CA-MA基因的克隆及其突变体的构建1
冯惟萍，韩跃武
兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所，兰州（730000）
E-mail: fengwp05@https://www.doczj.com/doc/0f7734485.html,
摘要：目的 构建 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体，用反向 PCR 定点突变法构建其突变体。方法 构建 CA-MA 杂合肽重组克隆载体，采用 PCR 体外定点突变技术,设计一对方向相反的引物,其中一个引物引入突变点，应用高保真的 Polybest DNA 多聚酶进行重组克隆质粒 pUC-18–CA-MA 的 PCR 扩增,使 CA-MA 杂合肽第 16 位密码子由 AGT 变为 TGG ,将扩增片段自身连接，构建 CA-MA 杂合肽突变重组克隆质粒。结果 DNA 测序结果表明在预期位点发生突变。结论 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体及其突变体成功构建。
关键词：CA-MA；杂合肽；聚合酶链反应；定点突变
中图分类号：Q786
0. 引言
天蚕素 A (1～8) - 蛙皮素(1～12) 杂合基因抗菌肽为天然抗菌肽 Cecropin A 第1～8 位氨基酸与蛙皮素第1～12 位氨基酸融合的抗菌肽片段,它既保持了天蚕素 A 的广谱抗菌活性，而且获得了蛙皮素的抗微生物活性[1]。CA-MA 杂合肽与其亲代肽比较,抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。国外有学者以 CA-MA 杂合肽作为模版肽设计了几种类似物，发现在抗菌、抗病毒方面，其类似物的活性均明显高于 CA-MA 杂合肽[2]。目前的研究均是用人工合成肽的方法来改造抗菌肽的结构以达到增强抗微生物的作用,但人工合成的方法成本过高。本文通过 PCR 体外定点突变技术，寻找合适的突变位点，成功构建突变体。
1. 材料与方法
1.1 材料
1. 1. 1 目的基因、质粒与菌株
CA-MA杂合肽基因片段由上海生物工程公司合成。克隆载体pUC-18、工程菌 E.coli DH5α均由本室保存。
1. 1. 2 主要生化试剂
限制性内切酶及其配套缓冲液、TaKaRa MutantBEST Kit 、质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司。DNA Marker 购自上海生工生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的复性、酶切及回收纯化：参照文献[3] 进行。
1.2.2. 克隆载体pUC-18双酶切、去磷酸化及琼脂糖凝胶电泳胶回收：参照文献[3] 进行。
1.2.3克隆重组体的构建：
（1）、 CA-MA杂合肽基因与克隆载体pUC-18的连接：参照文献[4] 进行。
1本课题得到国家“863”计划项目(2006AA10A208-1-4 ) 资助。
（2）、感受态大肠杆菌DH5α细胞的制备、连接产物的转化及Amp和α互补筛选：参照文献[3]进行。
1.2.4 克隆重组体的鉴定：阳性重组体送上海生工测序鉴定。
1.2.5 定点突变
（1）、PCR 引物设计 按照突变引物设计原理,根据 CA-MA 杂合肽基因序列设计一对方向相反的引物 Primer 1 和Primer 2 , ,并利用 Primer Premier 5 引物设计软件对引物进行分析,确保引物内无发夹结构,引物间无二聚体形成,引物与模板其它部位无特异性结合。然后送交上海生工生物工程公司合成。 Primer 1 引入突变位点,即 CA-MA 第 16 位氨基酸密码由AGT 突变为 TGG 。
（2）、PCR 扩增 按照 PCR 体外定点突变法[5,6],用携带突变碱基的引物 Primer 1 和Primer 2 以 CA-MA 杂合肽重组克隆载体为模板进行扩增,反应成分为: Polybest DNA polymerase (5U/μL)，0.25 μL；10×Polybest buffer Ⅱ ,5 μL ；dNTP Mixture(各2.5mM) , 4 μL ; Primer 1 (20μM) 和Primer 2 (20μM) 各 1 μL ；pUC-18-CA-MA（1ng/μL）, 1μL; 加 ddH2O 至 50μL 。扩增条件为: 94 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec ，72 ℃ 5 min ，共进行 30 次循环,末次循环后置 72 ℃延伸 10 min。取 PCR 产物 100 μL ,做 1 % 琼脂糖凝胶电泳后,切取 3 kb 左右片段进行胶回收。
