大鼠结缔组织生长因子siRNA荧光逆转录病毒表达载体的构建

NS特异性siRNA真核表达载体的构建蔡子微1　刘思金①1　胡国法3　魏影允3　劳为德32牡丹江医学院自保护生物学研究所病理生理学教研室 157011摘要　目的:构建nucleostemin(核干细胞因子,NS)特异性siRNA真核表达载体。

方法:以小鼠组织基因组DNA为模板,PCR方法克隆小鼠编码U6snRNA基因的启动子,将NS-siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动子连接起来,并将其插入pcDNA4/C载体中。

结果:(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6snRNA基因的启动子,(2)构建了含有U6启动子、NS-siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS-siRNA表达的片段,(3)将NS-siRNA表达片段插入了pcDNA4/C真核表达载体。

结论:构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4/C-NS-Silencer。

关键词　nucleostemin(核干细胞因子);U6启动子;siRNA;真核表达载体THE GENERATION OF EUKAR YOTIC EXPRESSION VECT OR OF siRNA SPECIFIC FOR NUC LEOSTEMINCai Ziwei et al.Institute of Self-protection Biology,Department of Pathophysiology,Mudanjiang Medical College,Mudanjiang　157011　ChinaAbstract Objective:To generate eukaryotic expression vector of siRNA specific for nucleostemin. Methods:G enomic DNA of mouse-tails was isolated,and it was subsequently used as the tem2 plate of PCR to clone the genomic gene promoter of U6snRNA.U6promoter was linked with the sequence coding NS-siRNA and the termination signal which RNA polymeraseⅢrecognized.Fi2 nally the whole frame coding NS-siRNA was inserted into pcDNA4/C vector.R esults:(1)Suc2 ceeded in cloning the promoter of mouse U6snRNA.(2)G enerated the whole NS-siRNA expres2 sion frame with promoter of U6snRNA and the termination signal of RNA polymeraseⅢrecog2 nized.(3)The whole frame coding NS-siRNA was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA4/C.Conclusion:Eukaryotic expression vector of siRNA specific for nucleostemin was gen2 erated.K ey w ords　nucleostemin;U6promoter;siRNA;eukaryotic expression vector RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物界一种古老而且高度保守的现象,是基因转录后沉默作用(PTGS)的重要机制之一。

实验题目：pLL3.7-Mcl-1-siRNA 载体的构建实验日期：2010年12月6日实验记录者：孙向东实验参加者：孙向东实验目的：将退火后的shRNA片段克隆至慢病毒载体pLL3.7慢病毒载体中，构建成pLL3.7-Mcl-1-siRNA载体。

实验材料：pLL3.7慢病毒质粒Sh-mcl-1-f：5'- AAC GCAGTCCTCTAGTGTTTCA TTCAAGAGA TGAAACACTAGAGGACTGC TTTTTT C-3'Sh-mcl-1-r：5'-TCGAG AAAAAA GCAGTCCTCTAGTGTTTCA TCTCTTGAA TGAAACACTAGAGGACTGC GTT -3' Sh-GAPDH-f：5’- AAC GTA TGACAACAGCCTCAAG TTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATAC TTTTTT C -3’Sh-GAPDH-r：5’- TCGAG AAAAAA GTATGACAACAGCCTCAAG TCTCTTGAA CTTGAGGCTGTTGTCA TAC GTT -3’实验方法：1. shRNA单链退火形成shRNA双链（实验方法参考Invitrogen公司Protocol：Generating the Double-Stranded Oligo (ds oligo)）2．稀释shRNA 修改原因3．酶切：pLL3.7：20ulBuffer B: 4 ulBSA: 4 uldH2O: 8 ulHpaI: 2 ulXhoI: 2 ul====================37度4h（13：40～17：40）4. 电泳胶回收：5. 连接:pLL3.7(XhoI/HpaI)： 2 ulMcL-1 siRNA： 4 ul10×T4 DNA ligase Buffer: 1uldH2O: 2.5 ulligase 0.5ul====================16度4h，或者4度过夜（13：40～17：40）6. 转化7. 鉴定实验结果：实验结论/分析讨论：。

靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的构建和作用分析作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，杨汉东，闵新文【摘要】目的: 构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子（CTGF）的shRNA表达载体. 方法: 根据大鼠CTGF mRNA序列设计并构建4个靶向大鼠CTGF基因的shRNA干扰质粒；然后以脂质体转染试剂将目的质粒转染至大鼠心肌成纤维细胞，流式细胞技术分选出成功转染的阳性细胞. 通过RT PCR和Western Blot技术对成功构建的4个shRNA干扰质粒进行有效性筛选，分析其CTGF mRNA及蛋白表达水平. 结果: 酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入载体，经测序证明与设计的相同；在转染成纤维细胞48 h后，与空白对照组比较，有3组细胞CTGF mRNA及蛋白表达水平明显降低；而转染非特异阴性质粒对照组CTGF mRNA及蛋白表达水平无明显变化. 结论: 成功构建并筛选出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体，为进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础.【关键词】结缔组织生长因子;RNA干扰;质粒;转染;心内膜；心肌纤维化【Abstract】AIM: To construct and screen out the potent shorthairpin RNA (shRNA)expressing plasmids which target to rat connective tissue growth factor (CTGF). METHODS: Four shRNAexpressing plasmids targeting to rat CTGF mRNA (Accession No: NM_022266) were designed and constructed based on the sequence of rat CTGF mRNA. The recombinant plasmids were identified by restriction enzyme assay and nucleotide sequence analysis. Then the plasmids were transfected into rat cardiac fibroblasts using lipofectamine2000 reagent, and the positive cells were sorted by fluorescence active cell sorting (FACS) technique. The mRNA and protein expressions of CTGF were analyzed by RT PCR and Western Blot technique, and compared with thatof nontransfection group and negative control plasmid. RESULTS: The 4 recombinant plasmid vectors expressing CTGF targeting shRNA were identified by restriction enzyme assay and sequence analysis. Forty eight hours post transfection, the mRNA and protein expressions of CTGF decreased in 3 experimental groups compared with that in nontransfection group, but no changes occurred in negative control plasmid and lipofecta mine2000 group. CONCLUSION: Four recombinant plasmids targeting to rat CTGF are successfully constructed, and 3 potent recombinant plasmids are screened out. This lays a foundation for further researches of RNA interference on cardiac fibrosis in vivo and in vitro.【Keywords】connective tissue growth factor; RNA interference; plasmid; transfect; cardiac fibrosis0引言结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一种促组织纤维化发生发展的关键细胞因子，在多种器质性纤维化疾病如肾间质纤维化、肝硬化、皮肤瘢痕的形成等中均起关键作用［1-3］. 近年来也有研究提示CTGF可能参与了心肌纤维化的发生［4-5］.RNA干扰（RNA interference, RNAi）是转录后水平的基因沉默技术，是比基因敲除、反义寡核苷酸干扰更有前途的作用于mRNA水平的干扰技术，具有相对简单、抑制作用更为完全、特异性高等特点，在高通量研究基因功能、信号转导通路及进行靶向基因静默治疗等方面广泛应用. 