植物染色体带型分析

实验十植物染色体Giemsa分带技术一、实验目的1. 掌握植物染色体Giemsa的C带、G带分带技术和方法。

2. 学习染色体带型分析方法。

二、实验原理植物染色体显带是借助于特殊的处理程序后，进行Giemsa染色，使染色体某些结构成分发生特异反应而出现深浅不同的带纹，从而使核型分析中更准确地识别染色体的每个成员以及其结构变异。

通过改变Giemsa分带处理程序可产生不同带型，因此有C带、G带、N带、Q带、T带等不同技术。

C带(组成异染色质带)：C带技术是应用最广泛的技术，它主要显示着丝粒、端粒、核仁组成区域或染色体臂上某些部位的组成异染色质而产生相应的着丝粒带、端粒带、核仁组成区带、中间带等，这些带可以在一条染色体上同时出现，也可以只有其中的一条或几条带。

G带(Giemsa带)：显示染色粒，G带分布于染色体的全部长度上。

以深浅相间的横纹形式出现。

G带能清楚地反映染色体的纵向分化，能提供较多的鉴别标志。

因此，G带是分带技术中最有价值的一种。

R带(反带)：与G带相反的染色带．由于处理程序不同，染色体在同一部位染色效果相反。

N带：专一地显示出核仁组织区。

T带：专一地显示出端粒区域。

以上几种带型在植物上应用最多的为C带和G带，本次实验主要介绍这两种分带技术。

三、实验材料（一）材料大麦(Hordeum spp．2n=14)的种子、蚕豆(Vicia faba 2n=12)的种子、洋葱(Allium cepa 2n=16)的鳞茎。

以上材料可任选一种。

（二）器材培养箱、恒温水浴锅、分析天平、小台秤(200g) 、量简(50ml、100ml、1000ml、10m1) 、烧杯(200m1) 、容量瓶(1000m1) 、棕色试剂瓶(200m1)、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜、显微照相及冲洗放大设备、剪刀、镊子、刀片、滤纸、玻璃板、牙签、切片盒。

（三）试剂Giemsa母液、磷酸缓冲液、氯化钠、柠檬酸钠、甲醇、乙醇、冰醋酸、氢氧化钡、秋水仙素或对二氯苯、α-溴萘、纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、醋酸洋红、45% 醋酸等。

