第一章生物技术总论一、概念1、生物技术：也称生物工程,是指人们以现代生命科学为基础、结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人们生产出所需产品或达到某种目的的一门新兴的、综合性的学科.2、传统生物技术与现代生物技术传统生物技术主要是通过微生物的初级发酵来生产商品,包括酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶与其他食品的传统工艺；现代生物技术是指在20世纪中叶后随着一些生物学领域的重要发现,以与随后产生的新手段和新技术,从而形成以现代生物科学研究成果为基础,以基因工程为核心的新兴学科.现代生物技术的产生和发展是以1953年D N A双螺旋结构模型建立为基础,以70年代D N A重组技术的建立为标志.二、生物技术的重要性1〕首先生物技术是解决全球性经济问题的关键技术,在迎接人口、资源、能源、食物和环境等五大危机的关键技术,可以解决人类所面临的诸如食品短缺问题、健康问题、环境问题、与资源问题；2〕其次,生物技术广泛应用于医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化工和能源等领域,促进传统产业的技术改造和新兴产业的形成,对人类生活产生重大而深远的影响.3〕此外生物技术还与与伦理、道德、法律等社会问题都有着密切的关系,对国计民生产生重大的影响.4〕综述：生物技术是现实生产力,也是具有巨大经济效益的潜在生产力.将是21世纪高技术革命的核心内容,生物技术产业是21世纪的支柱产业.三、生物技术的特征生物技术与其他高新技术一样所具有的"六高〞的基本特征：即高效益,可带来高额利润；高智力,具有创造性和突破性；高投入,前期研究与开发需要大量的资金投入；高竞争,时效性的竞争非常激烈；高风险；高势能,对国家的政治、经济、文化和社会发展有很大的影响,具有很强的渗透性和扩散性,有着很高的态势和潜在的能量.四、生物技术的种类1、时间上划分：可分为传统生物技术和现代生物技术2、根据生物技术操作对象与操作技术的不同,可分为基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、生化工程等.五、生物技术对经济社会发展的影响〔主要记粗字体〕1、改善农业生产、解决食品短缺1〕提高农作物的产量与品质•培育抗逆的作物优良品系•植物种苗的工厂化生产•提高粮食品质•生物固氮,减少化肥使用量2>发展畜牧业生产•动物的大量快速无性繁殖•培养动物的优良品系2、提高生命质量,延长人类寿命1〕开发制造奇特而贵重的新型药品2〕疾病的预防和诊断3〕基因治疗4〕人类基因组计〔H G P〕3、解决能源危机、治理环境污染1〕解决能源危机2〕环境保护4、制造工业原料、生产贵重金属1〕制造工业原料2〕生产贵重金属第二章基因工程一、概念1、基因工程的定义：按照人为的愿望,进行严密的设计,通过体外D N A重组和转移等技术,有目的地改造生物种性,使现有物种在较短的时间内趋于完善,从而创造出新的生物类型.2、基因克隆载体：外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞,把这种能承载外源D N A片断〔基因〕带入受体细胞的传递者称之为基因克隆载体.3、目的基因和结构基因目的基因的：基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组,获得具有高度应用价值的新物质〔品系〕,为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出可用于克隆的相关基因,这样的基因通常称之为目的基因,目的基因主要是结构基因.结构基因：作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子、基因编码区和转录终止子三部分.4、受体细胞和感受态细胞受体细胞：从实验技术上讲是能摄取外源D N A〔基因〕并能使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞；感受态细胞：是指处于易于摄取外源D N A片段生理状态的细胞.5、转化和转导转化：携带基因的外源D N A分子通过与膜结合进入受体细胞,并在其中稳定维持和表达的过程；转导：通过噬菌体〔病毒〕颗粒感染,从而把外源的D N A分子导入被感染的受体细胞的方法.