（3）、Blunting Kination 反应 DNA 片段 5 μL , 10× Blunting Kination buffer 2μL, Blunting Kination Enzyme Mix 1μL , 加 ddH2O 至 20μL ,37 ℃ 10min。将反应液用酚-氯仿抽提后乙醇沉淀。再用高效连接试剂Ligation Solution I 进行自身连接(环化反应)。
1.2.6 突变重组体的构建及鉴定
将自身连接后的突变重组质粒 pUC-18- W16-CA-MA 转化入E.coli DH5α感受态细胞中（方法同前）。阳性重组体送上海生工测序鉴定。
2. 结果
2.1 连接反应物的转化结果
蓝色菌落为不含重组质粒的阴性菌落，白色菌落为含重组质粒的阳性菌落。
图 1 pUC-18-CA-MA 重组体转化 E.coli DH5α
2. 2 PCR 扩增、质粒克隆
2. 2. 1 pUC-18-CA-MA 突变 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
将 1.2.5 中 PCR 扩增产物行 1% 琼脂糖凝胶电泳, 扩增产物在 3000 bp 附近出现单一条带, 符合预期目的基因片段大小(图 2)。
图 2 突变 PCR 产物电泳
M: 15 000 bp DNA Marker
1～2：pUC-18- W16-CA-MA PCR
2. 2. 2 突变质粒克隆
自身连接转化后的质粒经抗氨苄青霉素筛选，获得阳性菌落，抽提突变质粒,做质粒酶切及 PCR 鉴定。将 1.2.6 中抽提的突变体质粒及双酶切后的突变体质粒行 1% 琼脂糖凝胶电泳。突变体质粒出现三条带，为超螺旋、线状、以及半开环三种不同状态，双酶切后的突变体质粒在 3000 bp 附近出现单一条带, 二者均符合预期目的基因片段大小（图3）。
图 3 突变质粒抽提及酶切电泳
M: 15 000 bp DNA Marker
1～2：pUC-18- W16-CA-MA
3：pUC-18- W16-CA-MA / EcoR Ⅰ＋ Sal Ⅰ
2. 2. 3 突变重组质粒的测序鉴定
测序结果证实, 重组质粒 pUC- W16-CA-MA 第 16 位氨基酸的碱基序列为 TGG ,其余碱基序列全部一致, 在预定点发生突变，达到预期构建目的（图4）
图 4 重组质粒测序图
3. 讨论
重组基因抗菌肽与人工设计合成的抗菌肽在保持高效抗微生物活性的前提下，具有热稳定性、没有抗原性、没有溶血作用等优点，具有较好的开发应用前景[7]。天蚕素A-蛙皮素杂合基因抗菌肽〔CA (1～8) - MA (1～12) 〕由天蚕素 A 和蛙皮素的 N 端区域组成,与它们的亲代肽比较,其抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。 Lee DG 等发现 CA-MA 杂合肽第 16 位的丝氨酸对抗微生物活性具有重要作用，其疏水性对于 CA-MA 杂合肽抗微生物活性有重要影响[2]。本实验运用不同的生物学软件对 CA-MA 杂合肽基因进行分析，模拟 CA-MA 杂合肽结构，寻找合适的突变位点[8]，用色氨酸取代 16 位的丝氨酸，以增强其抗微生物活性。
定点突变有寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变和以 PCR 为基础的定点突变等方法[9]。近几年来,以 PCR 为基础的定点突变得到不断的创新和改进。PCR 体外定点突变技术
是研究 DNA 结构和功能关系的重要途径，可在 DNA 片段的任何位置定点突变[6]。通过定点突变 DNA 片段可以达到改造蛋白结构和功能的目的;与人工合成肽的方法相比,成本较低,同时还可为用生物法大规模制备蛋白提供一定的技术支持[10]。本研究采用 PCR 体外定点突变技术[11]，成功地对其进行定点突变。实验表明，该方法且快速、简便、准确、突变率高，是一种较为实用的定点突变方法。
