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大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质李倩;徐美娟;夏海锋;饶志明【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2011(030)002【摘要】以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000.选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%.并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适PH值为6.0,在PH值2.0～6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好.K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用.醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性.酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47 μmol/(L·min).【总页数】6页(P267-272)【作者】李倩;徐美娟;夏海锋;饶志明【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质 [J], 魏涛;孙浩;申玉龙;毛多斌2.牦牛MDHⅡ基因克隆表达及脂代谢候选基因关联性分析 [J], 陈露露;王会;王吉坤;柴志欣;王嘉博;陈智华;信金伟;姬秋梅;钟金城3.丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究 [J], 杨登峰;韦宇拓;周兴;黄志民;黄日波4.大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质 [J], 于平;刘航;朱鹏志;胡淳玉;杨柳贞;贺敏;马健5.鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备 [J], 丁忠庆;刘胜旺;孔宪刚;宋铭忻因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基金项目国家级大学生创新创业训练项目（20221135041）。
作者简介盛明俊（2002—），男，安徽安庆人，从事食品质量与安全研究。
通信作者马龙（1979—），男，安徽蚌埠人，博士，副教授，从事食品科学与工程研究。
收稿日期2023-11-16L-苹果酸的生产方法、生理功能及其应用盛明俊詹凯马龙（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠233000）摘要L-苹果酸是一种天然有机酸，易溶于水和乙醇，其作为良好的食品酸味剂，被广泛应用于食品工业。
本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。
关键词L-苹果酸；酶转化；细胞转化法；微生物发酵法；食品工业中图分类号TS201.2；S377文献标识码A文章编号1007-7731（2024）01-0082-06苹果酸，又名2-羟基丁二酸，分子式为C 4H 6O 5，相对分子质量为134.09。
苹果酸的分子中存在一个不对称碳原子，有2种异构体，在大自然中以D-苹果酸、DL-苹果酸和L-苹果酸3种形式存在。
D-苹果酸难以被人体吸收利用，经过化学合成法生产出来的DL-苹果酸可能具有一定的毒性，而L-苹果酸可以被人体吸收利用，并且具有一定的生理功能[1]。
本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。
1L-苹果酸的生产方法L-苹果酸的生产方法由直接提取法、化学合成法发展到目前的酶转化或细胞转化法和微生物发酵法等。
1.1直接提取法L-苹果酸广泛存在于蔬菜和未成熟的水果中。
直接提取法的操作原理是先将未成熟的苹果、葡萄和桃的果汁或蔬菜汁煮沸，后加入石灰水，得到钙盐沉淀；随后将钙盐转变为铅盐，并经处理得到游离酸，即可得到L-苹果酸。
大肠杆菌植酸酶AppA在毕赤酵母中的高效表达高娇，郑学云，林影，梁书利（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）摘要：本研究全基因合成大肠杆菌B48来源的植酸酶AppA基因，并将它克隆到PHKA载体上，在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。
为了进一步提高毕赤酵母中植酸酶的表达量，本研究结合信号肽、启动子、基因剂量和蛋白质折叠通量优化的方法，最终将毕赤酵母中植酸酶的活力从329.41 U/mL提高到了1892.51 U/mL，是初始菌株的5.75倍。
初步测定了植酸酶AppA的基本酶学性质，其最适温度和pH分别为60 ℃和4.5；在60 ℃处理60 min后，植酸酶活力剩余40%，温度稳定性较差；在pH 6.0~7.0处理6 h后，酶活力剩余87%，该酶在弱酸环境中有较好的稳定性；同时研究了二价金属离子对植酸酶活力的影响，Fe2+能够激活植酸酶AppA的活力，而Cu2+、Ni2+、Mn2+等离子通过与植酸形成络合物而抑制植酸酶AppA的活力。
该酶在酸性条件下的强稳定性有利于将其应用于食品加工领域。
关键词：毕赤酵母；植酸酶；表达元件；基因剂量；调控因子文章篇号：1673-9078(2019)12-137-144 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.12.018 Efficient Expression of Escherichia coli AppA Phytase in Pichia pastorisGAO Jiao, ZHENG Xue-yun, LIN Ying, LIANG Shu-li(Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering, School of Bioscience and Bioengineering, South ChinaUniversity of Technology, Guangzhou 510006, China)Abstract: In this study, the phytase gene, AppA, derived from Escherichia coli B48 was synthesized by whole gene, and cloned into PHKA vector for secretion expression in Pichia pastoris GS115. In order to further increase the expression of phytase in Pichia pastoris, this study adopted the optimization method based on the combination of signal peptide, promoter, gene dose and protein folding flux, which led to an ultimate increase of the phytase activity in Pichia pastoris