细胞黏附实验的步骤及方法

Transwell 小室细胞粘附实验
1）提前接种细胞并对细胞做不同处理（如转染或加药）。

此处选取1640培养基，具体情况视细胞种类不同而定。

2）实验前一天，准备铺胶，以每96孔板50μL量计算所需胶体积。

将matrigel 与1640培养基等体积混匀铺于96孔板，于超净台吹干过夜。

实验当天加100μL PBS/孔，1 h后用移液枪吸弃，洗去残胶。

3）将细胞用胰酶消化，血细胞板计数细胞密度，调整成50,000个细胞/mL，加到铺好胶的96孔板，每孔加100 μL，每种处理重复3个孔。

4）于细胞培养箱培养1 h后吸弃培养基，PBS洗两遍以去除未粘附细胞。

5）用100μL每孔甲醇固定细胞15分钟，吸出甲醇后PBS洗两遍。

6）用100μL每孔DAPI染色细胞15分钟，吸出染料后PBS洗两遍。

7）荧光倒置显微镜下计数不同处理下粘附的细胞。

细胞粘附检测丨Cell Biolabs细胞粘附分析试剂盒解决方案细胞粘附即细胞与细胞外机制分子之间的相关作用，其在肿瘤细胞转移、浸润、胚胎发生等过程中起着重要的作用，例如，我们知道肿瘤细胞的一大特点是易转移，这主要就是因为肿瘤细胞比正常组织细胞粘附力低的原因，目前，细胞粘附机制也已成为癌细胞侵袭和转移研究的热点之一。

细胞粘附实验通常分为两类，即细胞-细胞粘附(cell-cell adhesion)和细胞-基质（cell-ECM adhesion）粘附。

其中细胞外基质（extracellular matrix,ECM）由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，在细胞之间或细胞表面组装成网络状的高度水合的凝胶结构，ECM按照组成可分为三大类：1.结构蛋白：胶原（Collagen）和弹性蛋白（Elastin），其中，胶原是ECM中最主要的水不溶性纤维蛋白，目前已发现的胶原类型有20多种，I~Ⅲ型胶原含量最丰富。

2.粘着蛋白：包括：纤粘连蛋白（Fibronectin,FN）、层粘连蛋白（Laminin,LN），FN是一种大型的糖蛋白，可将细胞连接到细胞外基质上，LN也是一种大型的糖蛋白，是基膜的重要成分，是胚胎发育中出现最早的细胞外基质成分。

3.氨基聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）与蛋白聚糖（Proteoglycan）：它们能够形成水性的胶状物，在这种胶状物中包埋有许多其它的基质成分。

Cell BioLabs针对于细胞粘附，提供全套细胞分析检测方案，除了细胞与ECM大分子粘附分析方案外，还有针对白细胞与内皮细胞之间（还有白细胞与上皮细胞之间、肿瘤细胞与内皮细胞之间）的粘附分析试剂盒提供。

如CytoSelect 48孔板细胞粘附分析试剂盒（纤连蛋白，比色法）#CBA-050——定量评估细胞粘附。

48孔板预先涂有纤连蛋白。

细胞与ECM大分子粘附分析结果图：将来自三种不同细胞系的血清细胞以100,000个细胞/孔的速度附着到包被有ECM分子的板上1小时，结果如上图白细胞与内皮细胞之间的粘附分析流程图：文章来源：艾美捷科技。

细胞增殖的检测方法:四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT 商品名为噻唑蓝, 就是一种黄色的染料。

1983 年Mosmann 建立MTT比色法,用于检测细胞存活与增殖。

其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中,而死亡的细胞无此功能。

二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定[4-8]等。

此方法简便、灵敏且无放射性。

MTT 溶液需要放置在4℃避光保存,最好就是现用现配。

由于MTT 经还原所产生的产物甲瓒不溶于水,无法直接测定吸光度,需要被溶解之后才能检测。

这不仅使工作量增加,而且MTT 溶液具有致癌性。

需要注意的就是,MTT 法只能用来检测细胞相对数与相对活力, 但不能测定细胞的绝对数。

另外, 有研究发现过氧化物会降低MTT 测定的准确度,抑制将近95%的MTT 与O2－的反应,MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上, 而致使检测的结果呈现假阴性。