本实验成功构建了CA-MA 杂合肽的克隆载体及其突变体W16-CA-MA ，初步研究了运用基因工程技术生产天蚕素A-蛙皮素杂合基因抗菌肽的可能性和可行性，希望能开辟一条生产新型抗菌药物的路子。
参考文献
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Cloning and Mutation of CA-MA Hybrid Peptide
Feng Weiping，Han Yuewu
Department of Biochemistry and Molecular Biology , School of Basic Medicine ,Lanzhou
University，Lanzhou （730000）
Abstract
AIM: Construct recombinant pUC-18-CA-MA,make full use of the technology of PCR to make a mutation. METHODS : A one step polymerase chain reaction (PCR) was used for the point directed mutation. The primers (P1, P2) were designed according to the sequence encoding CA-MA Hybrid Peptide, and mismatch was introduced into P1 with TGG for AGT substitution at position 16. PCR product of W16-CA-MA gene was performed in a one step PCR, and inserted into pUC-18 vector. RESULTS : DNA sequencing results show that the expected site mutations. CONCLUSION: The recombinant pUC-18-CA-MA and it\'s mutant were constructed successfully.
Keywords：cecropin A (1–8)-magainin (1–12) (termed CA-MA) hybrid peptide; polymerase chain reaction ( PCR ); rite-directed mutagenesi
植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签：植物；基因克隆技术；研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。
拷贝数变异及其研究进展 摘要：拷贝数变异(Copy number variations, CNVs)主要指1kb-1Mb的DNA片段的缺失、插入、重复等。文章主要介绍了CNVs的基本知识及其机理，着重介绍了其各种检测技术，并进一步阐明CNVs对人类疾病及哺乳动物疾病的影响。此外，对其研究发展进行可行性展望。 关键词：拷贝数变异机理检测技术疾病 2004年，两个独立实验小组几乎同时报道，在人类基因组中广泛存在DNA片段大小从 1 kb到几个Mb范围内的拷贝数变异(CNVs)现象。在2006 年的《Nature》杂志上,来自英国Wellcome Sanger研究所以及美国Affymetrk公司等多国研究人员组成的研究小组公布了第1张人类基因组的第1代CNV图谱，后续又有3篇文章陆续发表在《Nature Genetics》和《Genome Research》杂志上，聚焦这一重大发现。受到检测手段的限制，这类遗传变异直到最近2年才为研究者所重视，并迅速成为当前人类遗传学研究的热点。CNVs 最初在患者的基因组中发现，但后来发现CNVs也大量存在于正常个体的基因组内，主要引起基因(或部分基因)的缺失或增多。拷贝数的变异过程既与疾病相关，也与基因组自身的进化有关。 针对CNVs的发现，美国遗传学家JamesR.Lupski提出“我们不能再将人与人之间的差异想当然地认为仅是单碱基突变的结果，因为还存在更复杂的来自于CNVs的结构性差异”。Lupski认为，CNVs的发现将改变人类对遗传学领域的认知，并将影响19世纪被誉为“遗传学之父”的孟德尔及 1953年发现“DNA双螺旋”的弗兰西斯?