本研究通过构建并筛选CTGF靶向特异性的shRNA （short hairpin RNA）真核表达载体，为今后通过RNAi技术抑制CTGF表达、从基因与蛋白质水平探索CTGF在促心肌纤维化的作用打下基础.1材料和方法1.1材料真核表达载体pGenesil1质粒和感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术有限公司;限制性核酸内切酶BamH I, Hind Ⅲ, Sal I, Pst I和T4多聚核苷酸激酶及其缓冲液均购自宝生物工程大连有限公司;T4 DNA连接酶及缓冲液购自New England Biolabs;凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎生物技术有限公司;脂质体转染试剂lipofectamine2000购于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗体购自Santa Cruz;HRP标记的兔抗山羊二抗及ECL试剂盒购于Pierce公司.1.2方法1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的设计与合成CTGF靶向性shRNA干扰序列的设计合成参见文献［6］. 简言之，从GenBank上选取大鼠CTGF的基因序列(序列号NM_022266)，用专业RNAi设计软件结合个人经验优选四段序列为靶序列，同时设计一对非特异性序列作为对照，并与大鼠基因组进行BLAST比对，验证均为单一基因. 然后进行以上寡核苷酸DNA单链的合成，并退火连接形成双链.1.2.2靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的重组构建及鉴定CTGF靶向性干扰质粒的克隆重组、限制性内切酶分析及测序鉴定参见文献［6］. 首先，线性化处理目的质粒，再把基因片段与线性化质粒连接从而克隆重组成新的靶质粒，随后转化感受态细菌DH5α，在含Kana抗性（终浓度为20 μg/mL）的LB培养液中培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，将提取得到的重组的阳性克隆质粒用Pst I和Sal I进行酶切分析并进行测序鉴定.1.2.3大鼠心肌成纤维细胞的分离培养取出生1～2 d的SD乳鼠(购自华中科技大学同济医学院实验动物中心)消毒后无菌操作取心尖组织，剪碎成1 mm3大小，加入适量含0.8 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L胶原酶混合液，37℃水浴下机械混匀，完全消化，加入含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液终止消化，离心弃上清，制备成细胞悬液接种到培养瓶，差速贴壁60 min去除心肌细胞，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液于37℃, 50 mL/L CO2培养环境中恒温培养. 以后每2 d换液1次，待细胞铺满瓶底后传代继续培养. 取第3代细胞进行后续实验.1.2.4心肌成纤维细胞的基因转染及流式分选将培养至第3代的心肌成纤维细胞以1.25 g/L胰酶消化离散，接种于6孔板继续培养，待细胞铺板密度达90%左右时，进行转染实验. 实验分为如下6组：①空白对照组（即单纯细胞组）,②阴性对照HK质粒组,③1号质粒组,④2号质粒组,⑤3号质粒组,⑥4号质粒组. 参照脂质体转染试剂Lipofectamine2000试剂盒操作说明转染细胞. 为纯化转染成功的阳性细胞，于转染后48 h后对所有质粒转染组（1～4号质粒及阴性HK质粒）进行流式细胞分选. 分选出的5组细胞及空白对照细胞进入后续的筛选实验.1.2.5RNA的提取及半定量RT PCR检测根据实验分组，在刺激时相点结束后，加入TRIZOL提取细胞总RNA，以30 μL去RNase 水溶解，采用紫外分光光度仪测定浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的质量. RT PCR检测采用两步法进行. 逆转录过程以Random 9 mers为随机引物，AMV为逆转录酶，反应条件为：30℃保温10 min,44℃聚合延伸30 min, 99℃灭活逆转录酶5 min, 5℃稳定5 min. PCR过程以3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照. CTGF上下游引物序列分别为5′GCTGGGGCTCACCTGAAGG3′和5′GGATGACCTTGCCCACAGCC3′，扩增长度499 bp; GAPDH 上下游引物序列分别为5′CCTGACCCAACTATGATGC3′和5′CCCTTACTCCCTGGCTTT3′，扩增长度为343 bp. 引物均用Primer5.0设计，送上海生物工程有限公司合成. PCR反应条件如下：95℃变性5 min；然后95℃变性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,共计30个循环；最后72℃延伸7 min. PCR产物经15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，拍照并经过凝胶成像分析系统对电泳带进行分析，测定各目的基因和GAPDH扩增产物的吸光值，分别计算其比值.1.2.6蛋白提取及Western Blot检测根据实验分组，以冰PBS洗涤细胞，按照5×106个细胞加入50uL蛋白裂解液提取细胞总蛋白，蛋白提取液在4℃条件下以12 000 g离心20 min，取上清，采用紫外分光光度仪用Bradford方法测定蛋白浓度后分装，-70℃保存. 取上述细胞蛋白提取液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）. 