from 329.41 U/mL to 1892.51 U/mL (5.75 times as high as that of the original strain). The basic enzymatic properties of phytase AppA were preliminarily determined, and the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 4.5, respectively. After a 60-min treatment at 60 ℃, 40% of the phytase activity was retained, indicating poor thermal stability. After a 6-h treatment at pH 6.0~7.0, 87% of the enzyme activity was retained, indicating good stability in a weak acid environment. The effect of divalent metal ions on phytase activity was also studied. Fe2+ could activate phytase AppA, while ions such as Cu2+, Ni2+ and Mn2+ may inhibit the activity of phytase AppA through forming a complex with phytic acid. The high stability of the enzyme under acidic conditions is advantageous for its application in the field of food processing.Key words: Pichia pastoris; phytaseAppA; expression element; gene dose; regulatory factor植酸酶是水解植酸及其盐类生成肌醇和磷酸的一类酶的总称。
大肠杆菌发酵经验总结大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5〜10g/L的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌苹果酸脱氢酶的原核表达、纯化与酶活力测定摘要：苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)普遍存在动物、植物、细菌等多种生物体中，负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换，在细胞的多种生理活动中发挥重要作用，如C4循环、光合作用、TCA循环。
本实验从实验室保存的DH5α重组菌中提取pET28b-mdh重组质粒，并对其进行双酶切鉴定。
将重组质粒pET28b-mdh转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中，通过卡那霉素和氯霉素抗性进行筛选。
挑取单菌落培养至菌体浓度OD600≈0.6时，用0.1 mM的IPTG诱导表达MDH蛋白，然后收集、纯化MDH蛋白并分析其酶活力。
结果表明，MDH在大肠杆菌中获得了高量表达，MDH还原草酰乙酸的活力为194.75 U/mg。
关键词：苹果酸脱氢酶；原核表达；活力测定Expression and Purification of Malate Dehydrogenase from Escherichia coli and its Activity DeterminationAbstract: Malate Dehydrogenase is ubiquitous in animals, plants, and bacterias, which catalyzed the interconversion of oxaloacetate and malate linked to the oxidation/reduction of dinucleotide coenzymes, which play a key role in many metabolic pathways such as TCA cycle, photosynthesis, C4 cycle and so on. In this study, we extracted pET28b-mdh recombinant plasmid from DH5α, which was preserved in our laboratory, and examined the recombinant plasmid correctness through double enzymes digestion reaction. Then we transformed the recombinant plasmid into E.coli Rosetta(DE3) and screened the positive recombinant strain thought kalamycin and chloromycetin resistance. And then we cultured the individual colony until OD600≈0.6, then added IPTG to the finally concentration 0.1mM to induce the expression of MDH. We collected and purified the MDH and then analyzed MDH enzyme activity. The result showed that MDH can be highly induced to express in E.coli and its activity to reduce oxaloacetate is 194.75 U/mg. Keywords: malate dehydrogenase; prokaryotic expression; activity assay1 前言1.1苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH; EC 1.1.1.37)普遍存在于动物、植物和细菌等各种生物体中，是生物体糖代谢的关键酶之一。
大肠杆菌代谢途径改造策略与应用研究进展李冉;黄玉清;贾振华【摘要】大肠杆菌由于具有稳定性强和易于操作的特点成为基因改造常用的宿主微生物.利用基因工程手段改造大肠杆菌的代谢途径,可用于生物燃料、手性药物及其衍生物的合成.利用代谢组学和合成生物学能够高效地以大肠杆菌作为生物催化剂生产目标物.综述了大肠杆菌中丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸代谢途径的改造策略,以及大肠杆菌代谢途径的改造在合成生物燃料、砌块化合物中的应用,为研究者以大肠杆菌合成目标化合物的研究提供一个整体的思路和方法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)008【总页数】6页(P232-237)【关键词】大肠杆菌;代谢途径;生物燃料;砌块化合物【作者】李冉;黄玉清;贾振华【作者单位】河北省科学院生物研究所,石家庄 050051;河北省科学院生物研究所,石家庄 050051;河北省科学院生物研究所,石家庄 050051【正文语种】中文大肠杆菌的代谢组学已研究的很透彻，与其他微生物相比，其自身的代谢途径更加稳定且易于改造，因此大肠杆菌作为一种工业微生物被广泛应用于代谢途径改造的研究。