克里克与吉姆?沃特森所确立的人类遗传学基准 1 CNV概述 1.1 CNV的概念 基因组变异包括多种形式，包括SNPs，数目可变串联重复位点VNTRs (微卫星等），转座元件 (Alu序列等），结构变异（重复、缺失、插入等）。CNVs指大小从1kb到1Mb 范围内亚微观片段拷贝数突变，这些拷贝片段的缺失、复制、倒置等的变异都统称为CNVs,但不包括由转座子的插人和缺失引起的基因变异（如0-6kb Kpn I重复）[1]。由于多态是用于描述在一定人群中某个等位基因的频率不低于1%，但到目前为止，多数人类的CNVs 频率还未知[2]。目前发现的CNVs 都收录在人类基因组变异数据库中，CNVs平均大小为118 kb。全世界范围内的CNVs研究目标是：建立人类基因组的CNVs地图集，以及建立CNVs与表型、CNVs与SNPs等方面的关系。 1.2 CNV产生机理 美国学者Redon等认为，CNV可以被认为是简单的DNA结构变化（如单一片段的扩增、缺失、插入），或者可能是复杂的染色体扩增、缺失和插入的各种组合形式。在人类基因组的研究中发现，CNV在基因组中的分布似乎是有一定规律的，它常发生在同源重复序列或DNA重复片段之内或之间的区域，且CNV和基因组的DNA重复序列（SD)呈极显著正相关。由此，学者们认为,CNV的发生或者说绝大多数CNV的发生是非等位基因同源重组（NAHR)的结果[3]。
课时默写18 《基因突变和基因重组》 一、生物变异的类型 1.不遗传的变异：仅由影响造成，没有引起遗传物质的变化。 2.可遗传的变异：由细胞内的改变引起，包括、 和。 二、基因突变 1.基因突变的实例——镰刀型细胞贫血症 （1）直接原因：多肽链上发生了的替换。 （2）根本原因：基因中碱基对发生了。 2.基因突变要点归纳 （1）概念：DNA分子中发生的、和，而引起的基因结构的改变，叫做基因突变。 （2）时间：有丝分裂和减数第一次分裂前的，即DNA分子时。 （3）原因：①诱发突变:因素、因素和因素 ②自发产生：由于偶尔发生差错、DNA的发生改变等原因。 （4）结果：可产生新的。 （5）特点：a、在生物界中是存在的，即性；b、发生的；c、的； d、自然状态下，突变频率，即性； e、大多对生物体是的，即性。 注：体细胞的突变不能直接传给后代，生殖细胞的则可能 （6）意义：产生的途径；是生物变异的；是生物进化的。 三、基因重组
1.概念：是指在生物体进行的过程中，控制的基因的重新组合。 2.类型： （1）自由组合型：减数分裂（减Ⅰ后期）形成配子时，随着的自由组合，位于这些染色体上的也自由组合。组合的结果可能产生与亲代基因型不同的个体。 （2）交叉互换型：减数分裂形成时期，同源染色体上染色单体之间等位基因的。结果是导致染色单体上基因的重组，组合的结果可能产生与亲代基因型不同的个体。 （3）人工重组型：技术，即基因工程。 3.结果：产生新的 4.意义：使后代产生多种新的基因型，从而出现新的性状组合，也是生物的来源之一，对生物的也具有重要的意义。 课时默写19 《染色体变异》 一、染色体结构的变异 1.实例：猫叫综合征（5号染色体部分） ） 2.类型：、、、（看书并理解 ．．．．． 3.结果：染色体结构的改变，会使排列在染色体上的基因的或改变，而导致性状的变异。 二、染色体数目的变异 1.类型 （1）个别增加或减少：如21三体综合征（多1条21号染色体） （2）以的形式成倍增加或减少：如三倍体无子西瓜 2.染色体组 （1）概念：细胞中的一组，在和上各不相同，但又互相
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
中日韩人种基因拷贝数变异图谱出炉 韩国首尔大学基因医学研究所徐廷瑄教授领导的研究小组宣称，他们通过对30名中国人、韩国人和日本人的基因组研究，成功绘制出中日韩人种超高清基因拷贝数变异图谱，并根据该图谱发现，亚洲人独有的基因拷贝数变异共有3500多个。 所谓基因拷贝数变异(Copy Number Vriations)是指在人类基因组中广泛存在的，从1000bp(碱基对)到数百万bp范围内的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异。研究表明，不少人类复杂性状疾病都和拷贝数变异有密切关系。 2019年，第一张人类基因组第一代基因拷贝数变异图谱问世。这张遗传图谱是通过对欧洲、非洲和亚洲祖先4个人群的270个个体样品进行分析，用两个互补的技术——单核苷酸多态性(SNPs)基因分型和以克隆为基础的比较基因组杂交进行基因拷贝数变异筛选，获得了一共1447个拷贝数变异。 之后的一系列研究显示，基因拷贝数变异是个体之间在基因组序列差异上的一个重要源泉，是研究基因组进化和表型差异的一个重要因素。许多关于基因拷贝数变异的研究结果表明，拷贝数变异可导致不同程度的基因表达差异，对正常表型的构成及疾病的发生发展具有一定作用。拷贝数变异研究在法医学方面也具有重要意义，在探索法医学个体识别的遗