内盐法(MTS)MTS 就是一种新型的MTT 类似物。

MTS 在偶联剂PMS 存在的条件下, 可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物, 其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关,可用酶标仪检测。

它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强,同时又克服了MTT、XTT 的缺点。

此方法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等,且比MTT 法更加准确。

此方法在一定程度上也存在缺陷。

最新研究表明在96 孔板试验中, 靠外的孔液体易蒸发,对检测结果有一定影响[24],且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂反应的检测、细胞粘附能力测定:蛋白染料染色法测细胞粘附本法就是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目,该法迅速可靠,还可用怍细胞形态学观察与染色细胞的照像。

一、摘要本实验旨在探究红细胞在不同条件下的粘附特性，以期为临床诊断和治疗提供理论依据。

通过体外模拟人体微循环环境，观察红细胞在玻璃表面、胶原蛋白、内皮细胞等表面的粘附情况，分析影响红细胞粘附的因素，为研究红细胞粘附与疾病的关系提供实验数据。

二、实验目的1. 了解红细胞粘附现象及其在疾病中的作用。

2. 探究影响红细胞粘附的因素。

3. 为临床诊断和治疗提供理论依据。

三、实验材料1. 实验试剂：生理盐水、胶原蛋白溶液、内皮细胞培养液、抗凝剂、荧光素标记红细胞等。

2. 实验仪器：倒置显微镜、离心机、细胞培养箱、细胞培养皿、移液器、电子天平等。

四、实验方法1. 细胞培养：将内皮细胞接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养至生长良好。

2. 红细胞制备：采集健康人外周血，用抗凝剂抗凝，分离红细胞，用生理盐水洗涤3次，制成红细胞悬液。

3. 红细胞粘附实验：（1）将玻璃表面、胶原蛋白、内皮细胞分别置于培养皿中，用生理盐水清洗后，置于倒置显微镜下观察。

（2）将制备好的红细胞悬液滴于不同表面，静置5分钟后，用生理盐水冲洗，观察红细胞粘附情况。

（3）采用荧光素标记红细胞，在荧光显微镜下观察红细胞粘附情况。

五、实验结果1. 玻璃表面：红细胞在玻璃表面粘附较少，粘附率约为10%。

2. 胶原蛋白：红细胞在胶原蛋白表面的粘附率明显提高，约为30%。

3. 内皮细胞：红细胞在内皮细胞表面的粘附率最高，约为50%。

六、讨论1. 红细胞粘附是红细胞与血管内皮细胞、胶原蛋白等细胞外基质之间的相互作用，是微循环中红细胞与血管壁相互作用的重要环节。

2. 本实验结果表明，红细胞在胶原蛋白、内皮细胞表面的粘附率明显高于玻璃表面，提示胶原蛋白、内皮细胞在红细胞粘附过程中发挥重要作用。

3. 红细胞粘附与多种疾病的发生、发展密切相关，如动脉粥样硬化、血栓形成等。

研究红细胞粘附机制，有助于揭示疾病的发生、发展规律，为临床诊断和治疗提供理论依据。

七、结论1. 本实验成功观察到红细胞在不同表面上的粘附现象，为研究红细胞粘附与疾病的关系提供了实验数据。

1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。

2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。

3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。

二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。

这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。

细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。

三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。

2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。

3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。

4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。

5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。

6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。

五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。

2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。

3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。

4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。

六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。

2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。

3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。

细胞粘附分子的检测白细胞和血管内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞等以及血液中均存在细胞粘附分子。

按其结构特1�X，分有钙离子依赖性家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族和选择素家族四大类。

