第7章细菌耐药性检测

检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。

（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。

苯唑西林纸片，1μg/片，检测MRS平板应置于35℃（而不是37℃）孵育24h（而不是16～18h）。

结果判断：金黄色葡萄球菌：S：≥13mm；I：11～12mm；R:≤10mm。

凝固酶阴性葡萄球菌：S：≥18mm；R≤17mm。

对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。

2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6μg/ml苯唑西林+4%NaCl，调整菌液浓度0.5McFarland，于35℃孵育24h，凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。

（二）MRS监测意义对于MRS，应报告对所有头孢菌素类和其他β-内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10～23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。

二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头孢菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。

2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。

药敏纸片：庆大霉素：120μg/片；链霉素300μg/片结果判断：R：≤6mm；I：7～9mm；S：≥10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：≥500μg/ml；链霉素：R：2000μg/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30μg/片，检测平皿置35℃24h（而不是16～18h），并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。

第七章-细菌耐药性检测一教学大纲要求1.临床常用抗菌药物2.抗菌药物敏感试验3.细菌的耐药性和产生机制4.细菌的耐药性检查5.厌氧菌、真菌及分支杆菌体外药敏试验二教材内容精要㈠、抗菌药物1. 青霉素类青霉素类抗生素是具有内酰胺环的一类抗生素。

作用机制为抑制细菌细胞壁的合成。

种类包括青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、美西林等。

2. 头孢菌素类第一代头孢菌素类对革兰阳性细菌（包括青霉素敏感或耐受的葡萄球菌）的抗菌活性较第二、三代强。

常用品种包括头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢硫咪等。

第二代头孢菌素对革兰阳性细菌的活性与第一代相似或略差，对多数革兰阴性细菌的抗菌活性较强，但对铜绿假单胞菌无抗菌活性。

对β-内酰胺酶较稳定，主要包括头孢克洛、头孢夫辛、头孢夫辛酯、头孢孟多等。

第三代头孢菌素对革兰阳性菌的抗菌活性不如第一、二代，对革兰阴性细菌有较强的抗菌活性。

对第一、二代头孢菌素耐药菌也较敏感。

但是其抗革兰阳性细菌的活性仍然较弱。

对β-内酰胺酶有较强的稳定，组织穿透力较弱，半衰期较长。

主要包括头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮、头孢妥伦匹酯、头孢唑肟、头孢地嗪、头孢他美酯、头孢美唑、头孢泊肟酯、头孢克肟等。

第四代头孢菌素与第三代相比，抗菌谱更广泛。

对革兰阳性球菌的抗菌活性增强，对β-内酰胺酶更稳定。

因此，对革兰阴性细菌的抗菌活性仍然较强。

主要包括头孢吡肟、头孢匹罗等。

3. 碳青霉烯类碳青霉烯类为一组新型β-内酰胺类抗生素，超广谱高效能抗菌作用，对革兰阴性细菌、阴性细菌、需氧菌、厌氧菌均有很强的抗菌活性，对β-内酰胺酶稳定。

有亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等。

4.头霉素类cephamycins包括头孢西丁、头孢美唑、头孢替坦、头孢米诺等。

抗菌谱广，对革兰阴性菌、阳性菌、厌氧菌及需氧菌均有较强的活性，对质粒或染色体介导的β-内酰胺酶具有高度稳定性。

为了研究细菌耐药性及其产生机制，本实验选取金黄色葡萄球菌作为研究对象，通过体外实验探究阿莫西林克拉维酸钾对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度（MBC）和最小抑菌浓度（MIC）的影响，并分析其耐药性产生的原因。

二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC292132. 抗菌药物：阿莫西林克拉维酸钾3. 培养基：营养肉汤、营养琼脂4. 仪器设备：全自动微生物药敏鉴定仪、微量稀释器、恒温培养箱、移液器、离心机等三、实验方法1. 菌株活化：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213接种于营养肉汤中，37℃恒温培养18-24小时，待菌液浓度达到1×10^8 CFU/mL时，用于后续实验。

2. MBC测定：采用微量稀释法，将阿莫西林克拉维酸钾药物浓度梯度稀释至1/2MIC，将活化后的金黄色葡萄球菌菌液按1:100的比例加入至稀释后的药物中，混匀后置于恒温培养箱中培养24小时，观察细菌生长情况，以无菌生长的最低药物浓度为MBC。