传变异时不能忽略拷贝数变异这一基因组多样性的新形式。首尔大学医学院此次绘制的基因拷贝数变异图谱与西方绘制的现有图谱不同，是只针对中日韩人种进行研究并绘制完成的，将有效适用于特定人群的疾病诊疗，并为今后正式研究基因拷贝数变异和疾病之间的关联性提供了良好平台。(薛严) 当第一张人类基因组草图问世时，我们对这一划时代的成就充满期待，渴望它在医学诊断、预防和治疗方面，能够迅速兑现基因组研究的初衷。10年过去了，我们发现那不过是生命科学这部天书的扉页。基因组测序现已不算难事，科学家面临的更大挑战，是从浩繁的基因组序列中找到惠及健康的有用信息。或许，研究基因拷贝数变异，我们才翻到了这部天书的某一章节。
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
HEREDITAS (Beijing) 2011年8月, 33(8): 857―869 ISSN 0253-9772 https://www.doczj.com/doc/0f7734485.html, 综 述 收稿日期: 2011?04?07; 修回日期: 2011?06?03 基金项目:国家自然科学基金项目(编号: 30890034, 31000552), 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(编号: NCET-09-0322)和上海市浦江人才 计划项目(编号: 10PJ1400300)资助 作者简介:杜仁骞, 在读博士研究生, 研究方向: 基因组拷贝数变异。E-mail: renqian.du@https://www.doczj.com/doc/0f7734485.html, 通讯作者:张锋, 博士, 副教授, 博士生导师, 研究方向: 人类遗传学和医学遗传学。E-mail: feng.fudan@https://www.doczj.com/doc/0f7734485.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00857 基因组拷贝数变异及其突变机理与人类疾病 杜仁骞1,2, 金力1,2,3, 张锋1,2 1. 复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室, 上海200433; 2. 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室, 上海200433; 3. 复旦大学生物医学研究院, 上海200032 摘要: 拷贝数变异(Copy number variation, CNV)是由基因组发生重排而导致的, 一般指长度为1 kb 以上的基因 组大片段的拷贝数增加或者减少, 主要表现为亚显微水平的缺失和重复。CNV 是基因组结构变异(Structural variation, SV)的重要组成部分。CNV 位点的突变率远高于SNP(Single nucleotide polymorphism), 是人类疾病的重要致病因素之一。目前, 用来进行全基因组范围的CNV 研究的方法有: 基于芯片的比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)、SNP 分型芯片技术和新一代测序技术。CNV 的形成机制有多种, 并可分为DNA 重组和DNA 错误复制两大类。CNV 可以导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见疾病, 同时与复杂疾病也相关。其致病的可能机制有基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。对CNV 的深入研究, 可以使我们对人类基因组的构成、个体间的遗传差异、以及遗传致病因素有新的认识。 