在各种细胞因子、内毒素、凝血酶等作用下，细胞粘附分子由细胞内贮存池转移至细胞膜或合成增加，导致细胞表面的粘附分子数量增多。

因此在某些疾病中细胞粘附分子的数量有改变。

此外，细胞粘附分子经磷酸化、糖基化等修饰作用可发生构象改变，导致其亲和力和扩散速率改变而影响其功能，因此定量检测细胞粘附分子的数量、亲和力及扩散速率对探索某些疾病的发病机制、监视疾病的发生、发展过程和指导临床治疗有重要意义。

目前的检测方法，大多限于用免疫学技术检测其数量，而有关分子的亲和力及扩散速率的检测正在建立中。

一、细胞表面粘附分子的检测1．放射免疫测定法通常用抗细胞粘附分子抗体包被载体，加受检样品后，继加相应单克隆抗体和同位素标记的二抗作非竞争性固相放射免疫测定法。

2．免疫荧光测定法除常规的间接免疫荧光法外，有条件的实验室，用不同激发波长的荧光素着染色受检细胞，在FACS仪上可同时检测有两种不同的细胞粘附分子。

3．酶免疫测定法主要为双抗体夹心ELISA，本法应用最广，但仅能检出一群细胞的表面粘附分子数量，而不能反映单个细胞粘附分子数量的变化。

二、可溶性粘附分子的检测多采用双抗体夹心ELISA，研究最多的选择素家和免疫球蛋白超家族。

前者有E、L、P三型，均可见血液中。

溶血性尿毒症和血小板减少性紫癜患者血液中，P选择素比正常人高2～3倍，而败血症、HIV感染和艾滋病患者血液中L选择素明显增高。

血液中存在可溶性E选择素是内皮细胞激活的证据，败血症、糖尿病等患者血液中E选择素水平增高，一般与疾病的活动性无关，而与器官受损程度相关。

如败血症患者，可溶性E选择素可增高20倍以上，据称与疾病的严重性或预后有关。

肝炎、肝硬化等患者血液中超免疫球蛋白家族中ICAM-1水平增高，与肝功能损害指标相关。

细胞黏附实验的原理细胞黏附是细胞生物学中一个重要的研究领域，它涉及到细胞的粘附、迁移和信号传导等过程。

细胞黏附实验是研究细胞黏附现象的常用方法之一，通过实验可以了解细胞与细胞外基质之间的相互作用及其调控机制。

细胞黏附实验通常包括以下步骤：细胞培养、细胞处理、细胞黏附检测和结果分析。

首先，需要将待研究的细胞种类进行培养，使其在培养皿中形成单层或多层细胞。

然后，可以对细胞进行处理，如添加特定的细胞外基质、药物或激素等，以模拟不同的生理或病理条件。

接下来，将处理后的细胞加入到含有培养基的培养皿中，让其与细胞外基质接触。

细胞黏附的时间可以根据需要进行调整，一般为数分钟至数小时。

完成细胞黏附后，可以通过多种方法检测细胞的黏附情况，如显微镜观察、细胞计数、细胞染色等。

最后，根据实验结果进行数据统计和分析，以得出相关结论。

细胞黏附实验的原理主要涉及到细胞外基质和细胞表面受体之间的相互作用。

细胞外基质是一种复杂的结构，由多种蛋白质和多糖组成，如胶原蛋白、纤维连接蛋白、透明质酸等。

细胞表面受体则是细胞膜上的一类蛋白质，可以与细胞外基质中的特定成分结合，从而介导细胞与细胞外基质之间的黏附。

细胞黏附实验的目的是探究细胞黏附的调控机制，其中一个重要的研究方向是研究细胞外基质和细胞表面受体之间的特异性结合。

通过改变细胞外基质的成分或细胞表面受体的表达水平，可以研究细胞黏附的变化。

此外，还可以利用特定的抗体或药物来阻断或激活细胞外基质和细胞表面受体之间的相互作用，以研究其对细胞黏附的影响。

细胞黏附实验的结果可以提供重要的信息，如细胞黏附能力的差异、细胞黏附对细胞迁移和生长的影响等。

通过这些实验结果，可以进一步研究和解析细胞黏附过程中的分子机制，以及其在生物学和疾病发展中的重要作用。

细胞黏附实验是细胞生物学中一项重要的研究方法，通过模拟生理或病理条件，探究细胞与细胞外基质之间的黏附现象。

通过改变细胞外基质成分、细胞表面受体的表达或使用特定的抗体或药物，可以研究细胞黏附的调控机制。

一、实验目的通过本实验，观察细菌对宿主细胞的粘附现象，探讨细菌粘附素与宿主细胞受体的相互作用，以及细菌粘附在宿主细胞表面的影响因素。

二、实验原理细菌的细胞粘附是指细菌与宿主细胞表面的特定分子相互识别和结合的过程。

细菌粘附素是细菌表面的一种蛋白，能够识别和结合宿主细胞表面的受体，从而实现细菌在宿主细胞表面的粘附。