3. MIC测定：采用微量稀释法，将阿莫西林克拉维酸钾药物浓度梯度稀释至1/2MIC，将活化后的金黄色葡萄球菌菌液按1:100的比例加入至稀释后的药物中，混匀后置于恒温培养箱中培养24小时，观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

4. 耐药性分析：将金黄色葡萄球菌进行多步体外诱导试验，观察其在阿莫西林克拉维酸钾作用下耐药性的变化。

四、实验结果1. MBC和MIC测定结果：金黄色葡萄球菌对阿莫西林克拉维酸钾的MBC为16μg/mL，MIC为8μg/mL。

2. 耐药性分析结果：经过34天诱导后，金黄色葡萄球菌对阿莫西林克拉维酸钾的耐药性明显增强，MBC值是标准菌株MBC值的32倍。

1. 本实验结果显示，金黄色葡萄球菌对阿莫西林克拉维酸钾的耐药性随诱导时间的延长而逐渐增强，这可能与细菌产生的β-内酰胺酶有关。

β-内酰胺酶是一种能够水解β-内酰胺类抗生素的酶，导致药物失活，从而产生耐药性。

细菌耐药性监测和防控管理制度第一章总则第一条目的和依据1.为了保障医院医疗质量，有效监测和防控细菌耐药性的传播和扩散，订立本规章制度。

2.本制度依据《中华人民共和国传染病防治法》《中华人民共和国医疗机构条例》等相关法律法规。

第二条适用范围1.本制度适用于医院内全部科室、各级医务人员、护理人员等相关人员。

2.各科室依据本制度的要求，订立符合本科室特点的相关管理方法和操作规程。

第三条定义1.细菌耐药性：指细菌对抗生素或其他药物产生的抗药物性。

2.监测：指对细菌耐药性进行系统、长期的监测和评估。

3.防控：指对细菌耐药性的传播和扩散采取各种措施，包含防备、监测、隔离、教育、培训等。

第二章细菌耐药性监测和评估第四条细菌耐药性监测和评估的目的1.确定医院细菌耐药性的流行情况和趋势。

2.发现和监测细菌的变异和新显现的耐药性。

3.评估细菌耐药性对患者治疗和医院感染掌控的影响。

第五条细菌耐药性监测和评估的内容1.对呼吸系统、消化系统、泌尿系统、血液系统、皮肤和软组织等科室常见感染细菌的耐药性进行监测。

2.对每一批次进货的抗生素进行抽样检测。

3.对医院内患者的细菌耐药性进行监测，并将监测结果报送给医疗质量管理部门和临床科室。

第六条细菌耐药性监测和评估的方法1.手记标本：依据不同感染部位和病情，选择合适的标本进行手记。

2.分别培养：对手记的标本进行细菌分别和培养，并进行鉴定。

3.药敏试验：对培养的细菌进行药敏试验，确定其对不同抗生素的敏感性和耐药性。

4.数据统计和分析：对检测结果进行统计和分析，形成监测报告。

第三章细菌耐药性防控第七条医院细菌耐药性防控的原则1.提高医务人员的感染掌控和手卫生意识。

2.合理使用抗生素，避开滥用和过度使用。

3.定期培训和教育医务人员，提高细菌耐药性防控知识和技能。

第八条感染防备与掌控1.严格执行无菌操作规范，避开交叉感染。

2.加强医疗废物管理，确保废物的正确处理，防止感染扩散。

第九条手卫生1.医务人员在接触患者前后必需进行手卫生。

细菌耐药监测制度第一章总则第一条为了提高细菌耐药性监测的科学性、有效性和规范性，保障患者的医疗安全和公共卫生，订立本规章制度。

第二条本制度适用于本医院全部临床科室、医技科室以及临床研究单位。

第三条细菌耐药性监测是指对不同类型的细菌在不同人群中的耐药性情况进行监测分析的工作。

第四条细菌耐药性监测的目的是及时掌握细菌耐药性的变动趋势，为合理使用抗生素、订立感染掌控措施和改进治疗供应科学依据。

第二章细菌耐药性监测的对象第五条细菌耐药性监测的对象包含但不限于以下几类细菌：1.革兰阳性菌：如金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌等；2.革兰阴性菌：如大肠杆菌、产气荚膜梭菌、克雷伯菌等；3.难以培养的非典型菌：如结核分枝杆菌、麻风杆菌等。

