第六章沉淀反应
第一节沉淀反应的特点
沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。
沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段：
第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。
第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验
一、絮状沉淀试验
抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。
（一）抗原稀释法
（二）抗体稀释法
（三）方阵滴定法
抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
方阵滴定法即棋盘滴定法
二、免疫浊度测定
免疫浊度测定本质上属于液体内沉淀反应。
将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应。
可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素
1、抗原抗体的比例
抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素，当抗原和抗体的比例适当时，二者全部结合，既无过剩的抗原，也无过剩的抗体。
当反应液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
当抗原过量时，形成的IC（免疫复合物）分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
2、抗体的质量
免疫比浊测定法要求抗体的特异性强、效价高、亲和力强，并使用R型抗体。
3、抗原抗体反应的溶液
抗原抗体反应液的最适pH为6.5～8.5。
一般常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。
4、增浊剂
某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20。
其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形
成大分子复合物。
（二）抗体稀释法
1、透射免疫比浊法
2、散射免疫比浊法
3、免疫胶乳比浊法
第三节凝胶内沉淀试验
凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。
一、单向扩散试验
单向扩散试验是在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。
（一）试管法
将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液，使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。
（二）平板法
将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48小时后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。
1、Mancini曲线适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。
2、Fahey曲线适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数值画线,浓度对数与扩散环直径呈线性关系。
（三）影响因素
1、抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。
2、每次测定都必须作标准曲线。
3、每次测定时必须用质控血清作质控。
4、注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。
5、应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。
二、双向扩散试验
双向扩散试验是让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。
（一）试管法
（二）平板法
是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
先在平板玻璃上倾注一均匀的琼脂薄层，凝固后在琼脂板上打孔，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃ 18～24小时后,琼脂中各自扩散的抗原和相对应的抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。
1、抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计。
沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大。
沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大。
不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原或者抗原过量。
2、抗原或抗体相对分子量的分析
抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。
分子量小者扩散快，反之则较慢。
由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。
如果两者分子量大致相等，则形成直线。
3、抗原性质的分析
两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同。
沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同。
两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。
4、抗体效价的滴定
双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法。
固定抗原的浓度，稀释抗体。
或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。
5、抗原或抗体纯度鉴定
出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯。
出现多条沉淀线说明不纯。
第四节免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。
加快了沉淀反应的速度。
电场规定了抗原抗体的扩散方向，使其集中，提高了灵敏度。
可将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。
一、对流免疫电泳
对流免疫电泳实质上是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。
在pH8.6的缓冲液中,大部分蛋白质抗原成分常带较强的负电荷，在电场中向正极移动。
而作为抗体的IgG，等电点偏高（约为pH6～7），在pH8.6时带负电荷较少，再加上分子量较大,移动速度慢，所以它本身向正极移动缓慢甚至不移动，这样它就会在凝胶的电渗作用下，随水流向负极。
电渗引向负极移动的液流速度超过了IgG 向正极的移动速度，因此抗体移向负极，在抗原抗体最适比处形成沉淀线，从沉淀线相对于两孔的位置还可大致判断抗原抗体的比例关系。
实验时在琼脂板上打两排孔，标记上正极与负极，将抗原溶液放入负极侧的孔内，相应抗体放入正极侧的孔内，通电后，带负电荷的抗原向正极泳动，而抗体借电渗作用向负极泳动，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线。
二、火箭免疫电泳
火箭免疫电泳是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，实质上是加速的单向扩散试验。
实验时，将抗体混合于琼脂中，样品孔中的抗原置于负极端，电泳时抗体不移动，抗原向正极泳动，
随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。
当琼脂中抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关，因此用已知标准抗原作对照，抗原浓度为横坐标，峰的高度为纵坐标，绘制标准曲线，待测样品浓度就可根据沉淀峰的高度在标准曲线中计算获得。
三、免疫电泳
免疫电泳技术是区带电泳+免疫双向扩散。
检测原理是先用区带电泳技术将蛋白质抗原按其所带电荷、分子量和构型不同在凝胶中电泳，分成肉眼不可见的若干区带，电泳停止后，沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清，置室温37℃作双向扩散，经18～24小时后，已分离成区带的各种抗原成分与抗体槽中相应抗体在两者比例适合处形成弧形沉淀线。
免疫电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定方面，例如多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。
四、免疫固定电泳
免疫固定电泳是电泳加沉淀反应技术，可用于各种蛋白质的鉴定。
该方法原理是先将待检样品在凝胶板上作区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清，当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。
本法可用于鉴定迁移率近似的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液、脑脊液等微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等。
最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析，目前已作为常规检测。
五、交叉免疫电泳
交叉免疫电泳是将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术。
交叉免疫电泳是一种有效的抗原蛋白定量技术，可一次同时对多种抗原定量。
分辨率较高，有利于各种蛋白组分的比较，对于蛋白质遗传多态性、微小异质性、蛋白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析。
第五节沉淀反应在医学检验中的应用
免疫浊度法主要用于血液、体液中蛋白质的测定，如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、补体C3、补体C4、血浆蛋白（前白蛋白、α-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、血浆酮蓝蛋白、结合球蛋白、转铁蛋白）；尿微量蛋白系列和半抗原（如激素、毒物和各种治疗性药物）。
免疫浊度法最大的优点是稳定性好，敏感度高（达ng／L），精确度高（CV＜5%），简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合于大批量标本的检测。
免疫固定电泳技术最大的优势是分辨力强，敏感度高，结果易于分析,现最常用于血清中M蛋白的鉴定与分型，并已列入临床实验室的常规检测工作。
免疫固定电泳也用于尿液中本-周蛋白的检测及κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。
