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铜绿假单胞菌整合子与多重耐药性研究【摘要】目的在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。
方法用vitek-ams微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用pcr方法扩增i类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。
结果 158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。
1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率。
携带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%（33/48），明显高于1类整合子阴性菌株（28.6%），p整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可以捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药[1]给临床治疗带来极大的困难。
整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌耐药性的发展，是细菌多重耐药性强化的根本因素。
结合整合酶的特点，将其分成六种[2]分析临床的菌株最常见的是1类合子。
这种整合子的基本结构包括三方面内容，两端是规整的序列，一般叫做5’cs和3’cs，5’cs 和3’cs之间为可变区，可变区包括单个或多个外部的基因构成[3]。
通过整合酶的作用，结合主要系统内容融合外部耐药金银，使得耐药基因不断发展，提升器细菌本书呢的耐药和多重耐药性。
目前在1类整合子中发现的基因盒已超过80种，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床抗生素耐药。
我院铜绿假单胞菌占致病菌分离菌的第一位，高达两成以上，它是引发下呼吸道感染以及伤口感染的重要原因，另外其对多种抗生素具有耐药性，经常会引发感染，更可能会形成局部铜绿假单胞菌，是目前临床医学的重要研究内容，这和铜绿假单胞菌复杂的耐药机制有很大的关系[1]。
研究细菌整合子的耐药基因种类和表达，可以有效提升对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解。
铜绿假单胞菌作为医院感染的重要的条件致病菌，在长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后的病人易导致本菌感染，该菌常常具有多重耐药的特点，因此其所造成的感染难以治愈，病死率高。
・９８４・整合子与鲍曼不动杆菌多重耐药机制研究进展唐吉斌ｈ（综述），宋有良２（审校）（安徽省铜陵市人民医院‘检验科，２感染科．安徽铜陵２４４００９）中田分类号：Ｒ９６．１文献标识码：Ａ文章编号：１００６－２０８４（２００９）０７－０９８４－０４摘要：鲍曼不动杆菌是一种不发酵葡萄糖的革兰阴性球杆菌，是重要的条件致病菌，常引起医院内感染。
随着临床上广谱抗茵药物的大量应用，出现了多重耐药菌株，该菌引起的院内感染并有逐年上升趋势，给临床抗感染化疗提出了严峻的挑战。
整合子．基因盒系统能捕获外来耐药基因，在整合子中形成多种酎药基因的组合和排列，是细菌耐药性播散的机制之一，对细菌基因组的进化具有重要意义。
现就整合子－基因金的结构、表达以及与鲍曼不动抗菌多重耐药的关系进行简要综述。
关键词：整合子；基因盒；鲍曼不动抗菌；耐药性Ａｄｖ柚ｃｅｉｎＭｅｄｍｍｌｓｍｓｏｆＡｎｔｉｍｌｃｒｏｂｌａｌＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｆｏｒＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒＢａｕｍａｎｎｉｉａｎｄＩｎｔｅｇｒｏｍ烈＾ｒＧ＾一６删。
ＳＯＮＧＹｏｕ－ｆ函，矿．（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｔｏｎ＃ｉｎｇＰｅｏｐｌｅ’５Ｈｏ印ｉｍｌ。