第三章细菌耐药性监测的内容与方法第六条细菌耐药性监测的内容包含以下几方面：1.细菌的种类和数量；2.细菌对不同抗生素的耐药性；3.细菌耐药性的变动趋势；4.细菌耐药性相关的流行病学特征。

第七条细菌耐药性监测的方法包含以下几种：1.手记标本：依据不同疾病和临床需要，手记相应的标本，如血液、尿液、呼吸道分泌物等；2.细菌培养与分别：将标本作无菌处理后，进行培养分别，得到纯种细菌菌株；3.抗生素敏感试验：对不同细菌菌株进行抗生素敏感试验，获得耐药性数据；4.统计分析与报告：对细菌耐药性数据进行统计分析，编制监测报告，及时通报相关科室和管理部门。

第四章细菌耐药性监测的管理第八条细菌耐药性监测的责任主体为医院感染掌控科。

第九条医院感染掌控科的职责包含但不限于以下几方面：1.负责组织和实施细菌耐药性监测工作；2.统筹协调各临床科室和医技科室的合作，确保监测工作的顺利进行；3.订立和修订细菌耐药性监测工作流程和操作规范，保证工作的质量和规范；4.对监测结果进行分析和解读，供应科学依据和建议，引导临床用药和感染掌控工作；5.定期向医院领导和相关部门报告监测结果，及时通报紧要的细菌耐药性情况。

第十条各临床科室和医技科室的职责包含但不限于以下几方面：1.搭配医院感染掌控科的工作，按要求进行标本手记和数据录入；2.及时向医院感染掌控科报告细菌耐药性相关信息，如感染病例、抗生素使用情况等；3.搭配医院感染掌控科的要求，参加细菌耐药性监测结果的分析和讨论，并接受相关建议。

一、实验名称细菌耐药性检测二、实验日期2024年3月15日三、实验目的1. 了解细菌耐药性检测的基本原理和方法。

2. 掌握抗生素纸片扩散法检测细菌耐药性的操作步骤。

3. 分析细菌耐药性变化趋势，为临床合理用药提供参考。

四、实验原理细菌耐药性是指细菌对抗生素的抵抗能力。

通过抗生素纸片扩散法，可以检测细菌对特定抗生素的敏感性。

该方法基于细菌对抗生素的敏感程度，在纸片周围形成抑菌圈，抑菌圈的大小反映了细菌对药物的敏感程度。

五、主要仪器与试剂1. 仪器：细菌培养箱、无菌操作台、电子天平、镊子、无菌棉签、酒精灯、显微镜等。

2. 试剂：金黄色葡萄球菌标准菌株、大肠杆菌标准菌株、抗生素纸片（青霉素、头孢菌素、红霉素等）、营养琼脂平板、生理盐水、无菌水等。

六、实验步骤1. 将金黄色葡萄球菌标准菌株和大肠杆菌标准菌株分别接种于营养琼脂平板上，37℃培养24小时。

2. 在无菌操作台上，用无菌镊子将抗生素纸片贴于平板表面，注意不要重叠。

3. 将平板倒置，37℃培养24小时，观察抑菌圈的大小。

4. 记录不同抗生素纸片的抑菌圈直径，并与标准菌株的敏感度进行比较。

5. 重复上述步骤，对其他实验菌株进行耐药性检测。

七、实验结果1. 金黄色葡萄球菌对青霉素、头孢菌素、红霉素等抗生素的抑菌圈直径分别为15mm、10mm、8mm，表明金黄色葡萄球菌对青霉素敏感，对头孢菌素和红霉素具有一定的耐药性。