关键词: 拷贝数变异; 突变机理; 疾病; 人类基因组 Copy number variations in the human genome: their mutational mechanisms and roles in diseases DU Ren-Qian 1,2, JIN Li 1,2,3, ZHANG Feng 1,2 1. MOE Key Laboratory of Contemporary Anthropology , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433, China ; 2. State Key Laboratory of Genetic Engineering , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433, China ; 3. Institutes of Biomedical Sciences , Fudan University , Shanghai 200032, China Abstract: Copy number variation (CNV) is the main type of structure variation (SV) caused by genomic rearrangement, which mainly includes deletion and duplication of sub-microscopic but large (>1 kb) genomic segments. CNV has been recognized as one of the main genetic factors underlying human diseases. The mutation rate (per locus) of CNV is much higher than that of single nucleotide polymorphism (SNP). The genome-wide assays for CNV study include array-based comparative genomic hybridization (aCGH), SNP genotyping microarrays, and next-generation sequencing techniques. Various molecular mechanisms are involved in CNV formation, which can be divided into two main categories, DNA re-combination-based and DNA replication-based mechanisms. CNVs can be associated with Mendelian diseases, sporadic diseases, and susceptibility to complex diseases. CNVs can convey clinical phenotypes by gene dosage, gene disruption, gene fusion, and position effects. Further studies on CNVs will shed new light on human genome structure, genetic varia-tions between individuals, and missing heritability of human diseases. Keywords: copy number variation; mutational mechanism; diseases; human genome