Ｔｏｎｇｌｉｎｇ２４４００９．吼ｉｎａ）Ａｂｓｔｌ哺ｃｔ：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉｉｓａｇｈｃｏ∞．ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｇｒａｍ．ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ＩｔｉＳａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｔｈａｔｏｆｔｅｎｃａｕｓｅｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｕｓｅｏｆｂｒｏａｄ—ｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｔｉ－ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｃｌｉｎｉｃｈａｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏｔｈｅｅｍｅｒｇｅｎｃｅａｎｄｙｅａｒｌｙｉｎｃｌ＇ａｇｅｉｎｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｍｕｌｔｉ—ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｔｈａｓｂｅｃｏｍｅａｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｏａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔｅｇｒｏｎ－ｇｅｎｅｃａｓｓｅｔｔｅｓｓｙｓ－ｔｅｍｈａｓｗｉｄｅｌｙｅｘｉｓｔｅｄｉｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓａｎｄｉｎｔｅｇｒｏｎｓｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｓｔｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｎｅｅｄｆｏｒｃｏｎｔｉｎｕｅｄｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｏｆｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｔｈｅａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｃａｒｒｉｅｒｓｔｏｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ－ｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｇｒｕｎｓ．ｇｅｎｅｃａｓｓｅｔｔｅｓａｎｄｅｌｕｃｉｄａｔｅｔｈｅｓｔａｔｕｓｏｆｃａｓｓｅｔｔ∞ａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｓｓａｇｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｎｔｅｇｒｏｎｓ；Ｇｅｎｅｃａｓｓｅｔｔｅｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｅｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｂａｃｔｔｅｒｉａ鲍曼不动杆菌是医院感染重要条件致病菌。
多重耐药铜绿假单胞菌整合子中发现2种新基因盒组合形式黄靖宇;吴爱武;陈林兴;郑磊;王鹏鲲;陈晓东【摘要】目的研究多重耐药铜绿假单胞菌携带整合子的类型及耐药基因组合.方法PCR检测多重耐药铜绿假单胞菌整合酶基因intI、intI2、intI3,Ⅰ类整合子恒定区基因qacE△ l-sull及可变区基因,扩增产物经胶回收、限制性片段长度多态性(RFLP)分析及基因测序分析.结果 30株临床分离铜绿假单胞菌中16株(53.3％)Ⅰ类整合酶基因及恒定区qacF△I-sul1基因扩增阳性,未检出Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因.Ⅰ类整合子可变区共检出5种不同的耐药基因组合形式,含有对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类抗菌药耐药的基因,其中有2种为新型基因盒组合形式,包括aacA4-VIM2和aadA2-OXA10-aacA4-blaIMP-9-aatI1,GenBank登录号分别为GQ890658和GU122165,另外3种与GenBank登录号分别为FJ917747、FJ817423、GU367339的序列基本吻合.