一、名词解释1、染色体核型：指细胞染色体在光学显微镜下所有可测定的表型特征的总称。

2、染色体带型：借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。

染色体的数目、部位、宽窄和着色深浅均有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即染色体带型。

3、核仁形成区（NOR）：即核仁组成区或核仁组织者，是细胞中某一对或几对染色体上负责组织核仁的区域，含有指导rRNA合成的基因。

4、染色体基数：在系统发育范畴内，在整倍多倍体系列的属中，包含染色体数目最少的种的配子体染色体数目为该属的染色体基数。

5、细胞周期：增殖细胞的细胞周期是处于母细胞分裂后形成的细胞到下一次再分裂形成两个子细胞之间的时期。

包含G1期，S期，G2期，M期四个阶段。

6、随体(SAT)：指在染色体的一端由微细的纤维结构连接起来的球形或椭圆形的染色颗粒7、B染色体：B染色体又称副染色体、超数染色体或额外染色体。

在一组基本染色体外，所含的多余染色体或染色体断片称为B染色体，它们的数目和大小变化很多。

8、A染色体：指真核细胞染色体组的任何正常染色体，包括常染色体和性染色体，它是相对于额外染色体—B染色体而言的。

A染色体在遗传上是重要的，对个体的正常生活和繁殖是必需的。

其数目的增减和结构的变化对机体会造成严重的后果。

9、端粒：是线状染色体末端的DNA重复序列，是真核染色体两臂末端由特定的DNA重复序列构成的结构，使正常染色体端部间不发生融合，保证每条染色体的完整性。

10、Ag-NOR技术:银染法。

原理是由于转录的rDNA部分有丰富的酸性蛋白，它们具有S－H键和S－S键，容易将Ag+还原为Ag的颗粒，从而在活性的核仁形成区镀上银，呈现为黑色的区域。

分带技术：可以显示染色体内部结构分化的技术。

核型：体细胞染色体在光学显微镜下所有可测定的表型特征的总称。

混倍体：不同个体和不同细胞的染色体数目变异幅度较大，出现整倍和非整倍细胞的一系列变异，此为混倍体。

4种栽培大麦染色体组型和C-带带型的比较分析陈全战;杨平【摘要】对栽培大麦4个品种的染色体组型和C-分带带型进行了分析和研究,结果表明:不同大麦品种的染色体C带的分布在数目和强弱存在明显差异,不同大麦品种同一序号的染色体表现不同程度的C-带带型的多态性.【期刊名称】《南京晓庄学院学报》【年(卷),期】2007(023)003【总页数】6页(P57-61,67)【关键词】栽培大麦;核型;C-分带;多态性【作者】陈全战;杨平【作者单位】南京晓庄学院,生命科学系,江苏,南京,210017;南京晓庄学院,生命科学系,江苏,南京,210017【正文语种】中文【中图分类】QP43大麦(Hordeum vulgare L．)属于禾本科(Gramineae)小麦族(Triticeae)大麦亚族(Hordeinae)大麦属(Hordeum)，广泛分布于南北半球的温带［1］．大麦具有早熟、耐旱、抗盐碱、抗黄矮病、抗穗发芽、赖氨酸含量高、适宜晚播、受干热风影响小等性状［2］．大麦还兼具食用、饲用、酿造以及医药等多种用途，是世界性的重要粮食作物之一［3］．目前在生产上应用广泛的大麦1号、大麦3号、驻马店3号和青稞各有其优良性状．驻马店3号是河南省驻马店市农科所利用驻8909作母本，TG4为父本杂交，多年连续选择培育而成的．该品种耐寒性好，耐湿性强，高抗三锈、白粉、条纹赤霉病，在河南、湖北、安徽等地示范表现较好［4］．如果将这些品种进行杂交形成一些超亲组合或农艺性更好的新品种，那对大麦的生产将有重大的意义．而亲本染色体的准确辨认，可为大麦的杂交育种和遗传研究奠定基础．只要掌握亲本染色体带型的基本特征，用染色体分带的方法，能准确地区分杂交后中染色体的组成［5］．传统的染色体鉴定是依靠染色体的形态，其中包括染色体的大小、着丝粒的位置(臂比)、随体的有无和大小等来进行的［6，7］，即核型分析．但核型分析的结果往往受染色体所处分裂时期、前处理条件以及压片技术等因素的影响而产生误差．因此，迫切需要一种简便可靠的染色体直接鉴定技术．上世纪70年代建立起来了一种细胞学技术—染色体分带，包括C带、N带、G带等．最早将C带技术引入大麦染色体显带的是丹麦的大麦染色体专家Linde-Lauresen，1975年用改良的BSG-C带技术研究了普通大麦Emir的染色体，得到了比较清晰的染色体C带带纹［8］．