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4 实验六 淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂
及抑制剂对酶活性的影响
实验类型：验证型
目的和要求
1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。
2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。
3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。
原理
酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。
操作方法
一、唾液淀粉酶的收集与处理
1.制备唾液
实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。
2.煮沸唾液
取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
3.稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性，使之在、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：
①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。 百度文库 - 让每个人平等地提升自我
4 ②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。
第２４卷第４期 ２０１１年ｌＯ月 烟台大学学报（自然科学与工程版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙａｎｔａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖ０１．２４ Ｎｏ．４ ０ｃｔ．２０１１
文章编号：１００４－８８２０（２０１１）０４－０２７５－０６
固定化真菌ＯＬ淀粉酶在海参饵料
添加剂方面的应用研究
李向阳，单守水，徐世艾
（烟台大学山东省化学工程与过程重点实验室；化工制造工程山东省高校重点实验室，山东烟台２６４００５）
摘要：采用海藻酸钠为栽体固定化真菌Ｏｔ一淀粉酶，首次作为海参饵料添加剂考察了固
定化的最适条件和固定化酶的酶学性质．结果表明：海藻酸钠质量分数２．５％。加酶量
１５％，ＣａＣ１２质量分数２％，固定化时间１．０ ｈ固定化酶活力最高．固定化酶的最适温度范
围在５５—６０℃，最适ｐＨ在５．０—５．５之间．固定化酶在添加量为０．１６ ｍｇ／ｇ（干饵料），
酶解时间２５—３０ ｍｉｎ效果最佳．
关键词：真菌Ｏｔ一淀粉酶；固定化酶；固定化率
中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ
海参具有很高的食用和药用价值，自古以来
就被誉为“海产八珍”之首…．近年来，随着海参
养殖规模的日益扩大，出现了多种病发症，主要原
因是放养密度过大、日常管理不科学、池底环境含
氮量高、人工复合饵料研究滞后等Ｌ２ Ｊ．研发营养
丰富的复合饵料是解决问题的关键所在，在饵料
中适量添加益生菌、有助海参消化的酶制剂是近
年来国内研究的热点课题 Ｊ．本研究根据海参肠
道内主要消化酶及分布特点，选择海参主要消化
场所（后肠）中酶比活力最高的耐热不耐酸的真
菌Ｏｔ一淀粉酶为研究对象 Ｊ，采用包埋法将其固
定在环保、无毒、廉价的海藻酸钠上，做成海参饵
料添加剂，以提高海参肠道内淀粉的消化利用率，
减少代谢产物的排出，达到缓解和改善海参池底
环境、减少病害发生的目的．
固定化技术应用－酶和细胞的固定化
试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？
01
1.固定化酶技术
固定化酶技术是用物理或化学手段。将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展
以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究 。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(MIE) 一方面由于载体具有两亲性，MIE可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，MIE又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
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海藻酸钠固定化α—淀粉酶的研究
作者：郑璐 雷明科 张瑞等
来源：《湖北农业科学》2013年第23期
摘要：以海藻酸钠为载体，采用包埋交联法制备固定化α-淀粉酶，通过单因素试验和正交试验确定最优的固定化α-淀粉酶的条件。利用聚乙二醇4 000作为制孔剂，进一步制备具有多孔结构的固定化酶。结果表明，最优工艺为海藻酸钠1.6%，α-淀粉酶0.4%，羧甲基纤维素钠0.2%，CaCl2 2%，在此条件下，固定化α-淀粉酶的固定效率可达92.43%。在体系中添加浓度为2.5%的聚乙二醇4 000能使酶活性提高37.61个百分点，得到的固定化酶的温度稳定性以及pH稳定性均优于游离酶。
关键词：海藻酸钠；固定化；α-淀粉酶；聚乙二醇
中图分类号：Q814.2；TQ925+.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5845-05
α-淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍存在于动物、植物和微生物中，它能以随机作用的方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1，4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，被广泛应用于食品加工、粮食工业、乙醇工业、发酵和纺织业等多种行业，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一[1，2]。
固定化酶与游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、对变性剂耐受性强等优点，可重复或连续使用，且易于与产品分离，是食品、医药、化工等领域的研究热点之一[3，4]。依据酶的性质和用途，酶的固定化方法主要可以分为以下4种：吸附法、交联法、包埋法和共价结合法[5]。
酶的固定化可以使用多种载体，其中海藻酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖，它是由β-（1，4）-D-甘露糖醛酸和α-（1，4）-L-古罗糖醛酸组成的线性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羟基，可溶于不同温度的水中，生物相容性好，稳定、无毒、成膜性或成球性好，是常用的囊材与载体材料，也常被用作固定化酶的载体[6]。聚乙二醇是一种无毒的高分子聚合物，与水有极好的互溶性，它的相对分子质量可从几千到几万，控制其相对分子质量的大小以及用量，可调节海藻酸钙中孔的尺寸、体积和密度[7]。以聚乙二醇为海藻酸钠制孔剂，两者在水溶液中形成均一体系，将两者混入氯化钙溶液中时，海藻酸钠转化为交联的网状大分子，海藻酸钙形成固态，聚乙二醇可以从固态的海藻酸钙中溶出，即形成多孔结构的海藻酸钙。当聚乙二醇相对分子质量为4 000时，海藻酸钙支架中可形成蓬松均匀的多孔结构，适用于组织工程多孔材料的应用[8]。 龙源期刊网
