方法验证 (SOP, 适用于色谱类)

中心化验室型高效液相色谱仪验证（一）验证方案（二）验证报告药业有限公司中心化验室型高效液相色谱仪验证方案（SOP-YZ-???）方案制定人：制定日期：方案审查人：审查日期：方案审核人：审核日期：方案批准人：批准日期：药业有限公司目录1、概述2、验证目的3、验证实施小组成员及有关责任4、验证文件5、合格标准6、验证方法和步骤7、验证结果分析和综合评价8、最终评价9、验证周期10、验证记录1、概述高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。

由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。

高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。

其中LC-2010和Agilent1100型为单泵型，LC-20AB型为双泵型高效液相色谱仪。

2、验证目的检查并确认高效液相色谱仪运行性能符合要求。

3、验证实施小组成员及有关责任验证实施小组组长???负责协调及异常情况的处理；操作员??????负责验证的具体操作工作；QA???负责监督实施本方案。

4、主要验证文件高效液相色谱法（SOP-ZL-???）、中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪（JJG705-2002）、UV-VIS检测器SPD-20A/SPD-20AV说明书、溶液传输单元LC-20AB说明书、中华人民共和国药典2005年版二部、LC-2010A/2010C操作说明书安装手册和维修手册。

5、合格标准6、验证方法和步骤6.1验证方法整个验证过程分为单个部件的验证和整机验证。

验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。

实用文档1.目的PURPOSE建立分析方法验证的程序要求、文件和步骤，确保分析方法有效。

2.范围SCOPE2.1 实验室涉及定性或定量的分析方法，包括含量、有关物质（限度或定量）、鉴别和性能测试等相关分析方法。

2.2 颗粒度与原子吸收在此文件中单独列出，微生物见SOP C-2007。

2.3 不适用于毒性、临床前和临床研究的生物分析方法。

2.4 本SOP为验证的通用要求。

产品的具体分析方法验证应有相应验证文件，可根据实际情况对验证过程进行调整。

3.定义DEFINITION3.1 分析方法的分类3.1.1按照检测目的的不同有如下表3-1所述表3-1：分析方法的分类3.1.2按照来源不同又分为法定分析方法和非法定分析方法3.1.2.1法定分析方法-包括各药典收载的或已经验证并在法规部门注册得到批准的分析方法。

3.1.2.2非法定分析方法-除上述分析方法外自主开发或者是经过修订的法定分析方法。

实用文档3.2分析方法验证/确认一般来说，无论是应用于生产过程、放行、接收还是稳定性试验，所用的方法必须是经过验证或确认且有文件支持的分析方法。

3.2.1分析方法验证-证明分析方法符合其应用目的的过程。

对于自主开发分析方法，须经过全面的验证，详见表3-2。

对于经过修订的法定方法，视修改的条件，必须进行部分或全面的方法验证。

表3-2：分析方法的验证要求注：（1）- 正常情况下不需包含在验证方案中；（2）+ 正常情况下须包含在验证方案中；（3）# 根据实际需求而定；（4）※溶液的稳定性至少应包括实际应用条件下的稳定性；（5）▲不能完全代表物质专属性的分析方法，应有其它分析方法补充；（6）* 当分析方法用于稳定性样品的检测时，专属性必须做稳定性指示特性；（7）只有当方法转移到不同地点的另一个实验室或收录在药典中时才需要做重现性，如果已经做了重现性，中间精密度可不做；（8）滤膜影响试验：根据实际需求而定，对于定量分析中使用到滤膜的一般要求做。

SOP高效液相色谱法检验操作规程SOP(S tandard O perating P rocedure)高效液相色谱法检验操作规程应包括以下内容，长度不少于1200字：一、目的和适用范围说明制定此操作规程的目的和适用范围，例如适用于其中一种特定的样品检验。