我国仅对啤酒大麦和栽培大麦的少数品种的Giemsa C带以及C带与N带的比较［9-13］研究有过报道．而栽培大麦1号、栽培大麦3号、驻马店3号的C带研究尚未有报道．本文对栽培大麦1号、栽培大麦3号、驻马店3号和青稞的染色体组型和C带带型的研究，目的在于探明大麦染色体C带多态性，为大麦杂交育种提供细胞学选择标记．1．1 材料栽培大麦1号(8612－06)、栽培大麦3号(8742－02)、栽培大麦驻马店3号由河南大学李锁平教授提供．青稞由青海省农科院粮作所提供．1．2 方法1．2．1 根尖细胞染色体制片根尖细胞有丝分裂中期染色体制片参考陈全战(2002)方法［14］．种子在垫有湿滤纸的培养皿中置23℃温箱中发芽．种子露白后，移至4℃冰箱中处理24h，剪根前一天中午移至23℃培养箱中培养，待根长约1～2cm时，于剪根前1～2h升温至28℃，剪取2条根置盛冰水的指形管中，然后连同指形管一起在0℃冰水中处理22～24h．冷处理过的根尖吸去多余的水分，用卡诺氏固定液(3份无水乙醇∶1份冰醋酸)固定．在3—5℃冰箱中保存2—7d，即可制片．制片时取出根尖，用刀片切取根尖生长点部分置载玻片上，用45%醋酸直接压片．相差显微镜下预检后，取染色体分散良好的制片放入－70℃冰箱中冷冻．1．2．2 染色体Giemsa C-分带参照Gill等(1991)方法［15］，经过45%醋酸直接压片的染色体制片置－70℃超低温冰箱中冷冻30min以上，迅速揭去盖玻片后，置无水乙醇中过夜．第二天处理前取出，气干．然后在60℃0．2 NHCl中处理2．5min．用水冲洗;在Ba(OH)2饱和液中于室温下处理7 min．再用水将Ba(OH)2冲洗干净，放入60℃的2 X SSC溶液中处理60 min．然后将载玻片直接转入用1/15M的2份Na2HPO4+1份KH2PO4缓冲液稀释的Giemsa染液中染色至适度，将制片取出．用蒸馏水冲洗，气干后滴二甲苯，盖上盖玻片在油镜下观察并照相．1．2．3 染色体编号参照Linde-Laursen［9］、Noda［16］、李懋学［12］、陈瑞阳［17］等采用的大麦组型排列进行染色体编号．2．1 染色体组型2．1．1 同一大麦品种染色体的核型特点分析栽培大麦1号(8612－06)的染色体从1号到6号是中间着丝粒染色体;7号是亚中间着丝粒染色体并且还有随体(图1，表1)．栽培大麦3号(8742－02)的染色体全是中间着丝粒染色体;是一个较为对称的组型(图2，表2)．驻马店3号的染色体与栽培大麦1号(8612－06)的相似，但也有差异．从1号到6号是中间着丝粒染色体;7号是亚中间着丝粒染色体，6号和7号有不同的随体(图3，表3)．青稞大麦的染色体与以上几种栽培大麦相似，但也有差异．从1号到6号是中间着丝粒染色体;7号是亚中间着丝粒染色体，6号和7号有不同的随体(图4，表4)．2．1．2 不同大麦品种染色体核型特点比较栽培大麦1号(8612－06)、栽培大麦3号(8742－02)、驻马店3号和青稞的染色体从1号到5号都是中间着丝粒染色体，没有明显差异．6号染色体和7染色体具有随体，栽培大麦1号(8612－06)、栽培大麦3号(8742－02)和驻马店3号的7号染色体都是亚中间着丝粒染色体，而青稞的7号染色体为中间着丝粒染色体．由于照片放大的倍数不一样，只能比较相对长度和臂比．相对长度的变化范围最小的是栽培大麦1号(8612－06)，其次是栽培大麦3号(8742－02)，然后是青稞，最后是驻马店3号(表5)．2．2 Giemsa C-分带不同大麦品种同一序号染色体的带型特点比较从图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12中可以看出:不同大麦品系同一序号染色体Giemsa C-带在带的数目和强弱存在明显差异．1号染色体的C-带带型各品种差别较大，但均具有短臂着丝粒带．栽培大麦3号(8742－02)和青稞的短臂上各有一条中间带，而其他品种没有中间带．栽培大麦1号(8612－06)和青稞则各有一条末端带．在长臂上，除栽培大麦3号(8742－02)外其他品种均有着丝粒带，栽培大麦1号(8612－06)有一条中间弱带，栽培大麦3号(8742－02)有一条中间带，而青稞有一条末端带．