将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，置于50 g/L脱脂奶粉的PBS中封闭3 h 后分别加入CTGF（1∶400），FN（1∶500）多克隆抗体4℃孵育过夜后，硝酸纤维素膜用3 g/L的Tween PBS液反复冲洗3次，每次15 min. 将冲洗后的膜置于辣根过氧化物酶标记的IgG中，室温下摇床上孵育2 h. 用3 g/L的Tween PBS液反复冲洗3次，每次15 min. 并以兔抗大鼠actin（1∶500）多克隆抗体同上操作，作为上样对照. 抗原抗体复合物用增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）法显影，暗室X光胶片曝光，采用GELW4D软件分析蛋白条带的积分光密度值（integrated optical density, IOD=平均光密度×面积），以IOD靶蛋白/IODactin的比值反映靶蛋白相对水平.统计学处理: 用SPSS12.0统计软件对数据进行统计学处理, 数据以x±s表示，多个均数比较用单因素方差分析,两个均数比较用t检验. P<0.05为有统计学差异. 2结果2.1选定的靶序列及针对每条靶序列设计的双链shRNA靶序列结构模式：BamHI+Sense+Loop+Anti sense+ 终止信号+SalI+HindIIICTGF1: AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC; CTGF1A: 5′GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGA AGAGACCCTTTTTTGTCGACA3′; CTGF1B: 3′GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTC TGGGAAAAAACAGCTGTTCGA5′; CTGF2: AAAGATGGTGCACCCTGTGTC; CTGF2A: 5′GATCCAGATGGTGCACCCTGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTG CACCATCTTTTTTTGTCGACA3′; CTGF2B: 3′GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGG TAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5′; CTGF3: GAGTCCTTCCAAAGCAGTT; CTGF3A: 5′GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGG AAGGACTCTTTTTTGTCGACA3′; CTGF3B: 3′GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATACCTGTTTGACGAAACCTTCC TGAGAAAAAACAGCTGTTCGA5′; CTGF4: CCGATGGCGAGATCATGAA; CTGF4A: 5′GATCCGCCGATGGCGAGATCATGAATTCAAGACGTTCATGATCTC GCCATCGGTTTTTTGTCGACA3′; CTGF4B: 3′GCGGCTACCGCTCTAGTACTTAAGTTCTGCAAGTACTAGAGCGGT AGCCAAAAAACAGCTGTTCGA5′.以上各序列中画横线部分为正义及反义序列，斜体加粗部分为shRNA的环区序列，两端的框中为BamHI和HindⅢ部分酶切残基，退火成双链后能够形成酶切位点的粘性末端，可与工具质粒相应的黏性末端连接；其余部分为终止信号+SalI. 构建好的质粒重组体分别命名为CTGF1～4.2.2心肌成纤维细胞瞬时转染以Lipofectamine2000转染心肌成纤维细胞24～48 h后，倒置荧光显微镜下可见各转染组心肌成纤维细胞在成功转染后可被激发出亮绿色荧光，粗略估测转染效率约30%～40%（图1）.图1荧光显微镜下瞬时转染效果×1002.3心肌成纤维细胞的流式分选流式细胞分选表明，以Lipofectamine2000进行心肌成纤维细胞的质粒转染，瞬时转染效率仅约为30%（图2）.M1:成功转染的细胞比率; A:阴性对照; B:阳性转染细胞.图2心肌成纤维细胞流式分选结果2.4不同实验组心肌成纤维细胞CTGF mRNA的表达半定量RTPCR结果显示，序列非特异性的阴性对照质粒成功转染心肌成纤维细胞后对细胞CTGF基因表达无下调效应.4个待筛选的目标质粒转染后，表现出不同的抑制效应，其中在转染1号质粒的细胞未表现出抑制效果，转染2, 3, 4号质粒后有明显抑制效应，尤其以3号质粒基因沉默作用最强（图3）.2.5不同实验组心肌成纤维细胞的CTGF蛋白表达水平结果显示，序列非特异性的阴性对照质粒成功转染后对细胞CTGF蛋白表达无下调效应；4个待筛选的目标质粒转染后，1号质粒未表现出任何抑制效果，2, 3, 4号质粒有明显抑制效应，尤其以3号质粒抑制作用最强，约75%（图4）.3讨论CTGF是近年来国内外研究的热点之一，它可能是TGFβ1促纤维化活性的下游信号介质，刺激细胞增殖及细胞外基质的形成，在组织纤维化中有重要作用. 研究发现在高血压、粥样硬化病变中以及心肌梗死灶中CTGF表达明显增高，并与纤维化指标正相关，提示CTGF可能是致心肌纤维化的关键性中间环节［7-9］.