二、相关参考文件列举与此操作规程相关的参考文件，例如国家标准、行业标准、公司内部文件等。

三、术语和定义定义操作中可能出现的术语和缩写词的含义，以确保操作规程的清晰和一致性。

四、仪器设备确定用于该检验的高效液相色谱仪及其相关设备的说明和规格。

五、试剂和材料列出用于检验的试剂和材料，并提供其质量标准、存储要求和有效期等信息。

六、工作环境和安全要求确定进行检验时所需的工作环境和安全要求，包括所需的实验室设施、通风要求、个人防护措施等。

七、样品准备详细描述样品的获取、保存、处理和制备方法，确保样品的准备符合标准要求。

八、标准曲线制备说明制备标准曲线所需的试剂和材料、操作步骤和相关参数设置，以确保准确测量样品。

九、仪器校准和验证指导操作员如何校准和验证高效液相色谱仪以确保仪器的准确性和可靠性。

十、方法操作步骤详细描述高效液相色谱检验的操作步骤，包括进样器设定、流速设定、柱温设定、检测波长设定等，确保操作的标准化和一致性。

十一、结果记录和数据处理提供一个记录表格，规定操作员如何记录检验结果，包括峰面积、保留时间等数据，并说明如何进行数据处理和解读。

十二、异常处理列举可能出现的异常情况，如仪器故障、色谱图异常等，并给出相应的处理措施和纠正措施。

十三、参考范例和质量控制提供一些操作示例或参考范例，以及质量控制的要求和方法，以确保结果的准确性和可靠性。

十四、操作员培训和授权确定操作员接受培训的要求和方法，表明完成培训后的操作员可以独立进行该检验，并进行检验授权和审批的规定。

十五、附录列举相关的附录，如计算公式、样品制备方法详解、有关仪器的文章等。

以上是SOP高效液相色谱法检验操作规程的基本内容，操作规程的编写应根据具体情况进行调整和修改。

中华人民共和国安徽出入境检验检疫局The Chemical Laboratory of AHCIQ标准操作程序Standard Operation Procedure液相色谱岗位分析方法性能标准、其他要求和步骤Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results at LC Post安徽出入境检验检疫局化学技术中心液相色谱岗位分析方法性能标准、其他要求和步骤1．定义1.1 准确度检测结果与可接受参考值之间的符合度。

通过测定真实性和精密度来确定。

1.2 α误差指测试样品符合规定的概率，尽管获得的是不符合规定的测定(是一个假的不符合规定的决定)。

1.3 分析物将要检测、鉴别和/或定量的物质以及分析过程中产生的衍生物。

1.4 β误差测试样品确实不符合规定的概率，尽管获得的是符合规定的测定(是一个假的符合规定的决定)。

1.5 偏差指检测结果与可接受参考值之间的差异。

1.6 标准校准用参考基准值的测量值来代表所测物质量的测量手段。

1.7 认证过的基准物质(CRM)CRM指一种有特定分析物含量赋值的物质材料。

1.8 共色谱法指一个将提取物在进行色谱分离之前分成两个部分的过程。

第一部分进行色谱分离。

第二部分与要测定的标准分析物混合。

然后将该混合物也进行色谱分离。

所加标准分析物的量必须与提取物中分析物的估计值相差不大。

设计此方法是要提高采用色谱法时分析物的鉴别，特别是在没有适宜的内标物可用时。

1.9 协同试验用相同的方法对相同的样品进行分析以确定该方法的性能特性。

该试验包括随机测定误差和实验室偏差。

1.10 确认方法能提供全面或补充信息使物质得到明确地鉴定，并且能在感兴趣的水平进行定量的方法。

1.11 决定限度(CCα)CCα指等于和高于此值时，可以用α误差概率得出认为样品不符合规定的结论的限度。

1.12 检测容量(CCβ)CCβ指可以用β误差概率检测、鉴别和／或定量样品中物质的最小含量。

标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。

2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。

3责任：QC人员对本SOP实施负责。

4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。

高效液相色谱法标准操作规程目的：建立高效液相色谱法标准操作规程。

适用范围：高效液相色谱法。

责任：质检员实施本操作规程，检验室主任负责监督本规程正确执行。

程序：高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。

1.对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。

色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。

常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。

离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。

除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。

在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。

正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。

一般色谱图约于20分钟内记录完毕。

2.系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整。

应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

(1) 色谱柱的理论板数（n ） 在选定的条件下；注入供试品对仪器或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R /（W h/2）计算色谱柱的理论板数。

如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改普通色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。

液相色谱质谱联用仪检验作业指导书1.适用范围适用于液相色谱质谱联用仪（LCMS-2020）的期间核查2.校验方法准备1.0ng/μL和100pg/μL的利血平在甲醇中的标准溶液，按液相色谱流动相流速0.8mL/min，ESI+与APCI+模式下流动相：甲醇：水（80:20，体积分数），加入0.1%（体积分数）甲酸；ESI-模式下流动相：甲醇：水（80:20，体积分数），加入0.1%（体积分数）氨水，设置仪器参数，使用全扫描模式（Scan）校准分辨力与质量准确性，使用选择离子模式（SIM）校准信噪比、峰面积重复性、保留时间重复性。

3.计量性能指标校验项目仪器类型电离模式要求分辨力单四级杆ESI+≤1u信噪比单四级杆ESI+≥10:1 ESI-APCI+质量准确性单四级杆ESI+≤0.5u峰面积重复性单四级杆ESI+≤10%保留时间重复性单四级杆ESI+≤1.5%4.校验周期校验项目周期分辨力1年信噪比1年质量准确性1年峰面积重复性1年保留时间重复性1年5.校验项目5.1分辨力待仪器运行稳定后，根据校验方法中推荐条件，在ESI+模式下，选择全扫描模式（Scan），将扫描范围设为m/z=606~612，注入1ng/μL的利血平溶液5μL。

观察质谱图，记录m/z=609质谱峰，并计算其50%峰高处的峰宽，得到W1/2，作为分辨力的结果。

5.2质量准确性在ESI+模式下，选择全扫描模式（Scan ），将扫描范围设为604~614，注入1ng/μL 的利血平标准溶液10μL ，观察质谱图，记录特征离子的实测质量数（有效数字取小数点后两位）。