2号染色体除了在短臂上都有着丝粒带以外，各品种有明显的差异．在短臂上，栽培大麦1号(8612－06)和青稞各有一条中间带，驻马店3号和青稞则各有一条末端带．在长臂上，栽培大麦1号(8612－06)和青稞各有着丝粒带，但栽培大麦1号(8612－06)还有一条中间带．栽培大麦3号(8742－02)有一条末端带，而青稞则有两条中间带．3号染色体在短臂上，四个品种都有一条着丝粒带，驻马店3号还有一条中间带和一条末端带，栽培大麦1号(8612－06)有一条中间带．在长臂上，差别较明显，栽培大麦3号(8742－02)、驻马店3号和青稞都有着丝粒带．栽培大麦1号(8612－06)有两条中间带，一强一弱;驻马店3号只有一条中间带，青稞也有一条弱的中间带．4号染色体的强带分布相对集中，且着丝粒带都为强带．在短臂上四个品种都一条强的近着丝粒中间带．但青稞在着丝粒远端还有一条弱带．在长臂上各有一条靠近着丝粒的中间带．5号染色体，在短臂上除了驻马店3号有一条弱中间带和一条末端带外，四个品种都有一条着丝粒带．在长臂上，驻马店3号和栽培大麦1号(8612－06)各有一条着丝粒带，而栽培大麦3号(8742－02)和青稞则一条靠近着丝粒的中间带．6号染色体都有随体．在短臂上，栽培大麦1号(8612－06)和栽培大麦3号(8742－02)都各有一条近着丝粒带，而驻马店3号有一条弱的中间带和一条末端带，青稞则只有一条末端带．在长臂上，都有近着丝粒带，栽培大麦8612－06有两条中间带，而驻马店3号和青稞各一条中间带．7号染色体都有随体，四个品种都有一条着丝粒带，但带纹差异明显．在短臂上，栽培大麦1号(8612－06)还有一条中间带;青稞除了有一条中间带外，还有一条末端带;栽培大麦3号(8742－02)则只有一条末端带．四个品种都有一条着丝粒带，在长臂上，栽培大麦1号(8612－06)还有一条中间带;而栽培大麦3号(8742－02)还有一条末端带;驻马店3号除了有一条着丝粒带外，还有一条的中间带和一条末端带，青稞则只有一条弱的中间带．4个栽培大麦品种染色体组型在从1号到5号基本相同．同一序号染色体C-带有相同之处，即在短臂上都有一条着丝粒带．但在带的数目和强弱存在明显差异．从带纹可以看出1号到5号的染色体的C-带差别很大．这再一次说明了C-分带的优越性．4个大麦品种染色体组型没有明显的差异，而带型具有品种的特异性．核型分析是对一个物种进行细胞遗传学研究的基础，对一些染色体形态不规则的物种进行核型分析时，仅仅依靠其染色体的长度和臂比特征来做配对分析就很难得到准确的结果．植物染色体的C-分带显示的部位主要是组成型异染色质，它们主要由分布在染色体末端和着丝粒附近的DNA重复序列组成，染色体的C-分带对于大多数植物而言较为稳定，不同物种的染色体C-分带带型具有明显的差异，根据染色体的C-分带可以进行物种的鉴别［18］．4个栽培大麦品种染色体C-带的差异性，说明了这4个栽培大麦品种染色体C-带的多态性．这与1975年Weimarck［19］在黑麦染色体中，1982年Seal［20］在小麦染色体中和1997年王祖秀等［13］人在啤酒大麦染色体中观察到的C-带多态现象很相似这再一次说明了C-分带的多态性．植物染色体C-分带的带型特点在一定程度上还反映物种之间在进化上的亲缘关系．4个栽培大麦品种染色体C-带的差异性，可能与亲缘关系的远近有关．C-带的差异性从染色体水平揭示4个栽培大麦品种的相互关系，为研究大麦的进化提供了依据，也为育种提供了细胞学标记．【相关文献】［1］钟冠昌，穆素梅，张正斌．麦类远缘杂交［M］．北京:科学出版社，2002．［2］李尉霞，齐军仓，张莉，王瑞青．大麦的耐盐性研究进展［J］．福建稻麦科技，2006，24(4):42-44．［3］陈晓静，陈和，陈健，沈会权，徐相宏．推进大麦生产的意义及利用价值的讨论［J］．大麦科学，2003，3:7-9．［4］翟德昌，孟祥锋，王树杰，朱统泉，翟红然．驻大麦3号高产高效特点及其高产优质栽培技术［J］．作物杂志，2003，1:40-43．［5］张毓芳，袁妙葆．大麦染色体分带技术德研究和应用［J］．大麦科学，1994，3:1-4．［6］Darlington 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第一章绪论一、细胞遗传学的研究对象和任务细胞遗传学是遗传学与细胞学相互交叉与结合的一个遗传学的分支学科。