基因突变与染色体变异 1、为什么在纯系中进行选择是毫无意义的？ A 所有的个体均具有同一表现型 B 所有的个体均具有同一基因型 C 各个个体具有不同的表现型 D 各个个体具有不同的基因型 （见问第四个孩子患这种病的机率是多少、这一家族中有一成员患一种常染色体的隐性疾病。2 右图，阴影代表换病的）？％100 D C 50％A 0％ B 25％流感病毒毒株甲型ＨＮ12月７日在美国《传染病杂志》网络版上发表报告称，3、美国和加拿大研究人员2010年11对目前普遍使用的金刚烷和神经氨酸酶抑制剂两大类抗流感药物产生了一定的抗药性。下列相关说法错误的）是 （．使用金刚烷和神经氨酸酶抑制剂的剂量越大，病菌向抗药能力增强方向的变异越快A．长期使用金刚烷和神经氨酸酶抑制剂是对病原体进行选择的过程，结果导致种群中抗药性基因频率增加B N流感病毒进入人体后，能够合成多种类型的蛋白质C．H11 HN流感病毒变异的主要来源是基因突变D．11则该生物自交后代中显性纯合体出现的概率为m，交换值为4、基因型为的生物，如果A-b ．DA ．B．．CF1完全显性。用隐性性状个体与显性纯合个体杂交得F1，、、C三个基因分别对a、bc、5、位于常染色体上的AB基因型的是F11：1，则下列正确表示：：：测交结果为aabbccAaBbCc；aaBbccAabbCc=1：1 （Ⅰ、和非同源区（Ⅱ）形态不完全相同，YX、6人的染色体和染色体大小、但存在着同源区Ⅲ）如右图所示。下列有关叙述中错误的是 1 A．Ⅰ片段上隐性基因控制的遗传病，男性患病率高于女性 B．Ⅱ片段上基因控制的遗传病，男性患病率等于女性．Ⅲ片段上基因控制的遗传病，患病者全为男性C
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
染色体结构变异与基因突变的区别 染色体结构变异是指染色体上基因数目或者顺序的改变；基因突变是指基因结构的改变，包括碱基的替换、增添、缺失。 .易位和交叉互换的区别 易位发生在非同源染色体之间，是指一条染色体的某一片段移接到另外一条非同源染色体上。交叉互换发生在同源染色体的非姐妹染色单体之间。 细胞分裂图的染色体组数判断 (1)①为减数第一次分裂的前期，有 4 条染色体，生殖细胞中有 2 条染色体，每个染色体组有 2 条染色体，该细胞中有 2 个染色体组。 (2)②为减数第一次分裂的末期，有 2 条染色体，生殖细胞中有 2 条染色体，每个染色体组有 2 条染色体，该细胞中有 1 个染色体组。 (3)③为减数第一次分裂的后期，有 4 条染色体，生殖细胞中有 2 条染色体，每个染色体组有 2 条染色体，该细胞中有 2 个染色体组。 (4)④为有丝分裂后期，染色体 8 条，每个染色体组 2 条染色体，该细胞中有 4 个染色体组。 【说明】着丝点分裂导致染色体、染色体组数目加倍。 无子西瓜和无子番茄的原理不同： 无子番茄是用一定浓度人工合成的生长素来处理没有授粉的花蕾； 无子西瓜是由于三倍体植株在减数分裂中同源染色体联会紊乱， 因而不能形成正常的生殖细胞。
单倍体育种与多倍体育种比较 二倍体、多倍体、单倍体的比较
比较三种可遗传变异
【易错易混】 ①同源染色体上非姐妹染色单体间的交叉互换，属于基因重组；非同源染色体之间的交叉互换，属于染色体结构变异中的易位。 ②基因突变、基因重组属于分子水平的变化；染色体变异属于亚细胞水平的变化。 ③DNA 分子上若干基因的缺失属于染色体变异；DNA 分子上若干碱基对的缺失，属于基因突变。 不同生物可遗传变异的来源 ①病毒可遗传变异的来源——基因突变 ②原核生物可遗传变异的来源——基因突变 ③真核生物可遗传变异的来源： 无性生殖——基因突变和染色体变异 有性生殖——基因突变、基因重组和染色体变异
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
在人类细胞遗传学研究的早期，人们在显微镜下研究染色体，发现了染色体的拷贝数、重排和结构方面存在变异，而且在很多情况下这些变异可能与疾病相关。在分辨率频谱的另一端即高分辨率区域，DNA短片段的分析和测序方法的发展导致了短串联重复序列和单核苷酸多态性（SNPs）的发现。显而易见，人为遗传变异范围包括从序列水平上单一碱基对的变化到用显微镜检测到的几兆碱基长度的染色体差异。最近，通过观测亚微观DNA片段中广泛颁布的拷贝数变异，我们对于人类遗传变异的认识又进一步得到了拓展。全基因组扫描方法的实行大大推动了这种关于人为变异的新认识，这些方法给我们提供了一个在显微镜细胞遗传学（>5-10Mb）和DNA序列分析（1-700bp）之间的对基因组中间范围遗传变异进行解读的强有力工具。正如图6所示的结构变民中的中等分辨率范围内的测亚微观部分。 现在已经发展了很多方法来检测这类中等大小范围内的DNA遗传变异，DNA生物芯片技术可能是其中最为有效的方法。拷贝数变异（CNV）鉴定的主要方法是比较基因组杂交（CGH），而商业的标准CGH芯片在人类基因组的每1Mb长度范围有一个细菌人工染色体（BAC）克隆，这样就很难精确鉴定小于50kb的单拷贝数差异。