α-淀粉酶活力的测定-实验指导书

α–淀粉酶活力测定

----目视碘比色法

一 实验目的 1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。 2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。 二、 实验原理 比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色

物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两

种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。 酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。1961年国际生物化学学

会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，

每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。

淀粉 （紫蓝色，30分子以上） 红色糊精 （红棕色，7-30分子） 无色糊精（7分子以

下）、麦芽糖不显色。通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应

的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。

碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。

三、实验操作

1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。 2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。

4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。

5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。

6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30

秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。

四、酶活性计算

实验注意事项：

（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。

（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。

淀粉酶活力的测定

摘要：本实验以萌发的种子为材料，以麦芽糖为辅助材料，测定其中

α-淀粉酶和β-淀粉酶活性及其之间的差异；了解722分光光度计

的应用领域。熟识缓冲溶液的布局；通过对两种淀粉酶的测量得出结论α-淀

粉酶的活力为1.368；（α+β）淀粉酶的活力为17.415，r2=

关键词：α-淀粉酶；b-淀粉酶；麦芽糖标准曲线；淀粉酶几乎所有的植物种子中都所含淀粉酶，特别就是萌生的禾谷类种子，其淀粉酶的活力最强大。淀粉酶主要分成a-淀粉酶和b-淀粉酶。种子萌生时，淀粉酶的活性可以随着萌生时间的流逝而快速减少，其促进作用就是将淀粉水解为小分子糖类，可供幼苗生长。a-淀粉酶随机水解a-1-4糖苷键，做为淀粉水解的初始酶而起至主要促进作用，其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等；b-淀粉酶水解非还原成端的第二个a-1-4糖苷键，水解产物为麦芽糖。

原理：这两种淀粉酶有不同的理化性质，a-淀粉酶不耐酸，在ph3.6以下迅速钝化；b-淀粉酶在70℃下15min被钝化。据此。可以在钝化其中之一，来测定另一个酶的活力。该试验通过先钝化b-淀粉酶来测定a-淀粉酶的活力，在与非钝化条件下测的的总淀粉酶活力比较，从而求出b-淀粉酶的活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反映，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖或者葡萄糖浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还

原糖的量，以单位重量样品在一定时间内分解成的麦芽糖的量

表示酶活力。实验仪器及试剂

722分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具有刻度试管25ml13两支；刻度液体1ml、2ml、5ml各1两支；容量瓶50ml2两支

(1)麦芽糖标准液（1mg/ml）；(2)dns试剂；（4）0.1mol/lph5.6柠檬酸缓冲液(3)1%淀粉溶液1、试剂的配置

(植物中)淀粉酶活性的测定

一 实验目的

本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。

二 实验原理

植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。

α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。

淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。

三 实验材料

萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右）

四 实验仪器和试剂

1．仪器：

电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管[25mL（9个）、10mL（1个）]、试管6支、移液管[1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计

2．试剂：

1％淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、

pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL混匀即是。

3,5－二硝基水杨酸：精确称取3,5－二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。

血清α淀粉酶测定

1 检验目的

指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确

2 实验原理

AMS测定采用酶动态比色测定法。所用底物为4,6-亚乙基-,D-麦芽七糖苷-对硝基苯酚（EPS－G7）。样品中－淀粉酶分解底物EPS－G7，生成对硝基苯酚（PNP），在405nm处比色，吸光度的上升速率与样品中-淀粉酶的活力成正比。

3 标本采集与处理：

3.1 病人准备：无特殊要求。 3.2 标本类型：血清。

3.3 血清分离 血清或血浆应在收集后尽快分离出来。未酸化的尿液，随机或限时收取。

3.4 标本存放：不要用嘴吸取标本或对标本吹气，以免唾液污染标本唾液中的淀粉酶使结果升高。血清淀粉酶在20～25℃稳定一个星期，避免微生物降解作用；在2～8℃时稳定一个月。尿液样品在2～8℃可稳定10天，在15～25℃可稳定2天。对于尿液，酸性pH值可使淀粉酶的稳定性减弱，因此，储存前pH值应调至大约7.0。

3.5 标本运输 常温条件下运输

3.6 标本拒收标准 细菌污染、溶血的不能做测定。

4 实验材料：

4.1 试剂：上海罗氏诊断产品有限公司淀粉酶试剂盒,国械注进20142405056

YZB/GER 5724-2014）

4.1.1 试剂组成 R1 HEPES缓冲液:52.5 mmol/L,pH 7.00(37℃)；氯化钠：87 mmol/L；氯化镁：12.6mmol/L；氯化钙：0.075

mmol/L；α-葡萄糖苷酶（微生物）：≥4kU/L；防腐剂。

R2 HEPES缓冲液:52.5 mmol/L,pH 7.00(37℃)；4-6-亚乙基-G7PNP：22 mmol/L；防腐剂；稳定剂。

4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

4.1.3 试剂稳定性与贮存：2-8°C下保存期限：见试剂标签上的有效期；机上稳定期：4周

4.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染则试剂不能使用。