根据公式（1）计算△M ，以△M 的最大值作为质量准确性的结果。

i 理i 测M -M △M =（1）式中：M i 测——第i 个离子的测量值，u M i 理——第i 个离子的理论值，u ；5.3信噪比根据检验方法中条件设置仪器参数，使用选择离子模式（SIM ），分别在ESI+和APCI+模式下：将检测离子m/z 设为609；在ESI-模式下：将检测离子设为607。

名称：薄层色谱法标准操作规程(SOP)关键词：薄层色谱；操作目的：进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定背景知识：选填项目原理：薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。

等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。

主体内容：1 仪器与材料1.1 玻板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。

1.2 固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。

其颗粒大小，一般要求直径为10—40µm。

薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10—15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5—0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。

也有含一定展开液或缓冲液的薄层。

1.3 涂布器：应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

1.4 点样器：常用具支架的微量注射器或定时毛细管，应能使点样位置正确集中。

1.5 展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。

2 操作方法2.1 薄层板制备：除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2—0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。

即置有干燥剂的干燥箱中备用。

使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

2.2 点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2——4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。

WHO发布《良好⾊谱规范》—中英⽂对照版近⽇，WHO发布了《 GOOD CHROMOTOGRAPHY PRACTICES优良⾊谱规范》，该⽂件对⾊谱系统、验证确认、访问与权限、审计追踪、时间⽇期功能、电⼦系统、溶剂、缓冲液、流动相、⾊谱柱、样品的管理、⾊谱⽅法、⾊谱峰和峰积分、数据管理等作了较为系统的要求，此外，还专门清洁验证的分析⽅法、数据管理作出规定。

该⽂件全⽂翻译如下：1. INTRODUCTION AND SCOPE介绍与范围The use of chromatography methods (such as High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) and Gas Chromatography (GC)) in quality control laboratory analysis has increased significantly in recent years.近年来⾊谱⽅法（如⾼压液相⾊谱（HPLC）和⽓相⾊谱（GC））的使⽤在QC实验室分析中已有显著增加。

HPLC and GC methods are used in, for example, the identification of materials and products, for determination of assay and related substances in materials and products, as well as in validation such as process validation and cleaning validation.HPLC和GC⽅法被⽤于，例如，物料和产品鉴别、物料和产品中含量和有关物质检测，以及验证如⼯艺验证和清洁验证。

Due to the criticality of the results obtained through chromatography, manufacturers should ensure that the data acquired is accurate and reliable. Results should meet ALCOA+ principles (i.e. attributable, legible, contemporaneous, original and accurate).由于通过⾊谱获得的结果⾮常关键，⽣产商应确保所获取的数据的准确性和可靠性。

四川禾亿制药有限公司Sichuan Herbease Pharmaceutical Co, Ltd第 1 页/共 19 页文件名称 理化检验方法学验证与确认SOP文件编码 SOP-VC-001.00 版 本 号 QB-2019文件类型 操作标准拷 贝 号项 目 职 务 签 名日 期起 草验证专员 审 核质量保证部负责人质量控制部负责人 研发部负责人批 准 验证部负责人颁发部门 质量保证部 生效日期 年 月 日分发部门 分发份数分发部门 分发份数质量保证部 验证部 质量控制部 研发部 生产部 行政部 物资管理部 人力资源部 设备部 财务部 工程部拷贝号1.目的规范并指导理化检验方法学验证或确认的实施操作及其方案、报告编制、检验数据的合规性。

2.适用范围适用于已有国家标准的质量标准研究即仿制药质量标准理化检验方法确认或方法转移确认、国内无上市品种的质量标准研究即创新药质量标准理化检验方法验证，包括法定标准提升即版本更换需要理化检验方法学确认。

3.引用文献、资料中国药典2015版四部9101药品质量标准分析方法验证指导原则制药工艺验证实施手册（化学工业出版社出版，何国强主编）4.职责人员职责验证部负责验证资料管理、验证或确认方案及其报告的合规审核。

质量保证部负责审核本文件内容、验证或确认方案及其报告的合规审核。

研发部负责研发品种的质量标准即理化检验方法的验证或确认的起草、实施质量控制部负责实施方法学验证或确认。

5.定义5.1.标准分析方法：指法定分析方法，如药典（如USP、EP等）或部颁标准方法。

5.2.非标准分析方法：指新建立的分析方法或变更后的分析方法。

5.3.方法验证：指实验室通过实验设计和测试，证明被验证的方法（未被收载法定标准）适用于该方法拟定的检测用途。

5.4.方法确认：指实验室对法定分析方法或药典分析方法进行确认，证明该方法适用于被测样品的分析。

5.5.方法转移：指分析方法建立机构建立分析方法并经过验证后，转移到其他检测机构（分析方法接收机构），方法接收机构为了成功的运行该分析方法而进行的分析方法转移确认，如国家检测机构进行的进口药品标准复核工作。