烘干。