结论多重耐药铜绿假单胞菌携带的整合子主要为Ⅰ类整合子,在Ⅰ类整合子上首次发现2种新型基因盒组合形式.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2012(030)005【总页数】4页(P327-330)【关键词】整合子;铜绿假单胞菌;多重耐药;基因盒【作者】黄靖宇;吴爱武;陈林兴;郑磊;王鹏鲲;陈晓东【作者单位】汕头大学医学院第二附属医院检验科,广东汕头515041;广州医学院第一附属医院检验科,广州510120;汕头大学医学院第二附属医院检验科,广东汕头515041;南方医科大学南方医院检验科,广州510515;广州医学院第一附属医院检验科,广州510120;汕头大学医学院第二附属医院检验科,广东汕头515041【正文语种】中文【中图分类】R446.5铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, Pa)是院内感染的重要病原菌之一，耐药机制复杂。
多重耐药菌的名词解释随着抗生素的普遍使用，多重耐药菌成为了全球医疗领域面临的严峻问题。
多重耐药性是指细菌或病原体对多种不同类型的抗生素产生耐药性，使得这些药物对细菌的杀菌作用完全或部分失效。
本文将对多重耐药菌进行名词解释，以期提高公众对此重要领域的了解。
1. 多重耐药菌多重耐药菌是指细菌表达了对多种不同类别的抗生素的耐药性。
这些菌株可以抵抗常规治疗所使用的广谱抗生素，包括青霉素、头孢菌素、四环素、氨基糖苷类和喹诺酮类等。
多重耐药菌在降低抗生素治疗效果的同时，还增加了治疗的时间和成本，并可能导致治疗失败、病情加重甚至死亡。
2. 耐药性机制多重耐药菌的耐药性主要是通过多种机制实现的。
其中最常见的机制是基因突变和横向基因转移。
基因突变是指细菌基因发生突变，导致抗生素无法结合细菌的靶位点，从而抑制了抗生素的杀菌作用。
横向基因转移是指细菌之间传递耐药基因的过程，细菌通过质粒、转座子等载体，将耐药基因传递给其他细菌种群，加速了抗药性的传播。
3. 超级细菌超级细菌是一种特殊类型的多重耐药菌，具有非常强大的耐药性。
一般来说，超级细菌的耐药谱覆盖了目前已知的各类抗生素，包括最后一线的抗生素。
这些细菌常见于医疗环境中，如医院和养老院，对患者的健康安全构成了严重威胁。
超级细菌的产生主要是由于在抗生素应用过程中的滥用和过度使用，以及未能有效控制感染传播。
4. 脆性细菌和可利用细菌除了多重耐药菌和超级细菌之外，还有两个相关的概念：脆性细菌和可利用细菌。
脆性细菌是指对抗生素高敏感的细菌，即便是低浓度的抗生素也能有效杀灭它们。
可利用细菌则是指对抗生素敏感且可以通过适当的治疗手段进行控制的细菌。
脆性细菌和可利用细菌在临床治疗中具有较好的治疗效果，因为它们仍对大多数现有的抗生素敏感。
5. 防控与应对针对多重耐药菌的威胁，社会各界需要共同努力，采取一系列综合性措施来进行防控和应对。
这包括加强公众教育，提高对抗生素合理使用的认知；改善医疗机构的感染控制措施，减少细菌社区传播；鼓励研究和开发新型抗生素，以及推广特定领域的靶向治疗方法等。
细菌多重耐药性的转移与基因盒-整合子系统y杜艳综述;陈端审校(昆明医学院第一附属医院检验科,昆明650032)摘要:细菌的多重耐药已成为临床治疗的难题,近年来耐药基因转移的新机制与基因盒-整合子系统密切相关。
本文就该系统的发展历史、整合子的结构与分类、基因盒的种类与表达、基因盒-整合子的检测方法及其多重耐药性传递的相关性作一全面阐述。
关键词:多重耐药;转移;基因盒-整合子分类号:R379文献标识码:A文章编号:1005-5673(2004)02-0068-04多重耐药(Multidrug resistance,MDR)可由染色体上多重耐药决定簇或基因突变介导;也可由识别耐药基因或水平转移的一组耐药基因而发展形成。
这种耐药基因的扩散已引起临床抗生素耐药菌株的快速出现。
传统认为耐药基因通过质粒、转座子传递;近年来有关抗生素耐药机制还涉及整台子(Inte-gron)基因结构的存在112。
耐药基因能通过位点特异性重组插入质粒和转座子,即传递的另一种机制为基因盒-整合子系统。
本文就该系统的发展历史、整合子的结构与分类、基因盒的种类与表达、基因盒-整合子的检测方法及与多重耐药性传递的相关性进行详述。
1历史20世纪60年代抗生素的广泛使用,人和动物源的病原菌逐渐对许多抗生素产生耐药。
80年代初,发现不同抗菌耐药基因位于独立而不相关的质粒或转座子的同一位置。
后来认为这些基因可能整合于某一结构的同一位点。
