blast验证引物教程1

图解blast 验证引物教程——以文献报道的人类的ABCG2的引物为例1、 进入网页：/BLAST/2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项3、 完成2操作后就进入了Basic Local Alignment Search Tool 界面 （1）在Enter Query Sequence 栏中输入引物序列：注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’简便的做法是同时输入上下游引物。

输入上下游引物系列都从5’— 3’。

输入上游引物后，加上≥20个字母n ，再输入下游引物，如下图：生 物 秀（2）在Choose Search Set 栏中：Database 根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript或Others (nr etc.)。

本人倾向于选后者，觉得此库信息更多。

如下图：（3）在Program Selection 中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：（4）在此界面最下面：如下图生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mShow results in a new window 项是显示界面的形式，可选可不选，在此我们选上了。

关键要点击Algorithm parameters 参数设置，进入参数设置界面。

4. 参数设置：（1）在General Parameters 中：Expect thresshold 期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size 的下拉框将数字改为7。

如下图：（2）Scoring Parameters 无须修改（3）Filters and Masking 中，一般来说也没有必要改5．点击最下面一栏的BLAST 按钮，如图：6.点击BLAST 按钮后，跳转出现如下界面：7. 等待若干秒之后，自动跳转出现显示BLAST 结果的网页。

基于NCBI-primer blast的引物
设计及验证
流程
01 02引物的设计（已知模板设计引物）
引物的验证（已知引物查找模板/验证参数）
1-primer blast中引物的设计——模板
可以放序列：
如
也可以放NM号：
如NM_001289746.2
预期引物Tm 值：最适60，无特殊要求无需更改
预期产物大小：如80-150bp
数据库来源：根据模板设置，模板是
cDNA 就选mRNA
跨外显子设置：
RT-qPCR 定量引物为避免gDNA 干扰需设置跨外显子
物种种属设置：根据模板的种属设置
1-primer blast 中引物的设计——生成引物
生成引物：点击生成10对引物，可进行选择
最大扩增子设置：可不做更改，引物设计时前面已设置过产物大小
2-primer blast中已知引物的验证——只需放入引物序列
引物序列：
待验证引物序列放
于此处，注意引物
方向
2-primer blast中已知引物的验证——设置来源和种属
待验证引物来源数据库：
即是基于cDNA（mRNA反转）
的扩增引物，还是基于
gDNA的扩增引物；如定量
则肯定选mRNA
待验证引物来源种属：
即该引物扩增的模板的种属
注：如这两项未知，可先不做选择进行验证；如得不到完全匹配的结果，再进
行更改。

2-primer blast中已知引物的验证——进行验证
验证引物：
点击即可对上述输
入的引物进行验证，
可看到包括Tm值，
扩增子大小等引物
参数。

如何用Primer-Blast设计和验证引物——日读一帖，解螺旋大V团队伴你科研路【科研热点】让你时间比别人花的少、知道的比他早！【基金专栏】国自然等各项基金独到经验见解【SCI 专栏】从开始到接收全程tips【实验技能】这么棒快告诉你老板！关注我们，为您的科研路提速今天老谈给大家推荐NCBI的一款在线工具Primer-BLAST，用于PCR的特异性引物设计和特异性检验。

推荐的指数：5颗星。

理由：操作简单，使用方便，不需要安装程序，而且和NCBI数据库已比对，不用担心特异性问题。

一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/，这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

更强大的是Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST有许多改进的功能，比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括4部分：PCR Template（模板区）, Primer Parameters （引物区）, Exon/intron selection（外显子内含子设置）和specificity check（特异性验证区）。

（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指标）又很多。

如果把BLAST 的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。

所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用，也算是BLAST的入门课程吧。

请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。

一、打开BLAST页面，http://www.ncbi.nlm.nih.go/BLAST/ 打开后如图所示：（缩略图，点击图片链接看原图）对上面这个页面进行一下必要的介绍：BLAST的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。

相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST的三条途径。

第一部分BLAST Assembled Genomes就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。

第二部分Basic BLAST包含了5个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。

第三部分Specialized BLAST是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP等等，这个时候你就需要在Specialized BLAST部分做出适当的选择了。

总之，这是一个导航页面，它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST途径。

下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST 的使用，期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。

二、点击Basic BLAST部分的nucleotide blast链接到一个新的页面。

打开后如图所示：screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=462title="Click to iew full２.JPG (849 X 613)" border=0 align=absmiddle> 介绍一下上述页面：Enter Query Sequence部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列）。

如何利用BLAST分析验证引物序列引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。

先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。

可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。

文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。

通过BLAST 验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。

如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得3种方法的搜索结果没什么区别，没仔细比较过哦！）（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。

一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、...最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。

现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。

希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以与想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。

关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。

第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。

blast引物设计流程Blast引物设计是基因组、转录组和蛋白质组研究中不可或缺的一环。

BLAST（基本局部序列比对工具）是用于在数据库中相似序列的一种工具。

它能够在数据库中找到一条或多条与查询序列相似的序列，并计算相似度分数。

利用BLAST工具进行引物设计可以帮助研究人员快速鉴定和选择目标基因、转录本或蛋白质，并进行后续实验。

下面将详细介绍BLAST引物设计的流程。

1.确定目标序列：确定要设计引物的目标序列，可以是基因组、转录组或蛋白质组中的一个特定基因、转录本或蛋白质。

2. 数据库选择：选择适当的数据库进行BLAST。

根据实际需要，可以选择不同的数据库，包括NCBI的GenBank、RefSeq、EST、非冗余蛋白质数据库等。

3.引物设计参数：根据实验需求和目标序列的特点，设置合适的引物设计参数。

参数包括引物长度、引物Tm值、引物GC含量、引物之间的距离等。

4. 引物设计工具选择：选择合适的引物设计工具进行设计。

目前有许多在线工具和软件可以进行BLAST引物设计，例如Primer-BLAST、Primer3、Geneious等。

5.引物设计：根据设置的参数和目标序列，使用选择的引物设计工具进行引物设计。

工具通常会生成多个潜在的引物序列，根据设计要求和实验条件进行筛选。

6.引物特性分析：对设计的引物进行分析，包括引物的Tm值、互补性、二聚体形成、酶切位点等。

高Tm值可增加引物与目标序列的稳定性，互补性较低可以避免二聚体的形成，酶切位点可能会影响后续实验的结果。

7.引物合成：选择合适的引物合成厂商进行引物合成。

根据实验需求，可以选择合成标记有荧光染料或其他分子的引物。

8.引物验证：将合成的引物进行验证，可以通过聚合酶链反应（PCR）或其他测序技术进行验证。

验证引物的特异性和效率，并根据需要进行优化。

9.实验应用：将验证通过的引物应用于实验中，如PCR扩增、基因表达分析、基因组重组等。

BLAST引物设计的流程如上所述，通过合理设置参数、使用适当的工具和对引物进行验证，在基因组、转录组和蛋白质组研究中可以选择出最合适的引物。

最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。

现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。

希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。

关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。

第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。

2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。