通过靶向抑制CTGF从而抑制纤维化的发生和发展理论上是抗纤维化的有效方式，已有研究应用抗CTGF的单克隆抗体FG3019或针对CTGF的反义寡核苷酸用于抑制肾间质纤维化、肺纤维化并取得一定进展［10-11］. RNA干扰（RNAi）是作用于mRNA水平的基因沉默技术,其机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成21～23 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，精确降解与siRNA序列相同的mRNA，抑制了该基因在细胞内的翻译和表达从而达到转录后水平的基因静默［12-15］. 由于siRNA表达载体成功转染后可进行瞬时或稳定的基因沉默，因此相较于化学合成的siRNA更有应用价值和前景. 本研究应用OptiRNA设计软件结合个人经验设计了4条针对大鼠CTGF基因的靶向干扰序列，经BLAST证实与大鼠基因组其他基因无同源性，因此具备了靶向特异性的特点. 我们构建的CTGFshRNA质粒重组体使用了U6启动子启动shRNA的转录以及PolⅢ识别的终止信号终止转录，符合siRNA表达载体的设计要求；通过酶切实验和基因测序也证实目标质粒构建成功. 另外，本质粒含有增强型绿色荧光蛋白编码基因，成功转染后能在细胞内借助U6启动子转录出绿色荧光蛋白，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪可非常方便的评估转染效率或进行细胞分选，为成功的RNA 干扰实验提供支撑.由于我们早期进行的预实验发现用脂质体转染试剂Lipofectamine2000对心肌成纤维细胞进行质粒转染其转染效率仅有30%～40%，达不到进行理想的基因干扰实验的要求. 因此，为了提高筛选结果的准确性和可信度，本实验对转染细胞进行了流式分选. 由于分选出的阳性细胞基本上都是已经成功转染目的质粒的心肌成纤维细胞，因此最大限度减少了筛选实验假阴性结果的发生.通过检测CTGF mRNA与蛋白的表达水平，我们比较了4个目标质粒及阴性对照质粒转染组细胞与非转染细胞的表达差异. 结果表明，CTGF2,3,4号干扰质粒均可有效地抑制CTGF mRNA及蛋白的表达，尤其以3号干扰质粒基因沉默效果更为显著，抑制效率可达75%以上，说明CTGF shRNA可高效特异抑制CTGF的表达. 而CTGF1干扰质粒无明显抑制效率，说明并非所有设计的siRNA均可有效地抑制靶基因的表达，因此，RNA干扰实验要求通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列. 阴性对照组与空白对照组相比CTGF mRNA表达无明显改变，排除了质粒载体本身、非特异性的靶基因对CTGF基因表达的影响.综上所述，本研究成功设计并构建了4个靶向CTGF的shRNA 质粒，并通过筛选实验获得了高效及靶向特异的目标质粒. 为后续心肌纤维化的体内外RNA干扰研究及进一步探索CTGF在心肌纤维化及心脏的组织重塑中的地位与作用奠定了基础.【参考文献】［1］Duncan MR, Frazier KS, Abramson S, et al. 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CTGF expression is induced by TGF betal in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes: A potential role in heart fibrosis ［J］. J Mol Cell Cadiol, 2000,32(10): 1805-1819.［8］Piet F, Kaija I, Juhani A, et al. Angiotension II induces connective tissue growth factor gene expression via calcineurin dependent pathways ［J］. Am J Pathol, 2003,163(1): 355-366.［9］Hishikawa K, Oemar BS, Nakik T, et al. Static pressure regulates connective tissue growth factor expression in human angial cells ［J］. J Biol Chem, 2001,276(20): 16797-16803.［10］张春, 朱忠华, 邓安国. 结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1表达的影响［J］.中华肾脏病杂志,2004,20（4）：264-267.［11］张海燕，李幼姬，杜勇,等. 结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞胶原分泌的影响［J］.中华肾脏病杂志, 2004,20（2）：122-126.［12］Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al. RNAi: Double stranded RNA directs the ATP dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals［J］. Cell, 2000,101:25-33.［13］Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R,et al. Targeted mRNA degradation by double stranded RNA in vitro［J］. 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万方数据重组质粒转化的Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１宿主菌在５ｍｌＬＢ（含０．１ｇ／Ｌ卡那霉素）培养基中培养过夜。