二、基因工程的理论基础1〕D N A是遗传物质：核酸的组成和分类〔D N A和R N A〕2〕D N A双螺旋结构:1953年J a m e s D.W a t s o n和F r a n c i s H.C.C r i c k揭示了D N A分子的双螺旋结构和半保留复制机制.3〕中心法则和遗传密码:1957年C r i c k又提出了遗传信息传递的"中心法则〞,1964年M a r s h a l l N i r e n b e r g和G o b i n d K h o r a n a等终于破译了64个遗传密码；三、基因工程的特征1、跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖；2、无性扩增：外源D N A在寄主细胞内可大量扩增,和高水平表达；四、基因工程的主要操作内容1、目的基因的获取：从复杂的生物基因组中,经过酶切消化或P C R扩增等步骤,分离出带有目的基因的D N A片断；2、重组体的制备：将目的基因的D N A片断插入到能自我复制并带有选择性标记〔抗菌素抗性〕的载体分子上.3、重组体的转化：将重组体〔载体〕转入适当的受体细胞中.4、克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆〔含有目的基因〕.5、目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物.五、基因工程的安全性1、对环境的影响：重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响.2、新型病毒的出现：制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播.3、癌症扩散：将肿瘤病毒或其它动物病毒的D N A引入细菌有可能扩大癌症的发生X围.4、人造生物扩散：新组成的重组D N A生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险.六、基因工程的应用1、基因工程在植物上的应用1〕提高植物的光合作用效率A.提高C O2的固定率：改变与光合作用有关的酶的结构和组成〔如二磷酸核酮糖羧化酶〕.B.提高光能吸收率和转化率：改变光能交换系统的分子的基因结构.2〕提高豆科植物的固氮效率：使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮.3〕转基因植物：是农业生物技术的主要内容,是将克隆到的特殊基因导入受体植物,使之增加一些优质性状〔高产、稳定、优质、抗虫、抗病等〕.2、基因工程在医药上的应用1>用转基因植物或动物生产药物2>用微生物生产药物大肠杆菌或酵母菌生产激素〔如胰岛素〕、干扰素等3>技术设计高效高特异性的生物制剂应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构,制造出高效高特异性的生物制剂4>研制疫苗：制造新型疫苗〔如H I V、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、S A R S〕5>基因治疗6〕法医鉴定7〕基因治疗〔仍在探索阶段〕：将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因或抑制异常基因的表达.例如基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等.3、基因工程在环境保护中的应用1>检测水污染:用重组细菌或转基因鱼等检测水污染;2>生物降解:用带有重组质粒的"超级菌〞分解油〔烷烃类〕、有机农药污染.4. 转基因动物将外源基因导入动物细胞,并在基因组内稳定整合,遗传给后代.使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等.七、基因工程操作的主要技术原理〔了解〕电泳技术、分子杂交技术、P C R技术、D N A测序技术、R N A i技术八、基因工程工具酶的种类与作用〔把握,酶的作用自行百度〕限制性内切酶、D N A连接酶、D N A聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶九、基因克隆载体1、定义：外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞,把这种能承载外源D N A片断〔基因〕带入受体细胞的传递者称之为基因克隆载体.2、基因克隆载体的功能:运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件3、作为基因克隆载体应当具备的条件：必须含有复制单元,以使得目的片断能再宿主细胞内复制；必须含有标记基因；标记基因的内部必须有合适的切割位点,使得外源基因插入到标记基因内使标记基因失活,从而能鉴定出重组的D N A 