目前对大肠杆菌改造的研究集中在四条主要代谢途径，包括丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸代谢途径，用于醇类、有机脂肪酸、氨基酸、类异物二烯和芳香族化合物的合成。
大肠杆菌的系统代谢工程在生物燃料和砌块化合物的合成中均有研究和应用，它将整个生物过程的系统生物学和合成生物学相结合，有助于制定有效的策略改造微生物菌株，以便使目标化学品的生产产量和生产效率最大化，同时使整个上游和下游的工艺成本最小化。
常用的技术主要包括自身代谢途径的基因敲除、过表达以及导入新的代谢途径。
本文综述了大肠杆菌系统代谢工程在自身代谢途径改造策略，在生产生物燃料、砌块化合物的微生物开发中所使用的工具和策略，以期为研究者以大肠杆菌合成目标化合物的研究提供一个整体的思路和方法。
安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull.2009,15(10)51苹果酸酶的分子生物学研究进展郑恩霞 程文娟 王宗达 王 敖（安徽师范大学生物分子进化重点实验室；安徽芜湖241000）摘 要：苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD（P）+的还原反应。
根据辅酶特异性，苹果酸酶可分为NAD+或NADP+依赖性苹果酸酶，并广泛存在于自然界中。
苹果酸酶广泛地参与不同的代谢途径，包括C4植物中的固碳作用、真菌和动物中脂质合成的NADPH源泉、以及组织快速繁殖时线粒体能量的供给等。
对苹果酸酶的生化特性、空间结构特点、催化机理的研究，将为代谢工程奠定基础。
关键词：苹果酸酶；辅酶特异性；催化机制；功能中图分类号Q55 文献标识码B 文章编号1007-7731（2009）10-051-003Advances in Research of Molecular Biology of Malic EnzymeZheng Enxia et al(The Key Laboratory of Molecular Evolution; Anhui Normal University, Wuhu 241000）Abstract: Malic enzyme （ME）, important malate metabolizing enzyme, catalyzes the reversible oxidativedecarboxylation of L-malate coupled with the reduction of dinucleotide cofactor NAD（P）+ to yield pyruvate and CO2.These enzymes can use NAD+（NAD-ME）or NADP+（NADP-ME）as essential cofactors and are widely distributed in most living organisms. As the catalytic products by MEs can support diverse biological processes, MEs are involvedin a great number of metabolic pathways, including carbon fixation in tropical C4plants, lipogenic NADPH production in fungi and animals, and energy production in rapidly proliferating tissues. The research on biochemical properties, crystal structure and catalytic mechanism will be the fundamental work for the future manipulation of metabolic engineering.Key Words: malic enzyme; coenzyme specificity; catalytic mechanism; function苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD（P）+的还原反应[1-3]。
大肠杆菌苹果酸合酶A的酶学和生理功能研究王程;王敖;赵旵军;朱国萍【摘要】Malate synthase is one of the key enzymes in glyoxylate cycle. The aceB gene, encoding malate synthase A ( MSA) , was amplified from the genomic DNA of Escherichia coli MC1655 using PCR with primers designed according to the sequence of E. coli genome. The PCR product was cloned into pET-29b( + ) , resulting the recombinant plasmid pET-MSA. The target protein ( MSA) was overexpressed in E. coli Rosetta ( DE3) under IPTG induction, and then the enzyme was purified to homogeneity. The molecular weight ( MW) of MSA was about 60 kDa. The optimal pH and temperature of MSA were pH 8. 0 and 30 C, respectively. The maximum activity of purified MSA was observed in the presence of Mg2+ . The Km and Vmax values for acetyl-CoA of MSA were 8. 07 μM and 3. 6μM/min, respectively. Furthermore, the mutant strains, MG: : ΔaceB with MSA deletion and MG: : ΔaceBΔglcB with MSA and malate synthase G( MSG) deletion, were constructed, respectively. It was observed that the growth rate of the mutant E. coli strain with MSA deletion was remarkably lower than that of the wild-type strain, indicating that MSA was essential for E. coli growth on acetate. Although MSG was able to partially recover the function of MSA , the glyoxylate bypass containing MSA was the much more effective metabolic pathway of glyoxylate.