取２００山过夜菌液转接至１００ｍｌ含卡那霉素的ＬＢ中，待ＯＤＡ６００值达０．４—０．６时加入ＩＦｒＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），至终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃诱导表达５ｈ。

收集诱导后的菌液，将其悬浮于８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解液中，超声破碎细菌，离心取上清加入Ｎｉ·ＮＴＡ亲和层析柱（Ｑｉａｇｅｎ公司）内，收集洗脱液，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳鉴定表达产物的分子量及纯化效果。

２结果２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果将设计合成的引物，以逆转录合成的大鼠ｃＤＮＡ为模板，经ＰＣＲ扩增后显示在５００ｂｐ左右的扩增产物，与预期大小５０６ｂｐ相符。

２．２ｐＧＥＭ—Ｔ－Ｓｉｒｔｌ载体构建及鉴定重组的ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｓｉｒｔｌ载体用ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析显示酶切产物大小约５００ｂｐ，说明已成功将目的片段连接于Ｔ载体（图１）。

Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．ＲＴ－ＰＣＲ产物；２．ｐＧＥＭＴ－Ｓｉｒｔｌ酶切结果；３．ｐＥＴ４１－Ｓｉｒｔｌ质粒；４．ｐＥＴ４１一Ｓｉｒｔｌ的酶切结果图１大鼠Ｓｉｒｔｌ的ＲＴ－ＰＣＲ产物和重组质粒的琼脂糖凝胶电泳分析Ｍ蛋白Ｍａｒｋｅｒ；ｌ未经ＩＰＴＧ诱导的转化细菌蛋白；２ｔＦｒＧ诱导后的转化细菌蛋白；３纯化后的重组蛋白图２Ｓｉｒｔｌ重组蛋白表达及纯化的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的分析结果２．３表达载体的构建及鉴定连接了目的片段的ｐＥＴ４１－ｃ载体经双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析显示在５００ｂｐ处有一条带，如图１。

表明连接重组质粒的目的片段是正确的。

经测序验证。

目的基因插入片段序列正确。

２．４蛋白表达及纯化结果根据目的片段的氨基酸序列计算，表达的蛋白应为１８．１ｋＤ，加上ｐＥＴ４１载体上的ＧｓＴ融合标签２９ｋＤ，实际表达蛋白分子量应约４７ｋＤ。

经Ｎｉ．ＮＴＡ亲和纯化后，蛋白分子量与预测相符（图２）。

RNAi表达载体构建近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：1.化学合成2.体外转录3.长片断dsRNAs经RNase III 类降解(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)4.siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs5.PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的效率则是非常关键的因素。

一、基本概念1.RNAi：（RNA interference）RNA干扰内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异基因表达沉默或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制.2.siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA, RNAi的关键效应分子.3.shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用.4.Dicer：属于RNaseⅢ家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶5.RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA诱导的沉默复合体,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性二、机制目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制,都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达. 即RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步.1.第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）.2.第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC).siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。

结缔组织生长因子小干扰RNA的构建及其干扰效果检测李勤操;郑喜邦;王晓晖;杨智洪;姜艳超;丁丽华;李杰萍;叶棋浓【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2008(19)3【摘要】目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对CTGF基因表达的干扰效果.方法:根据CTGF基因序列,设计2条合理的CTGF-siRNA,并将其克隆到siRNA载体pSliencer 2.1-U6 neo中,转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建成功的CTGF-siRNA重组质粒与带FLAG标签的CTGF表达载体共同转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测siRNA的干扰效果.结果:构建了2个CTGF-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的干扰效果可达75%以上.结论:构建的CTGF-siRNA可为进一步研究CTGF的功能提供参考.【总页数】3页(P347-349)【作者】李勤操;郑喜邦;王晓晖;杨智洪;姜艳超;丁丽华;李杰萍;叶棋浓【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;广西大学,动物科学技术学院,广西,南宁,530005;广西大学,动物科学技术学院,广西,南宁,530005;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.靶向血管内皮生长因子受体3基因的小干扰RNA表达载体构建及其生物学效应[J], 贾如江;侯丽艳;张有成2.人结缔组织生长因子小干扰RNA真核表达载体的构建 [J], 张雅萍;蒋萍3.结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 郝春秋;白雪帆;贾战生;彭梅娟;谢玉梅;周云;魏欣;马力;王素娜;李瑞娟;张岩4.SUMO-1小干扰RNA的构建及其干扰效果检测 [J], 任雯;韦玮;叶棋浓5.脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测 [J], 林宇翔;于芳;绳纪坡;高宁;马祖兴;胡宝成因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。