分子；对于表达载体来说,载体应该包括合适的控制单元,如启动子、终止子和核糖体结合位点.4、基因克隆载体的种类:质粒克隆载体、噬菌体和病毒克隆载体、〔噬菌体和质粒〕复合型克隆载体、酵母人工染色体、细菌人工染色体载体、哺乳类人工染色体十、目的基因的获得〔基因克隆〕1、目的基因和结构基因的定义2、结构基因的组成3、原核生物和真核生物结构基因的组成〔了解〕4、目的基因的分离方法<了解>十一、基因的体外重组与转化、重组体的选择与鉴定1、基本概念：受体细胞、转化和转导等2、植物转基因技术：植物转基因技术是将人工分离或修饰过的功能基因导人植物的基因组中,从而引起植物体性状的可遗传改变.1>植物的再生〔基因转化的受体系统建立〕：所谓植物基因转化受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径,能高效、稳定再生无性系,并能接受外源D N A整合对转化选择抗生素敏感的再生系统.2〕植物基因转化受体系统的条件①高效稳定的再生能力②较高的遗传稳定性③具有稳定的外植体来源④对选择性抗生素敏感⑤对农杆菌侵染有敏感性3〕植物基因转化系统T i质粒载体介导的转化系统4〕转化方法：叶盘转化法3、植物基因工程应用1〕抗植物虫害基因与其应用2〕抗植物真菌病害基因与其应用3〕抗非生物胁迫基因与应用4〕提高作物产量改良作物品质的基因与其应用第三章细胞工程一、细胞工程的基础知识与基本技术1、基本知识：原核细胞和真核细胞2、基本理论：细胞全能性3、基本技术：无菌操作技术、细胞培养技术和细胞融合技术二、细胞工程的重要应用➢快繁➢优质植物快速培育与繁殖；➢动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；➢利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；➢新型动植物品种的培育；➢供医学器官修复或者移植的组织工程；➢转基因动植物的生物工程反应器；➢在遗传学、发育学等领域的理论研究；➢在能源、环保等领域的应用.三、植物细胞工程1、概念：细胞的全能性:生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性植物组织培养：在无菌和人为控制外因〔营养成分、光照、温度、湿度等〕条件下,培养、研究植物组织器官,甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术.外植体：即能诱发产生无性增殖系的器官或组织切段.胚状体：指的是在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造.愈伤组织：泛指经细胞与组织产生的可传代的末分化细胞团分化和去分化：2、植物组织培养的过程1〕预备阶段：➢选择合适的外植体与其消毒处理➢配置适宜的培养基①含量丰富的基本成分,如糖类、氮、磷、钾、镁等；②微量无机物,如铁、锰、硼酸等；③微量有机物,如激动素、吲哚乙酸、肌醇等.2〕诱导去分化阶段：组织培养的第一步就是让这些器官切段去分化,使细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态.3〕继代增殖阶段4〕生根成芽阶段5〕移栽成活阶段3、植物组织培养的类型依据培养基分细胞的悬浮培养细胞的固体培养依据外植体材料分类器官<组织>培养细胞培养依据培养途径分类：愈伤组织发生体细胞胚胎发生1〕愈伤组织培养：由植物各种器官的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团,然后再诱导其生根、成芽,长成完整的植株的培养方法,愈伤组织的形成包括启动、分裂和形成三个时期.2〕细胞悬浮培养3〕器官培养4〕单倍体培养〔重点把握〕定义：单倍体是指细胞中仅含有一组染色体的个体.单倍体植株的诱发途径：➢天然诱发途径〔孤雌繁殖、孤雄繁殖、无融合生殖等〕➢人工诱导〔花药培养、花粉培养、未授粉子房或胚珠培养、杂交法获得单倍体植株〕.单倍体植株培养的目的：单倍体植株仅含有一组染色体,不存在基因之间的显隐性关系,通过染色体加倍,可以创造纯合的二倍体植株,作为杂交的亲本材料,获得较高的杂种优势等4、植物组织培养的应用1>初级与次级代谢物的生产；2>生物转化〔利用植物培养细胞为酶源使某种前体化合物生成相应产物的技术称之为生物转化.如毛地黄细胞培养物可使毛地黄毒素转化为β甲基地高辛〕；3>天然植物食用色素的生产4>快速繁殖,人工种子5>无病毒植物的培育6>转基因植物的培育7〕人工种子的研制人为制造的种子,它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以与其他成分的人工胶囊.人工种皮、胚状体和人工胚乳三部分构成.➢不受环境因素的制约,一年四季可以进行工厂化生产；➢由于胚状体是经人工无性繁育产生,有利于保持该种系的优良性状；➢与试管苗相比,成本更低,更适合机械化田间播种；➢可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等,以利于胚状体的健康生长.