昂飞的人类基因组图谱SNP芯片500K和SNP 5.0芯片的标记间距离中位数为2.5kb，最近推出的SNP 6.0的中位数则少于700个碱基对。这类基因型芯片通过将测试样本所获取的信息强度与其他个体的进行比较来确定每个位点相对基因组拷贝数。同时，拷贝数检测运算法中将探针的长度和GC含量考虑到其中，从而进一步降低了基因型芯片检测噪音。另外一个优点是，基因型芯片对拷贝数变异区域进行全面检测，并通过在连续的几个探针中要有重大的比率变化来确认。所以说，这样的工具明显提高了检测的精确度。除了提供拷贝数信息，SNP 基因型芯片提供的基因型信息不但可以用于遗传关联性研究，还可以用于检测杂合性丢失，这为缺失的存在提供支持证据，还可能提示片段性单亲二体。 近年来通过拷贝数变异（CNVs）的研究，我们知道人类群体中的任何两个个体基因组结构上的差异比核苷酸序列水平上的差异更大（请参阅应用案例2）。保守的估计显示个体之间CNVs总计有4Mb（相当于每800bp 就有1个不同）。不保守估计则认为有多达5-24Mb范围内存在CNVs。无论是哪种估计，平均来说CNVs中的核苷酸变异数量比SNPs还要多，后者总数大约是2.5Mb（相当于每1，200个bp中有1个SNP）。因此人类个休之间的所有基因组差异性要远远大于先前所认为的，至少存在0.2%的差异：结构水平上有0.12%以上的差异，核苷酸水平上有0.08%的差异。 昂飞芯片技术革新不但为之前未被发现的人类健康人群中存在的基因组变异的基础研究敞开了大门,也为研究疾病的遗传基础打开了一扇新的窗户.致癌基因的扩增和/或肿 瘤抑制基因的缺失是癌症起始和发展的特点，这一特点近来被认为可用来暗示癌症对治疗剂的反应。因此在细胞系和肿瘤样品中对这些 2008年7月23日第三十三期第 8 页，共 14 页下一页 返 回
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
高考生物知识点:基因突变和染色体变异区别 学习生物，不仅要有明确的学习目的，还要有勤奋的学习态度，科学的学习方法。针对高考生物知识点的特点，要努力学好高中生物课。 从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。染色体变异是染色体的结构或数目发生变化;基因突变在显微镜下不能看到而染色体变异则可以看到 基因型为aa的个体发生显性突变时是变成了AA还是Aa?还是两种都有可能? 一般只考虑一次突变：基因型为aa的个体发生显性突变时是变成Aa基因型为AA的个体发生隐性突变后变为Aa，性状不改变 突变和基因重组发生在体细胞中呢?还叫可遗传变异吗? 还叫可遗传变异，因为可遗传变异，只表示它可以遗传，不表明它一定能遗传。如果突变发生于体细胞，可通过无性生殖遗传。 非同源染色体片段的交换属于基因重组吗? 非同源染色体片段的交换是染色体变异，同源染色体片段的交换才属于基因重组 如何根据图像准确判断细胞染色体组数? 有几条一样的染色体，就有几个染色体组。 基因型为AAaaBBBB的细胞含几个染色体组。麻烦说具体点，最好有图示。
该基因型是四个染色体组。染色体组，是指一组非同源染色体，即他们的形态功能各不相同。碰到这类题只要数一下同类等位基因重复几个就行了。如AAaa有四个或者BBBB有四个，就是四个染色体组。 “单倍体一定高度不育”为什么错? 例如：用秋水仙素处理二倍体西瓜的幼苗，能得到同源四倍体，若将该四倍体的花药进行离体培养能得到含有偶数个相同的染色体组数的单倍体，它可育。八倍体小黑麦是异源多倍体，它的花药进行离体培养能得到含有偶数个相同的染色体组数的单倍体，但它不可育。所以单倍体不一定高度不育 单倍体什么性状能看出来? 有的性状单倍体能看出来,如植物的颜色,抗病性等 秋水仙素是抑制纺锤丝合成还是让已形成的纺锤丝解体?那么细胞会停止分裂吗?染色体如不分离，染色体如何加倍? 秋水仙素既能抑制纺锤丝合成(前期)还能让已形成的纺锤丝断裂，秋水仙素阻止了细胞的分裂。着丝点的分裂与“纺锤丝”无关系，它相当于基因程序性表达。当含有“染色单体”的染色体发育到一定时候，着丝点即断裂，染色体数加倍。 所有的基因重组都发生在减数分裂中---对吗?错的解释一下好吗? 错：基因重组有广义，狭义的说法，狭义的基因重组发生在减数分裂中，广义的基因重组包括减数分裂，受精作用，基因工程。 袁隆平院士的超级杂交水稻和鲍文奎教授的适于高寒地区种植的小黑麦为什么前者依据基因重组，后者依据染色体变异?请老师详细告诉我原因。