实验二 α-淀粉酶的初步纯化

α–淀粉酶活力测定

----目视碘比色法

一 实验目的 1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。 2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。 二、 实验原理 比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色

物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两

种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。 酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。1961年国际生物化学学

会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，

每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。

淀粉 （紫蓝色，30分子以上） 红色糊精 （红棕色，7-30分子） 无色糊精（7分子以

下）、麦芽糖不显色。通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应

的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。

碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。

三、实验操作

1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。 2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。

4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。

5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。

6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30

秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。

四、酶活性计算

实验注意事项：

（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。

（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。

a-淀粉酶的发酵生产工艺

扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，a•淀粉酶已广泛应用

于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1•菌种的选育

1. 1细菌的分离与初步鉴定：

将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。保菌供下次实验用。

1. 2紫外线诱变育种：

取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线

处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，

37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜

面培养基上。

1.3诱变方法以及变异菌株的筛选

① 诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

② 以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处

理1~4h°

③ 经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④ 经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤ 把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho

⑥ 用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦ 用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。把disc培养皿经37C,24h分别培养。盯盯小文库

自然界中产淀粉酶菌株分离

纯化及酶活测定

淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。

生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，

实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用

背景资料

一、酶

酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。

1．高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；

2．专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种：高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面；长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理；纤体酵素专门转化脂肪减肥；肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。

3．多样性：酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。

4．温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。

5．活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。

6.易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；

7.有些酶的催化性与辅助因子有关。

酶与无机催化剂的比较

酶 无机催化剂

相同点 1）改变化学反应速率，本身几乎不被消耗；

2）只催化已存在的化学反应；

3）加快化学反应速率，缩短达到平衡时间，但不改变平衡点；

4）降低活化能，使化学反应速率加快。

5）都会出现中毒现象。

不同点 1）酶具有高效性，催化效率比一般催化剂高出107-1013；

2）具有高度专一性，只对特定的一种或一类底物起作用；

3）更易受环境因素和生物体生理条件的影响，酶是蛋白质和核酸组成，易变性失活，所以酶在反应时不断产生和分解；