本实验通过观察细菌对宿主细胞的粘附现象，研究细菌粘附素与宿主细胞受体的相互作用。

三、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）2. 宿主细胞：人胚肾细胞（HEK293）3. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素4. 细菌培养试剂：LB培养基、琼脂、无菌水5. 实验仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、吸管等四、实验方法1. 细菌培养：将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃培养过夜。

2. 宿主细胞培养：将HEK293细胞接种于DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养箱中培养至对数生长期。

3. 细菌粘附实验：（1）将HEK293细胞铺于6孔板，每孔接种1×10^5个细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养24小时。

（2）将过夜培养的大肠杆菌用无菌水洗涤，按1:100的MOI（感染复数）加入细胞培养孔中。

（3）37℃、5%CO2培养箱中培养2小时。

（4）用无菌水洗涤细胞，去除未粘附的细菌。

（5）用倒置显微镜观察细菌在宿主细胞表面的粘附情况。

4. 影响因素实验：（1）温度对细菌粘附的影响：将细胞培养孔置于不同温度（37℃、25℃、4℃）下，进行细菌粘附实验。

（2）pH值对细菌粘附的影响：将细胞培养孔置于不同pH值（pH 5.0、pH 7.0、pH 9.0）下，进行细菌粘附实验。

（3）宿主细胞类型对细菌粘附的影响：将HEK293细胞替换为其他细胞类型（如HEK293T、HEK293E等），进行细菌粘附实验。

五、实验结果1. 细菌在宿主细胞表面的粘附现象：通过倒置显微镜观察，可见细菌在宿主细胞表面形成明显的粘附现象。

细胞粘附具体执行方法请按照：Cell_Adhesion_protocol_manual[1].pdf中的A. Colorimetric Cell Adhesion Assays（第23-26页），其中测量方法按照步骤41. Coat plate.a) Coat a 96 well flat bottom microwell plate with “protein” diluted in PBS, pH 7.4. (See note #1 pg.30) Add 0.05 ml volume per well and tap plate to disperse. “protein”: 为FIBRONECTIN（具体包被方法参照HUMAN FIBRONECTIN.pdf）或matrigel（具体包被方法参照GUIDELINES FOR USE matrigel.pdf）或BSA（具体包被方法按照Coat a 96 well flat bottom microwell plate with “protein” diluted in PBS, pH 7.4. (See note #1 pg.30) Add 0.05 ml volume per well and tap plate to disperse.）【求助】有没有高人做过细胞-基质粘附实验啊？参与者：从天而降的少女96孔扳上是先铺mtrix gel 再铺FN，还是直接铺FN就可以了呢?滴上去以后风干了就可以吗?还是要等一段时间才可以加细胞悬液?谁告诉我一下啊，多谢.我想检测肿瘤细胞的黏附能力.有没有高人做过细胞-基质粘附实验啊？参与者：sunnyziyang直接铺FN，超净台内过夜风干，使用前PBS 冲洗2遍，重新水化，再加1%BSA100μl/孔封闭，培养箱内培养1h后加100μl细胞悬液参与者：xinzhijinbi请问在材料上种细胞时测细胞在材料上的黏附力能这样测吗？具体咋做呢？参与者：hanhailanbo现在有现成的试剂盒检测细胞的粘附能力，美国cell biolabs公司的试剂盒不错，好像国内北京西美杰有代理。