胚状体的制备与其同步化生长：可采用低温法、抑制剂法〔D N A合成抑制剂〕、分离法和通气法等进行诱导和筛选；人工胚乳的制备：人工胚乳的营养需求因种而异,但与细胞、组织培养的培养基大体相仿,同时可根据需要在培养基中添加适量的激素、抗生素、农药、除草剂等；人工种皮的制备：主要采用包埋剂－褐藻酸钠进行包埋,经氯化钙滴定、络合作用后形成具有一定刚性的人工种皮.贮存：一般要将人工种子保存在低温〔4－7°C〕,干燥〔<67％相对湿度〕条件下〔相对成本较高〕；萌发：在自然条件下,人工种子贮存时间较短,萌发率较低；在人为控制的条件下,萌发率相对较高.4、植物体细胞杂交1〕定义：用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞,且把杂种细胞培育成新的植物体的方法2〕优势〔与有性杂交方法比较〕：打破了不同种生物间的生殖隔离限制,大大扩展了可用于杂交的亲本组合X围3〕体细胞杂交过程Ⅰ.原生质体的制备植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞.这部分细胞仅由细胞膜包裹,呈圆形,要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定,原生质球〔球状体〕：指在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体.原生质体和原生质球都是进行原生质体融合的好材料.常用的外植体包括：种子胚、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶.应液转绿是酶解成功的一项重要指标.去反应液中一些残留的组织块和破碎的细胞,可通过不锈钢网或尼龙布过滤,也可以采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体.新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2-4次.果把它放入低渗溶液中,则很容易胀破.也可以用荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察,残留的细胞壁呈现明显荧光.通过以上鉴定,基本上可判别是否是原生质体与其百分率.此外,尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以与测定光合作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力.Ⅱ.原生质体的融合乙二醇〔P E G〕结合高钙高p H诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流.型电极法和平行电极法对称融合方法.➢亲本双方的细胞核和细胞质能融合为一体,发育成为完全的杂合植株.➢融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质组成,可能发育为核质异源植株➢融合细胞由双方胞质与一方核或再附加少量他方染色体或D N A构成；➢原生质体融合后两个细胞核尚末融合时就过早地被新出现的细胞壁分开.以后它们各自分生长成嵌合植株.Ⅲ.杂合体的鉴别与筛选化互补、生长互补.第四章发酵工程一、发酵工程的含义与主要内容1、定义：发酵工程是生物技术的重要组成部分,是生物技术产业化的重要环节.它将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合起来,是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术,由于它以培养微生物为主,所以又称微生物工程.2、主要内容：包括生产菌种的选育、发酵条件的优化和控制、反应器的设计与产物的分离、提取与精制等.〔填空〕二、发酵工程概况1、主要的发酵类型：〔填空〕1〕微生物菌体发酵2〕微生物酶发酵3〕微生物代谢产物发酵4〕微生物转化发酵5〕生物工程细胞的发酵2、发酵技术的特点：1）微生物的生长特点➢发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌,酵母菌和霉菌➢对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力；➢有极强的消化能力；➢有极强的繁殖能力；➢种类多、产酶的品种多,生产容易、成本低.2〕发酵技术的特点➢发酵过程以生物体的自动调节方式进行,数十个反应过程能够象单一反应一样,在发酵设备中一次完成；➢反应通常在常温常压下进行,条件温和,能耗少,设备较简单；➢原料通常以蜜糖、淀粉等碳水化合物为主,可以是农副产品、工业废水或可再生资源〔植物秸秆、木屑等〕；➢容易生产复杂的高分子化合物,能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入等反应；➢发酵过程中需要防止杂菌污染、设备需要进行严格的清洗、灭菌,空气需要过滤等.3、发酵工程的应用发酵工程广泛应用在医药工业、食品工业、能源工业、化学工业、冶金工业、农牧业、环境保护等行业中,而且发挥越来越重要的作用.