1991年Hall对转座子Tn7上不同耐药基因的分析,提出了基因盒-整合子系统的概念122。
整合子在革兰阴性菌多重耐药的传播中发挥重要作用,最近在革兰阳性菌中也见报道132。
2整合子的结构与分类整合子是保守、可移动的转座子样DNA元件,能捕获和整合耐药基因,形成巨大的多基因座(loci)。
整合子包括两端的高度保守片段(Conserved segment,CS)和中间的可变区(Variable region)。
整合子由DNA整合酶基因(int)和2个重组位点attI和attC组成。
Int位于5c-末端,属于酪氨酸整合酶家族,催化基因盒在aatI和attC上的整合及切除;5c-保守区还有基因转录的启动子;3c-保守区则因整合子类型不同而异。
根据整合酶基因的结构与功能可分为4类整合子。
1类最常见,结构类似于缺陷型转座子,5c-端有编码整合酶的基因intI及一个增强启动子Pant或使插入基因盒表达的启动子P2;3c-端有3个开放读码框(ORF):磺胺类耐药基因su-l1;对消毒剂和防腐剂的耐受基因qacE v1及功能不明的ORF5。
据报道欧洲医院内肠杆菌科分离株中,1类整合子中最常见三种DNA插入片段(800、1000和1500bp)142。
2类位于Tn7转座子及其衍生物左端,3c-端含5个tns基因,与转座子移动有关。
intl2是缺陷的intI 基因,其产物与intI1有40%同一性。
编码整合酶基因含保守的终止密码子,可见于大肠埃希菌和沙门菌152。
而在多重耐药的末内志贺菌中也检测到2类整合子(Tn7)162。
另有报道还存在一种嵌合整合子,表明自然界中可能发生1、2类整合子间的重组172。
3类携带有编码B-内酰胺酶的基因盒bal CI MP,整合酶基因位于5c端,与intI1有61%相同。
Goldstein 等在兽医分离物中检测到3类整合酶152。
4类又称为超级整合子,远大于传统整合子。
整合酶也有位点特异性重组活性及类似59碱基单元(Base ele ment以下简写成be)结构,含100多种基因盒,是一种新型霍乱弧菌基因组中的整合子,与抗y收稿日期:2003-10-27;修回日期:2003-12-22作者简介:杜艳(1974-),女,硕士,现攻读四川大学华西基础医学与法医学院博士研究生,主要从事临床细菌学检验及细菌耐药机制的研究。
生素耐药无关,编码生化功能或毒力182。
这种基因获得机制在细菌基因演化中比以前认为的影响大得多,而且演化中多组分系统很可能出现在抗生素时代之前。
最近假单胞菌中发现的In55044被认为介于多重耐药整合子与霍乱弧菌超级整合子之间192。
3基因盒的种类与结构基因盒(Gene cassette)是小的可移动DNA分子,含基因编码区和3c端59碱基单元的重组位点。
59be由整合酶识别,在attI插入基因盒,attI是邻近整合酶基因的独立整合酶识别位点。
已确定60多个基因盒,编码对氨基糖甙类、青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、磺胺及其增效剂、氯霉素、利福平、红霉素和四价铵化合物等的耐药性。
59be的长度从57到141个碱基不等,含1个60bp共同序列(Consensus sequences)的不完全倒转重复序列,一旦转录RNA能形成茎-环结构;该结构也参与基因盒的移动。
1个整合子可捕获1个或多个基因盒,被捕获的基因盒5c-端与attI结合,3c-端的59be结构与aatC发生位点特异性重组。
常见以下几类:aad基因:编码氨基糖甙类的耐药性。
已发现15种能传递不同耐药性。
铜绿假单胞菌多重耐药株中发现的aac A29b属于1类整合子。
AAC(6c)-29b 能因紧密接合隔绝药物,而介导药物抗性1102。
dfr基因:编码甲氧磺胺嘧啶类的耐药。
肠道细菌中已发现16种二氢叶酸还原酶基因(dhfr),大多以基因盒插入1、2类整合子,尤以高频插入到含su-l 1的1类整合子中。
有报道含dfrVII的整合子可能来源于Inc HI1质粒1112。
编码B-内酰胺酶和超广谱B-内酰胺酶ESBL的基因:这类基因发现得越来越多。
IB C-1是一种新的A类ESB L,能水解复达辛和头孢呋辛,被他唑巴坦、克拉维酸和泰能抑制1122。
IB C-2是IBC-1和GES-1的突变体,与这些B-内酰胺酶仅一个氨基酸不同1132。
Nass T等发现一奇异变性杆菌Li-l1分离株对头孢菌素耐药,且头孢菌素与克拉维酸有明显协同并伴随头孢西丁和头孢呋辛的协同;PCR分析存在bla VE B-1基因1142。
从意大利南部胃肠炎病人分离的6株散在肠炎沙门菌,5株产SHV-12,1株编码C 类B-内酰胺酶。