它是用细胞学和遗传学的方法阐明生物的遗传和变异现象及其表观规律的一门基础科学。

细胞遗传学的研究对象、任务和内容：以高等动植物为主要研究对象.研究任务:揭示染色体与生物遗传、变异和进化的关系.内容包括：染色体的数目、形态、结构、功能与运动等特征以及这些特征的各类变异对遗传传递、重组、表达与调控的作用和影响.第二章染色体的形态特征和结构§1。

染色体的一般形态特征一、染色体数目不同种类动植物染色体数目是相对恒定的。

二、染色体大小不同染色体之间大小有很大差异是染色体最明显的形态特征。

●影响染色体大小变异的因素1.与物种亲缘关系有关一般是亲缘关系越远，大小变异越明显。

科间﹥属间﹥种间﹥种内2.与生长发育有关3。

与外界环境条件有关如化学试剂、温度影响三、着丝粒及其超微结构●定义：着丝粒是一个细长的DNA片段(染色体主缢痕部位的染色质),不紧密卷曲，连接两个染色单体，是染色体分离与运动装置。

缺少着丝粒的染色体不能分离并导致染色体丢失。

●功能:着丝粒又称动原体，是染色体的运动器官，也是姐妹染色单体在分开前相互连接的部位.两侧为异染色质区，由短的DNA串联重复序列构成.着丝粒断裂、缺失，会使染色体运动受阻,造成染色体丢失。

●类型根据着丝粒在染色体上的位置和分布，分为：1。

有固定位置的着丝粒在染色体上着丝粒具有永久性的固定区域.2。

新着丝粒细胞分裂时除了正常着丝粒外,在染色体上出现的具有类似着丝粒功能的其他区域.3。

无固定位置的着丝粒指纺锤体附着点在染色体上没有固定的位置.(1）多着丝粒在一个染色体上可附着多个纺锤丝，且着丝粒被非着丝粒片段隔开。

（2）全身性着丝粒染色体的每一点都表现有着丝粒的活性，即整个染色体上均有着丝粒分布现象，又称为分散型着丝粒。

四、次缢痕、核仁组织区和随体●次缢痕和核仁组织区在一个染色体组中，除了主缢痕外，任何其他的缢痕都属于次缢痕。

实验3、植物染色体标本制备及核型分析目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。

Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura 和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。

压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。

压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。

两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。

一、实验目的1、掌握植物根尖、茎尖及叶片去壁低渗染色体制片技术，通过3周开放性实验教学，进行植物染色体制片技能训练；2、掌握植物染色体显微照象技术及组型分析技术，通过大量的制片观察，能获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型制片；通过显微摄影，获得某植物染色体自然核型图，并能用国内外通用的植物核型分析标准，确定该植物染色体模型图、核式公式及类型；3、掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像，收集核型分析及有丝分裂过程观察的染色体制片素材；4、结合实验，对某一新资源植物进行染色体组型分析，获得该物种染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图。

植物的性别决定与伴性遗传动物有XX-XY型、ZW-ZZ型等性别决定和伴性遗传的特性。

那么，植物也有这些特性吗？本文就植物的性别决定和伴性遗传作一介绍，供参考。

(一)植物性别的染色体决定自1923年发现植物性染色体后，至今已知25科70多种植物含有性染色体。

以性染色体方式决定性别的植物，绝大多数是雌雄异体的，并在雌雄配子结合时就决定了其性别。

这类植物的性别决定有以下几种形式。

1．XX-XY型属于此类型性别决定的植物有大麻、蛇麻、菠菜、银杏、青刚柳等。

这种类型性别决定的雌株是同配型的(XX)，雄株是异配型的(XY)。

经研究过的多数植物是属于XX-XY型染色体性别决定。

2．XX-XO型这种类型性别决定的雌株是同配型的(XX)，雄株是缺失配合型的(XO)。

花椒属于该类型性别决定，其雄株配子有两种：n=34+X、34+O，雌株配子却只有一种：n=34+X。

3．ZW-ZZ型同配型的ZZ为雄株，异配型的ZW为雌株。

凤梨形草莓就是属于此类型性别决定。

4．X/Y平衡性别由性染色体X、Y平衡决定，但Y的作用更强些。

如剪秋罗：5．X/A平衡性别由性染色体X与常染色体A平衡决定，Y染色体不影响性别表现。

如酸模：6．性染色体决定性别的证明1948年Westergand证明了Y染色体在决定雄性中的作用。

经研究，Lychnis的X和Y染色体在大小上有明显的区别，X较Y小，但它们又均大于常染色体。

Y 染色体有4个区域：♀抑制区、♂启动区、♂育性区、与X染色体的同源区。

研究表明，当抑制区缺失时，就会产生完全花；启动区缺失时，原来的雄株变成雌株；育性区缺失时，就会形成雄性不育株。

决定雌性的基因大部分位于X染色体上。

Kbhtko．K．B．以大麻为实验材料，验证了XX-XY型性别决定的配子的同型性和异型性。

验证采用了2种方法：一是采用性别转化后进行自交的方法(即在某种条件作用下，使雄株或雌株产生异性花或两性花，然后进行自交)；二是用雌雄单性植株分别与雌雄同株植株杂交。