2. 大肠杆菌对青霉素、头孢菌素、红霉素等抗生素的抑菌圈直径分别为25mm、20mm、15mm，表明大肠杆菌对青霉素、头孢菌素和红霉素均敏感。

八、讨论分析1. 通过本次实验，我们了解到细菌耐药性检测的基本原理和方法，掌握了抗生素纸片扩散法的操作步骤。

2. 实验结果表明，金黄色葡萄球菌对青霉素敏感，对头孢菌素和红霉素具有一定的耐药性；大肠杆菌对青霉素、头孢菌素和红霉素均敏感。

3. 细菌耐药性问题是全球性的公共卫生问题，合理使用抗生素、加强耐药性监测、开发新型抗生素等措施是解决细菌耐药性问题的有效途径。

细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

(2)折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC)，而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验. （3）双纸片协同试验:双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β—内酰胺酶（4)药敏试验的仪器化和自动化:全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek—2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β—内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）.临床常用头孢硝噻吩纸片法，β—内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β—内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素(包括氨基、羧基和脲基青霉素)耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因.检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR—SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0。

细菌耐药性监测预警方案细菌耐药性是指细菌对抗生素等药物产生耐受性的能力，这给临床治疗和公共卫生带来明显的挑战。

为了及时监测和预警细菌耐药性的变化，制定细菌耐药性监测预警方案至关重要。

以下是一个700字的细菌耐药性监测预警方案。

一、监测指标：1. 细菌耐药性程度：监测各种细菌对多种抗生素的耐药性水平，包括耐受性、中介耐受性和敏感性。

2. 耐药基因检测：监测常见细菌耐药基因的分布情况，包括β-内酰胺酶、甲氧西林酶等。

二、监测对象：1. 临床分离菌株：定期从临床医院和医疗机构收集不同类型的细菌分离株，包括耐药菌株和非耐药菌株。

2. 环境样本：定期从医院、群众居住区、水源等采集环境样本，监测细菌在环境中的耐药性传播情况。

三、监测方法：1. 抗生素敏感性试验：采用标准微量稀释法或纸片扩散法，对细菌菌株进行不同抗生素的敏感性测试，确定其对抗生素的耐药性水平。

2. PCR检测：采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对细菌菌株中的耐药基因进行检测，确定其耐药基因的分布情况。

四、监测频率：1. 定期监测：每年至少进行两次细菌耐药性监测，包括对不同种类细菌的敏感性测试和耐药基因检测。

2. 需求性监测：发现疫情暴发或多发感染事件时，立即进行细菌耐药性监测，以加强对疫情的监控和控制。

五、预警机制：1. 数据分析：对监测结果进行数据汇总和统计分析，分析不同细菌耐药性的变化趋势和分布情况。

2. 预警标准：根据历史数据和国际标准，建立细菌耐药性的预警标准，当某个细菌耐药性超过预警标准时，即发出预警信号。

3. 预警通知：一旦细菌耐药性超过预警标准，立即向相关卫生部门和医疗机构发出预警通知，提醒其采取相应的措施应对。

细菌耐药性监测预警方案是保障公共卫生和临床治疗的重要措施，通过对细菌耐药性的定期监测和预警，可以及时采取相应的防控措施，避免耐药细菌的传播和扩散，从而减少耐药性感染的发生。

同时，还可以为临床治疗提供及时有效的指导，确保患者的治疗效果和生活质量。

细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如MRSA、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及β内酰胺酶中的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属β内酰胺酶等。

临床抗生素的选择使用非常困难。

因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测，对患者选择个体化的治疗方案；同时通过耐药检测及流行病学调查，为医院感染控制方案制订提供依据；也有助于新药的抗菌特性研究。

临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。

(一)药敏试验中抗菌药物的选择原则抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依据各医院院内感染控制委员会、临床医师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条件：1.选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某类菌株具有特定的意义等。

2.有助于指导临床抗感染治疗与流行病学的调查。

3.应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的抗菌药物进行体外药敏试验等。

4.根据细菌种类或来源，通常选择6～16种不同抗菌药物。

(二)选择方案在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组选择。

结合本院实际情况制定选用方案。

1.肠杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案(1)首选试验和报告的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦或阿奠西林／克拉维酸或哌拉西林／他唑巴坦或替卡西林／克拉维酸中任一种；头孢唑林或头孢噻吩、头孢呋辛或头孢孟多、头孢西丁或头孢替坦、头孢噻肟或头孢他啶或头孢曲松或头孢哌酮中任选二种；头孢吡肟或头孢匹罗；庆大霉素；环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选1～2种；亚胺培南，复方新诺明。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：呋喃妥因、氯霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。