如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性

Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。

Primer-Blast可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。

跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

（2）引物（Primers ） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。

并且选择好验证的目标数据库（在specificity check 区选择）。

根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。

图解blast验证引物教程——以文献报道的人类的ABCG2的引物为例1、进入网页：/BLAST/2、点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项3、完成2操作后就进入了Basic Local Alignment Search Tool界面（1）在Enter Query Sequence栏中输入引物序列：注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’简便的做法是同时输入上下游引物。

输入上下游引物系列都从5’—3’。

输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图：（2）在Choose Search Set栏中：Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript或Others (nr etc.)。

本人倾向于选后者，觉得此库信息更多。

如下图：（3）在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：（4）在此界面最下面：如下图Show results in a new window项是显示界面的形式，可选可不选，在此我们选上了。

关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。

4. 参数设置：（1）在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size的下拉框将数字改为7。

如下图：（2）Scoring Parameters无须修改（3）Filters and Masking中，一般来说也没有必要改5．点击最下面一栏的BLAST按钮，如图：6.点击BLAST按钮后，跳转出现如下界面：7. 等待若干秒之后，自动跳转出现显示BLAST结果的网页。

该网页用三种形式来显示blast的结果。

Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。

Primer-Blast可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。

跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

（2）引物（Primers ） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。

并且选择好验证的目标数据库（在specificity check 区选择）。

根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。

【必看】使⽤Primer-Blast⽐对引物的特异性使⽤ Primer-Blast ⽐对引物的特异性什么是引物的特异性引物是⼀段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退⽕阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3末端向后进⾏DNA的合成。

引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退⽕温度不合适或引物设计不合理时，引物会结合到模板的⾮⽬标区域，从⽽导致其他⽚段的扩增。

所谓引物特异性，就是引物结合模板正确位置的能⼒，或者避免结合⾮⽬标位置的能⼒。

引物的长度、GC含量、碱基分布、Tm值等性质，均会影响其特异性。

Primer-Blast⽐对引物特异性的原理NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。

使⽤Primer-Blast进⾏⽐对，⾸先要输⼊⼀对引物序列，并选择序列所属数据库。

此时系统将在该数据库中对序列进⾏查找和对⽐，并将引物可能结合的位置进⾏记录，⼀旦结合位置处于两条链并且产物⼤⼩符合要求，系统就会将这种情况列举到结果中。

需要注意的是，结合模板的引物不仅是⼀条正向⼀条反向，也有可能是两条正向或者两条反向引物。

Primer-Blast⽐对引物特异性的步骤打开NCBI，进⼊Blast，⽹页如下：点击上图红框标记的Primer-Blast，进⼊如下界⾯，在界⾯引物序列处，将正反向引物序列粘贴进去，5-3⽅向。

产物⼤⼩默认为70~1000，可以根据实际情况进⾏调整。

选择相应的物种和参考数据库。

⾸先，要确保Specificity check⼀栏中已经打勾。

Search mode⼀般选择Automatic即可。

物种：⼈源的基因选择Homo sapiens(taxid:9606)；⼩⿏的选择Mus musculus (taxid:10090)；⼤⿏的选择Rattus norvegicus(taxid:10116)。

参考数据库：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反转录后得到cDNA就选择Refseq mRNA（针对mRNA）或Refseq RNA（针对mRNA和lncRNA）；若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。

引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。

并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。

根据需要可设置产物的大小，Tm值等。

特异性（Specificity）在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。

这一步是比较重要的。

这里提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。

前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。

特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和rice。

Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。

实例分析用人尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。

UNG1的序列长一点（NM_003362），UNG2的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列ClustalW一下就可以了）。

这里用UNG2的序列设计引物，选择RefSeq mRNA database，物种是Human，其它默认。

结果如下图A-B所示，设计的引物只能扩增出UNG2。

如何⽤Primer-Blast设计和验证引物——⽇读⼀帖，解螺旋⼤V团队伴你科研路【科研热点】让你时间⽐别⼈花的少、知道的⽐他早！【基⾦专栏】国⾃然等各项基⾦独到经验见解【SCI 专栏】从开始到接收全程tips【实验技能】这么棒快告诉你⽼板！　关注我们，为您的科研路提速 今天⽼谈给⼤家推荐NCBI的⼀款在线⼯具Primer-BLAST，⽤于PCR的特异性引物设计和特异性检验。

推荐的指数：5颗星。

理由：操作简单，使⽤⽅便，不需要安装程序，⽽且和NCBI数据库已⽐对，不⽤担⼼特异性问题。

理由：⼀、Primer-BLAST介绍 Primer-BLAST可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接⽤下⾯的链接进⼊：/tools/primer-blast/，这个⼯具整合了⽬前流⾏的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进⾏引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了⽤另⼀个站点或⼯具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接⽤Blast进⾏引物特异性验证。

更强⼤的是Primer-BLAST能设计出只扩增某⼀特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST有许多改进的功能，⽐单个的⽤Primer3和NCBI BLAST更加准确。

⼆、Primer-BLAST的输⼊ Primer-BLAST界⾯包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界⾯主要包括4部分：PCR Template（模板区）, Primer Parameters（引物区）, Exon/intron selection（外显⼦内含⼦设置）和specificity check（特异性验证区）。

（1）模板（Template） 在“PCR Template”下⾯的⽂本框，输⼊⽬标模板的序列，FASTA格式或直接⽤Accession Number。

如果你在这⾥输⼊了序列，是⽤于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输⼊的序列设计特异性引物，并且在⽬标数据库（在specificity check区选择）是唯⼀的。

如何用Primer-Blast设计和验证引物——日读一帖，解螺旋大V团队伴你科研路【科研热点】让你时间比别人花的少、知道的比他早！【基金专栏】国自然等各项基金独到经验见解【SCI 专栏】从开始到接收全程tips【实验技能】这么棒快告诉你老板！关注我们，为您的科研路提速今天老谈给大家推荐NCBI的一款在线工具Primer-BLAST，用于PCR的特异性引物设计和特异性检验。

推荐的指数：5颗星。

理由：操作简单，使用方便，不需要安装程序，而且和NCBI数据库已比对，不用担心特异性问题。

一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/，这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

更强大的是Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST有许多改进的功能，比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括4部分：PCR Template（模板区）, Primer Parameters （引物区）, Exon/intron selection（外显子内含子设置）和specificity check（特异性验证区）。

（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-Blast介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。

Primer-BLAST可以直接从Blast主页（）找到，或是直接用下面的链接进入：这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。

Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。

跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。

如何利用BLAST分析验证引物序列引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。

先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。

可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。

文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。

通过BLAST 验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。

如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得3种方法的搜索结果没什么区别，没仔细比较过哦！）（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。

Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。

Primer-Blast可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。

并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。

提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。

跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

（1）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。

如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。

Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

（2）引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。

可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。

并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。

根据需要可设置产物的大小，Tm值等。