质粒DNA的双酶切

载体双酶切技术是分子生物学领域常用的实验技术之一，它通过利用两种不同的限制性内切酶作用于同一个质粒DNA，从而实现对目标DNA片段的精确剪切和克隆。

本文将从载体双酶切技术的原理、应用和优缺点等方面进行详细介绍。

一、原理载体双酶切技术的原理主要基于两种不同的限制性内切酶对DNA的特异性切割。

首先，选择两种能够在同一质粒上切割出相互兼容的黏性末端的内切酶，并确定其最佳反应条件。

然后，将目标DNA片段与质粒进行双酶切反应，使得目标DNA片段的末端与质粒的末端具有互补的黏性末端。

最后，通过DNA连接酶的作用，将目标DNA片段与质粒连接成重组质粒，实现目标DNA片段的克隆插入。

二、应用载体双酶切技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。

首先，它可以用于重组质粒的构建，将外源基因插入到质粒中，用于基因克隆、表达和功能研究。

其次，还可以通过双酶切技术对质粒进行定向修饰，如引入点突变、插入序列或者删除特定片段等，用于研究基因的结构与功能。

此外，载体双酶切技术也被广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因组编辑等领域。

三、优缺点1. 优点（1）精准：通过双酶切技术可实现对DNA片段的精确切割和定向连接，保证了重组质粒的稳定性和可靠性。

（2）灵活：可以根据实验需要选择不同的限制性内切酶组合，实现对DNA的多样化操作。

（3）高效：相比传统的单酶切技术，载体双酶切技术能够提高DNA片段的连接效率和克隆成功率。

2. 缺点（1）操作复杂：双酶切技术需要充分考虑两种内切酶的选择、反应条件的优化及连接方法的调整，操作过程较为复杂。

（2）局限性：某些情况下可能无法找到适合的双酶切位点，导致目标DNA片段无法有效插入到质粒中。

（3）成本较高：需要购买多种限制性内切酶和连接酶，增加了实验成本。

综上所述，载体双酶切技术作为一种重要的分子生物学工具，在基因工程和分子生物学研究中发挥着重要作用。

随着技术的不断进步和完善，相信它将在更多领域展现出其巨大的潜力和价值。

质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。

酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。

限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。

酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。

首先，选择适当的限制性内切酶。

限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。

在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。

选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。

其次，进行质粒酶切。

通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。

反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。

酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。

然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。

它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。

较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。

通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。

最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。

琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。

常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。

经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。

总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。

这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。

目的基因双酶切
目的基因双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。

回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。

注意事项：1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。

2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。

铺板前后注意用吹风机吹干。

3、对照的设立:为验证双酶切是否成功，可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。

双酶切的优点是避免目的基因与质粒自环以及目的基因的反向连接。

双酶切的优点乎前是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接（任意桐团两点）检测目的基因是否表达出岁轮清产物，采用抗原一抗体杂交；从基因组文库获取的。

质粒双酶切构建经验！大神教你做酶切！1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

bamhi和ecori双酶切原理
双酶切技术是一种分子生物学技术，用于从DNA分子中特异性地剪切出目标DNA片段。

它的原理基于两个限制性内切酶的特异性切割作用，以及DNA的双链结构。

限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割DNA双链的酶。

不同的限制性内切酶具有不同的切割位点和切割方式。

双酶切技术利用两个限制性内切酶，分别在目标DNA序列的两侧切割，从而将目标DNA片段从DNA分子中剪切出来。

在双酶切实验中，首先将DNA与两种酶一起孵育，然后酶在特定序列上切割DNA，形成切割产物。

具体来说，双酶切技术的步骤如下：选择两个限制性内切酶，使它们能够在目标DNA序列的两侧切割，并且它们的切割位点不重叠。

将DNA分子与两个限制性内切酶一起反应，使它们在目标DNA序列的两侧切割。

切割后的DNA分子形成两个断裂端，其中一个断裂端是粘性的，另一个是平滑的。

将DNA分子与质粒或其他DNA分子连接，使粘性断裂端与另一个DNA分子的粘性断裂端连接，形成重组DNA 分子。

将重组DNA分子转化到宿主细胞中，使其复制和表达。

通过双酶切技术，可以将目标DNA片段插入到质粒或其他DNA分子中，用于基因克隆、基因工程、基因组编辑等研究领域。

至于BamHI和EcoRI双酶切原理可以查阅相关书籍或文献了解更多相关信息。

第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。

2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。

4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。

5. 培养实验操作规范，提高实验技能。

二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。

3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。

三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。

2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。

四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。

2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。

3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。

4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。

5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。

6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。

7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。

8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。

9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。

现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

2.纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒3.酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

实验五质粒DNA的提取与酶切地球科学学院606班宫魁六组200928006841083一、实验原理：（一）、质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。

质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行复制，并使子代细胞保持他们恒定的拷贝数。

从细胞的生存看，没有质粒存在基本上不影响细胞的存活，所以质粒是寄生性的自主复制子。

根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程技术和方法，使质粒将某种基因带入受体细胞表达它的遗传性状，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或者产生某种新的物质。

目前质粒已广泛用于DNA分子的无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构和功能的较好的模型。

质粒一般来自细菌，分离和纯化质粒DNA的方法很多，但都包括以下几个步骤，细菌的培养和质粒的扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。

在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在，在一些条件下，一条链发生一处和多处断裂则另一条链就能自由的旋转是分子内的扭曲消除形成松弛型的开环DNA分子。

加热或者碱处理虽然可以解开双链中的氢键，但随着冷却或pH恢复到中性它们又很好的复性到原来的共价闭合构形，线性DNA分子却仍然处于变性状态。

细菌裂解时常用溶菌酶和SDS或NaOH和SDS的混合物作为裂解液，使菌体充分裂解。

此时，细菌染色体DNA可以形成折叠状染色体的结构附着在细胞膜碎片上，离心时它们容易沉出。

质粒DNA存在于清液中，其中还含有可溶性蛋白质，核糖核蛋白和tRNA等，在提取过程中加入蛋白水解酶和核糖核酸酶能使它们降解。

通过碱性酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇混合液抽提，可除去蛋白质等杂质。

异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层，变性蛋白层和有机层维持稳定。

经反复抽提可得到纯度较高的质粒DNA。

（二）、限制性内切酶以双链DNA为底物，环状和线性DNA均可作为底物。

在合适的的反应条件下，是两条核糖链上特定的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。