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大豆制品中尿素酶活性的测定方法
方法一尿素酶活性快速测定法——酚红法（粗略法）
1. 原理：尿素酶 +
尿素 氨气（用酚红作指示剂） 2.试剂
（1） 0.1N 氧化钠：称0.4g 氢氧化钠溶于100ml 水中。
（2） 0.1N 硫酸：将1.4ml 浓硫酸溶于l000ml 水中（先加水后加入硫酸） 3.尿素—酚红溶液：
0.14g 酚红溶于35ml 水中+7ml0.1N 氢氧化钠
混合 0.1N 硫酸滴定 琥珀色 21g 尿素溶于300ml 水中
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。
稀硫酸0.2N
尿素—酚红试剂：将1.2g 酚红溶解于30ml0.2N 的氢氧化钠中，用蒸馏水将之稀释至约300ml,加入90g 尿素（分析纯）并溶解之，用蒸馏水稀释至2L ，加入14ml1.0N 硫酸或70ml0.2N 的硫酸；用蒸馏水稀释至最后体积3L ；溶液应具有明亮的琥珀色。
（过段时间溶液变为深桔红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次成为琥珀色。
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。
溶液保质期最好3个月，最好一个月内用完。
尿酶活性度的简易鉴别法尿素酶是一种人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染中常见的酶，它既是人和动物中某些致病菌的致病因子之一，又是某些氮源性腐败物转化所必须具备的酶之一. 它是人类首次获得晶体并发现含有Ni离子的金属酶。
大豆饼粕是我国最常用的一种植物性蛋白质饲料，蛋白质含量42%～45%，可高达47%。
但未经热处理或热处理不彻底的大豆饼粕中含有对畜禽有害的抗胰蛋白酶、脲酶、血球凝集素、皂角苷、甲状腺肿诱发因子以及抗凝血因子等抗营养因子，其中抗胰蛋白酶的影响最大，可导致动物胰腺肿大、胆功能异常，影响饲料蛋白质的消化、利用，降低其生物学效价，进而影响畜禽的正常生长发育和生产性能，尤其是对肉仔鸡。
目前认为较好的大豆热处理方法是120℃高压处理15min或者105℃蒸煮30min。
若加热过渡，在灭活抗胰蛋白酶等抗营养因子的同时，也会破坏热敏氨基酸，特别是赖氨酸、精氨酸、大大降低大豆饼粕的消化率及生物学价值。
因此，加热程度不同，加工后大豆饼粕中有毒有害物质的含量不同，其营养价值和饲喂效果也不同。
测定抗胰蛋白酶活性，可直接反映大豆饼粕中抗营养因子水平及加热程度，但该法比较复杂，因此在生产中广泛采用间接的方法——测脲酶活性法。
脲酶活性与抗胰蛋白酶活性呈高度正相关，而且脲酶活性的测定方法与测定其他抗营养因子的方法相比较有简便、快速和经济的优点。
许多国家都制定了脲酶活性标准，我国规定：大豆粕的脲酶活性不得超过0.4。
（GB/T 8622—2006）方法一：一、原理通过在有苯酚红指示剂的情况下，大豆饼粕中含有的尿素酶将试剂中尿素转化成为氨气使样面呈碱性红色反应，作为变性测量。
苯酚红指示剂：PH1.2（橙）—3.0（黄），PH6.5（棕黄）—8.2（紫红）二、仪器：量筒、量杯、玻璃棒、培养皿、不锈钢勺、试剂瓶、滴瓶、烧杯、天平（适量为0.01g）。
三、试剂：1、0.1mol NaoH2、0.05mol H2SO43、尿素苯酚红溶液溶解0.14g 苯酚红于7ml0.1mol NaoH和35ml蒸馏水中，溶解21g尿素（分析纯）于300ml蒸馏水中。
大豆制品中尿素酶活性测定方法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1福林法试剂及溶液:以下试剂都为分析纯福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3),定容至1000mL。
三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH),定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),定容至1000mL,即成溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),定容至1000mL,即成溶液(B液)。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至,加入氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究彭辉才1粱明振1’张宏福2(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆粕进行测定,前两者含量极低未检出。
用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋白(B--Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是一种有效的钝化抗营养因子的方法。