Bla SHV-12位于两种不同的自我可转移质粒上,其中之一可能携带新的1类整合子1152。
其它基因盒:cat编码对氯霉素的耐药性;aac编码对氨基糖苷类的耐药性,如Mark等用PCR对所有耐药株进行筛分,发现编码氨基糖苷修饰酶的基因aadA、aadB和aac A7,作为基因盒插入某些整合子内1162;oxa编码对苯唑西林的耐药性,如OXA-20是一种克拉维酸抑制的限制性苯唑西林酶,其转译起始密码子为细菌中少见的TTG。
oxa20的表达可能在转录、转译起始信号和插入位置的基础上都相当低;aar编码对利福平耐药;ere编码对红霉素耐药。
4基因盒的表达绝大多数基因盒本身无启动子,以相同方向插入时基因的表达主要依靠上游5c端共同启动子P1。
已知3种P1,和共同序列相比-35和-10序列有不同的结合。
它们是TTGACAN17TAAAC T(强启动子), TGGACAN17TAAGC T(弱启动子)和TGGAC AN17 TAAACT(杂合启动子)。
这些序列的变化可能是基因表达调控的粗略机制。
此外,在P1启动子119碱基下游插入鸟三苷,产生下游的第二弱启动子,导致转录的第二起始点,增强了插入基因盒的表达。
少数整合子还有P2启动子,位于Pant的下游,属强启动子。
尽管启动子的多样性、质粒拷贝数和其它内源启动子的存在会影响表达,但邻近共同启动子P1的基因都能高效表达。
因为整合子插入基因盒的耐药基因表达,受插入位置的影响;任一特异基因盒介导的耐药水平当其位置邻近P1时最高;当位于一个或多个其它基因盒下游时会下降;抗生素耐药的精确度取决于上游基因盒的数目和性质。
高效基因捕获和表达系统合并耐药基因的垂直传播和水平传播,成为细菌抵抗抗生素药效的一个强有力武器。
处于弱启动子下或基因盒队列下游的耐药基因在抗生素选择下,可借助整合酶介导的基因重组,插入到强启动子下或靠近P1,由低水平转为高效表达,其耐药水平随之增强。
5基因盒-整合子系统的检测迄今,最常见的检测方法是多聚酶链式反应(PC R)技术。
White等用针对1、2和3类整合酶基因保守区变性的引物,PC R扩增检测肠杆菌科尿道分离物的整合子,发现120株有59株检测到1类和12株检测到2类整合子;未检测到3类整合子1172。
Koeleman Johannes GM等用两种PCR方法调查48株不动杆菌菌株中整合子的存在情况1182:整合子PCR 可产生假阴性结果,因为插入基因可超过PC R延伸量,DNA产物最大量为< 2.5kb;菌株可能为无基因盒的整合子;2类整合子5c保守区不含su-l1基因。
而整合酶基因检测是扩增特异的小产物,比整合子PCR更敏感。
另还见一种通过扩增整合子5c末端短小保守序列的实时(Rea-l time)PCR快速筛选技术,比传统方法更敏感和特异;该技术在现研究中携带整合子的临床菌种间未见交叉反应1192。
Bass L等根据整合子及常见基因盒设计引物或探针,地高辛标记后与转入尼龙膜的待检菌株基因组DNA酶切片段作DNA-DNA杂交(Southern或Colony),判断整合子及相应基因盒的存在,发现1类整合子标志物intI1和qacE v1的阳性率为63%;intI1、qacE v1和aadA1的阳性率为50%1202。
也有学者将整合子已知位点的酶切片段克隆到质粒上,获得的重组体用于对整合子的各基因盒进行分析1212。
6与多重耐药传递的相关性革兰阴性菌的多重耐药似乎是由于水平转移获得耐药基因。
有学者选整合子为转移标志物,在不同收集时间的同一基因型分离物具不同的整合子,提示整合子的获得与丢失;携带多菌种的几个病人具同一整合子,可能是由于病人整合子的种间转移;菌株的接合试验导致高频率完全耐药形式的转移1222。
整合子是稳定的,基因盒的重组可发生在特异位点(59be)和次级重组位点之间;整合到次级位点时,如靶位附近存在适当启动子就可表达,否则为沉默基因。
这种重组发生率极低,但对耐药基因的传播及质粒和细菌基因组的演化仍有意义。
耐药基因的水平传播导致临床细菌产生耐药性,而移动性的基因盒一部分加速基因的传播。
游离基因盒被整合子捕获后得到表达,产生耐药性。
携带重组基因盒的整合子插入到转座子或接合性质粒中,负责耐药性在不同菌种间的传播。
阴沟肠杆菌临床菌株中可见位于多重耐药可转移质粒上的整合子,内酰胺选择性压力有利于这些基因的传播1122。
多重耐药性与整合子相关而与菌种或来源无关;对磺胺、磺胺增效剂、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林、哌拉西林和头孢呋辛的耐药预示整合子的存在;对氨苄西林和磺胺-磺胺增效剂的联合耐药是发展为耐其它B-内酰胺酶、氨基糖甙类、头孢菌素类和环丙沙星的起点;也增强了整合子的流行和传播。