%苹果酸合酶是乙醛酸循环的关键酶之一.E.coli中苹果酸合酶A(malate synthase A,MSA)由aceB基因编码.根据E.coli基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增aceB基因,并将其克隆入pET-29t,(+),构建了重组表达质粒pET-MSA.经IPTG诱导,MSA在E.coli Rosetta(DE3)中获得高效表达.纯化的MSA蛋白的分子量大小约为60 kDa,最适反应pH值和最适温度分别是pH值8.0、30℃.纯化的蛋白质在Mg2+存在时才能发挥最大的活性,其对乙酰辅酶A的Km和Vmax分别是8.07μM和3.6μM/min.此外构建了MSA和苹果酸合酶G(MSG)基因敲除菌株MG::AaceB和MG::AaceBAglcB.研究发现缺少MSA的E.coli突变菌株在乙酸中的生长速率要比野生型菌株慢很多,表明MSA对大肠杆菌在乙酸中的生长起着重要作用.MSG虽然能部分补偿MSA的作用,但是包含MSA的乙醛酸旁路是更有效的乙醛酸代谢途径.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】5页(P39-42,46)【关键词】苹果酸合酶A;表达;动力学;生长速率;大肠杆菌【作者】王程;王敖;赵旵军;朱国萍【作者单位】安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000;芜湖市第二人民医院检验科,芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】Q7SAbstract:Malate synthase is one of the key enzymes in glyoxylatecycle.TheaceBgene,encoding malate synthase A(MSA),was amplified from the genomic DNA ofEscherichia coliMG1655 using PCR with primersdesigned according to the sequence ofE.coligenome.The PCR productwas cloned into pET-29b(+),resulting the recombinant plasmid pET-MSA.The target protein(MSA)was overexpressed inE.coliRosetta(DE3)under IPTG induction,and then the enzyme was purified to homogeneity.The molecular weight(MW)ofMSA was about60 kDa.The optimalpH and temperature ofMSA were pH 8.0 and 30 C,respectively.Themaximum activity of purifiedMSA was observed in the presenceofMg2+.TheKmandVmaxvalues for acetyl-CoA ofMSA were 8.07μM and 3.6 μM/min,respectively.Further more,the mutantstrains,MG::ΔaceBwithMSA deletion andMG::ΔaceBΔglcBwithMSA andmalate synthase G(MSG)deletion,wereconstructed,respectively.Itwasobserved that the growth rate of themutantE.colistrainwithMSA deletion was remarkably lower than that of the wild-type strain,indicating thatMSA was essential forE.coligrowth on acetate.AlthoughMSGwas able to partially recover the function ofMSA,the glyoxylate bypass containingMSA was themuchmore effectivemetabolic pathway of glyoxylate.Keywords:malate synthase A;expression;kinetics;growth rate;Escherichia coli乙醛酸循环又称乙醛酸途径,是三羧酸循环的回补途径,两者之间存在着某些相同的酶类和中间产物。
乙醛酸循环中有两个关键性酶,即异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)和苹果酸合酶 (malate synthase,MS),前者催化异柠檬酸生成乙醛酸和琥珀酸,而后者催化乙醛酸和乙酰辅酶 A缩合形成苹果酸和辅酶 A。
乙醛酸循环的终产物将参与糖异生途径以及其它的生物合成途径[1]。
乙醛酸循环在古菌、细菌、真菌、原生动物以及萌发的植物种子中均有发现[1-2]。
此外,一些研究报道在脊椎动物中也发现了 ICL和MS的活性,尽管人们认为这些动物中并不存在乙醛酸循环。
在微生物和高等植物幼苗以 C2化合物为原料合成碳水化合物的过程中,乙醛酸循环起着十分重要的作用[3]。
同时,一些研究也指出在分枝杆菌 (M ycobacteria)中,病菌的持续感染能力与乙醛酸循环直接相关[4]。
苹果酸合酶有两种同工酶,即苹果酸合酶A和苹果酸合酶 G,分别简称为MSA和MSG。
MSG仅存在于细菌中,而 MSA在细菌、真菌和植物中都有发现。
E.coli同时含有这两种苹果酸合酶,其中MSA由 aceB基因编码,参与乙醛酸循环,MSG由glcB基因编码,与乙醇酸盐(glycolate)的利用有关[5]。
本文依据 GenBank中已报道的 E.coli基因组序列,克隆了 aceB基因,实现了高效表达与纯化,并对MSA的酶学性质进行了鉴定。
另一方面,利用染色体同源重组技术敲除了 E.coliMG1655中的 aceB基因和glcB基因,通过测定缺陷型菌株的生长速率,对 MSA的生理功能进行了初步研究。
1.1 材料1.1.1 菌株和质粒E.coliMG1655和DH5α为本实验室保存,质粒pET-29b(+)及宿主菌E.coliRosetta(DE3)由中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室周丛照教授惠赠。
1.1.2 培养基和试剂LB、SOB、SOC和MD培养基的配方见文献[6]。
生长曲线测量时使用的乙酸-MOPS和葡萄糖-MOPS培养基中分别包含 2%的乙酸和 2%的葡萄糖,如文献所述[7]。
DNA聚合酶、限制性内切酶购于 New England Biolabs,T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒(W izard®Plus SVminipreps DNA Purification System)、胶回收试剂盒(W izard®SV Gel and PCR Clean-Up System)购于 Promega公司,高保真PrimeSTAR®HS DNA聚合酶购于TaKaRa公司,标准蛋白分子量购于Fermentas公司,蛋白质纯化试剂盒购于 Clontech公司。