关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。
发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。
这些酶把纤维类物质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。
发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。
大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲状腺肿因子、生氰糖甙等。
这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。
本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。
1材料与方法1.1腮酶的测定脲酶活性测定参照国标GB8622--88执行。
质检豆粕总结第1篇豆粕中存在着许多抗营养因子，如胰蛋白酶_、低聚糖、大豆凝血素、植酸、脲酶、大豆抗原蛋白(致敏因子)及致甲状腺肿素等，这些抗营养因子不仅影响饲料的适口性，还会影响饲料的营养价值和动物的物质消化吸收以及体内的一些生理过程，严重影响了动物的健康和生产性能。
通常检测豆粕品质的方法有以下几种：1.尿素酶活性(UA)测定法UA测定法是用于测定大豆中脲酶活性的方法，也是测定豆粕中胰蛋白酶_的间接方法，是评定大豆粕的加工程度是否适当及营养品质优劣的传统方法。
将粉碎的大豆粕与中性尿素缓冲溶液混合，在30±℃温度下保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨，在中性条件下用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠回滴，计算出每分钟每克大豆粕释放氨态氮的毫克数来表示尿素酶的活性(UA)。
通常认为豆粕中脲酶活性越低，豆粕的营养价值就越高，但如果加热过度又会引起氨基酸的被破坏。
2.蛋白溶解度(PS)测定法此方法被认为是一项优于UA测定方法的评估大豆加工过度与加工不足的最佳方法。
方法主要是用氢氧化钾溶解豆粕，测定其中的蛋白含量占未用氢氧化钾处理的豆粕中的蛋白含量的百分比，来表示蛋白溶解度。
其原理是：加热使游离氨基酸与其他化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内的结合键，因而降低了蛋白质的溶解。
一般情况下蛋白溶解度低于70%的豆粕营养价值已受到破坏，低于65%几乎可以肯定豆粕加热过度，严重过熟，致使蛋白的消化利用率会非常低。
近年来由于加工技术的改进，PS有增高的趋势。
有研究表明，豆粕蛋白在氢氧化钾溶液中的溶解度和脲酶活性呈正相关。
3.营养成分检测评定根据我国国家标准GB/T19541-2004，饲料用大豆粕的质量标准及分级标准主要以粗蛋白、粗纤维、粗灰分为质量指标，按含量分为三级。
三级大豆粕质量指标必须全部符合相应等级规定，二级饲用大豆粕为中等质量指标，低于三级者为等外品。
测定豆粕各项营养成分是评定豆粕营养价值的重要方法。
大豆制品中尿素酶活性的两种快速检测法饲料公司酚红法1原理酚红指示剂在pH6.4~8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶，在室温下可将尿素水解产生氨。
释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断尿素酶活性的大小。
2仪器和试剂2.1粉碎装置粉碎时应不产生强烈发热（如研钵、球磨机）；2.2天平感量0.01 g；2.3 试管直径18 mm，150 mm；2.4尿素；2.5酚红试剂1g/L乙醇溶液。
3测定步骤将试样研细，称取0.02 g试样，称准至0.01 g，转入试管中。
加入0.02 g结晶尿素及2滴酚红指示剂，加20~30 mL蒸馏水，摇动10 s。
观察溶液颜色，并记下呈粉红色的时间。
4尿素酶活性的测定结果表示1 min内呈粉红色为：活性很强；1~5 min内呈粉红色为：活性强；5~15 min内呈粉红色为：有点活性；15~30 min内呈粉红色为：没有活性。
注：通常，10 min以上不显粉红色或红色的大豆制品，其尿素酶活性即认为合格。
饲料公司pH-增值法本法是美国、日本和前苏联等国常用方法。
尿素水解释放的氨是碱性的，可使溶液pH值升高。
试样反应30 min后，与空白溶液的pH之差数，可间接用来表示氨量的多少。
1. 仪器设备1.1 恒温水浴须能保持温度于30℃±0.5℃；1.2 酸度计（pH计）具有玻璃电极、甘汞电极、可测试5 mL 的溶液。
此为一种精密仪器，须装有温度补正器，其敏感度应为±0.02 pH单位或更佳。
仪器操作及pH值测定均应依照制造商的说明，该pH计应在测定前以标准缓冲液加以校正。
1.2试管20 mm×150 mm并配有橡皮塞。
2. 试剂2.1 取0.05 mol/L磷酸盐缓冲液溶解3.403 g磷酸二氢钾（KH2PO4）于约100 mL新蒸馏水中，溶解4.335 g磷酸氢二钾（K2HPO4）于约100 mL的蒸馏水中，然后将此两种溶液合并配成1000 mL。