三、微生物发酵过程1、发酵方法的类别厌氧性发酵根据微生物的种类分类好氧性发酵兼性发酵闭发酵根据培养基的物理性状分类固体发酵液体发酵2、工业生产常用微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌和其他微生物〔担子菌、藻类〕3、培养基1〕培养基的种类：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基.子培养基是制备孢子用的.生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基、大〔小〕米培养基,由葡萄糖〔或淀粉〕、无机盐、蛋白胨等配制成的琼脂斜面培养基等.供孢子发芽和菌体生长繁殖用的.常用的原料有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉等,培养基的成分随菌种而改变.酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的,要求此种培养基的组成丰富完整,营养成分浓度和粘度适中,利于菌体的生长,进而合成大量的代谢产物.2〕酵培养基的组成：碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子、水和产物形成的诱导物、前体和促进剂4、发酵的一般过程〔上、中、下游过程简要论述〕1〕上游工程➢菌种的分离、纯化与选育➢菌种斜面培养➢种子扩大培养➢发酵罐的清洗、灭菌➢培养基的配置和灭菌等2〕中游工程➢微生物发酵与控制发酵是微生物合成大量产物的过程,是整个发酵工程的中心环节.包括分批发酵、半连续发酵和连续发酵、固体发酵和液体发酵等.影响发酵的因素很多,如温度、p H、通风、搅拌、罐压力等等,必须适当地控制影响发酵的各种条件,掌握发酵的动态,并进行杂菌的检查和产物测定,使整个发酵过程顺利进行.3〕下游工程：➢发酵产物的分离、纯化和精制：发酵液的预处理和固液分离：目的是改善发酵液性质,以利于固液分离,常用酸化、加热和加絮凝剂等方法；提取：目的主要是浓缩,也起到对产物一定的纯化作用,常采用吸附法、离子交换法、沉淀法、萃取法、超滤法等；精制：进一步纯化发酵产物,可采用沉淀、超滤、层析等方法.成品加工：对获得产物进行最后的浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加稳定剂等.四、发酵操作方式与工艺控制1、发酵的操作方式〔问答,三种方式优缺点比较,需要加三种方式的概念〕1〕分批发酵：先将空罐杀菌,培养基装入发酵罐,接种之后进行培养,在培养过程中,培养基成分减少,微生物增殖.微生物周围的环境随时间而变化,是一种非稳态操作法.优缺点：此法不易染菌,但很难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力.在分批发酵系统中,微生物具有典型的生长周期〔延滞期、指数生长期〔对数生长期〕、减速期、静止期或稳定期、衰亡期〕.目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中.2〕连续发酵：在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时,将含有微生物和产物的培养液,从发酵罐中连续放出,叫做连续培养法.优点：可以维持稳定的操作条件,有利于微生物的生长代谢,从而使产率和产品质量也保持相对的稳定；能够有效地实现机械化和自动化,降低劳动强度,减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占有的时间,提高设备利用率,节省劳动力和工时；由于灭菌次数减少,使测量仪器探头的寿命得以延长；缺点：由于是开放系统,加上发酵周期长,容易造成杂菌污染；在长周期连续发酵中,微生物容易发生变异；对设备、仪器与控制元器件的技术要求较高；粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团,给连续发酵操作带来困难.3〕补料分批发酵：又称半连续发酵,是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术,是指在微生物分批发酵中,以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术；优点：补料分批发酵既可以保证微生物生长的需要,又不造成不利的影响,从而达到提高产率的目的；补料分批发酵可以分为两种类型：单一补料分批发酵和反复补料分批发酵.2、发酵工艺控制:温度、p H值、溶解氧的浓度、种龄与接种量五、发酵设备〔了解〕1、定义：进行微生物深层培养的设备.2、应具备的条件：。