豆粕中酶活性测定
尿酶(Urease)：生大豆中含不等量尿酶，尿酶本身无营养意义，但是它与抗胰蛋白酶含量接近，而且遇热失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此以尿酶活性用作豆粕加工适宜度的简单估测指标。
但是加工适宜度不仅取决于畜种、年龄和畜禽阶段，也取决于大豆品种及储存状况。
严寒损伤的大豆储存6个月以上，则抗胰蛋白酶含量会增加，但是未受损伤的大豆就没有这种现象。
附录A大豆制品中尿素酶活性测定方法
GB/T 8622-1988
A.1 适用范围
本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿酶活性的测定。
本法可确认大豆的湿热处理程度。
A.2 定义
本标准所指尿素酶活性定义如下：
在(30±0.5)℃和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
A.3 原理
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。
用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。
A.4 仪器设备
A.4.1 样品筛：孔径200mm;
A.4.2 酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置;
A.4.3 恒温水浴：可控温(30±0.5)℃;
A.4.4 试管：直径18mm，长150mm，有磨口塞子;
A.4.5 精密计时器;
A.4.6 粉碎机：粉碎时应不生强热(例如球磨机)
A.4.7 分析天平：感量0.0001g;
A.4.8 移液管：10mL。
A.5 试剂和溶液
A.5.1 尿素：分析纯;
A.5.2 磷酸氢二钠：分析纯;
A.5.3 磷酸二氢钾：分析纯;
A.5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0)：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将30g尿素溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。
A.5.5 盐酸：分析纯，c(HCL)=0.1mol/L溶液;
A.5.6 氢氧化钠：分析纯，c(NaOH)=0.1mol/L标准溶液。
A.6 试样的制备
用粉碎机将10g试样粉碎，使之全部通过样品筛。
对特殊试样(水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品)应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。
A.7 测定步骤
称取约0.2g已粉碎的试样，称准至0.1mg，转入试管中(如活性很高只称0.05g试样),移
入10mL尿素缓冲溶液，立即盖好试管并剧烈摇动，马上置于(30±0.5)℃恒温水浴中，准确计时保持30min。
即刻移入10mL盐酸溶液，迅速冷却到20℃。
将试管内容物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次，立即用氢氧化钠标准溶液滴定至pH4.70。
另取试管作空白试验，移入10mL尿素缓冲液，10mL盐酸溶液。
称取与上述试样量相当的试样，也称准至0.1mg，迅速加入此试管中。
立即盖好试管并剧烈摇动。
将试管置于(30±0.5)℃的恒温水浴，同样准确保持30min，冷却至20℃，将试管内容物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次，并用氢氧化钠标准溶液滴定至pH4.70。
A.8 测定结果的计算
A.8.1 计算方法
以每分钟每克大豆制品释放氮的毫克量表示的尿素酶活性U，按下式计算：
14×c(V0-V)
30×m
U=
式中：c ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L;
V0 ——空白试验消耗氢氧化钠溶液体积，mL;
V ——测定试样消耗氢氧化钠溶液体积，mL;
m ——试样质量，g。
注：若试样经粉碎前的预干燥处理时，则
14×c(V0-V)
30×m
U= ×(1-S)
式中：S——预干燥时试样失重的百分率。
A.8.2 重复性
同一分析人员用相同方法，同时或连续两次测定结果之差不超过平均值的10%，以其算术平均值报告结果。
附录 B 大豆制品中尿素酶活性快速检验
将1份尿素、5份水，10份豆粉或豆粕置于小塑料袋中，封口30秒，如豆粕中有尿酶存在，它会将尿素转化为氨，打开袋口可闻到氨气，正常豆粕无气味。
附录 C 大豆制品中尿素酶活性酚红法检测
取约0.02g粉碎好的试样,放入试管中,加5mL水、0.02g尿素和2滴0.1%的酚红乙醇(20%)溶液,振摇10秒。
观察溶，液颜色并记录时间。
1min内变粉红色，酶活很强;1～5min 变色，活性强;5～15min，略有活性;15～30min，无活性;10min不变色者，合格。
