CA-MA基因的克隆及其突变体的构建1冯惟萍，韩跃武兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所，兰州（730000）E-mail: fengwp05@摘要：目的 构建 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体，用反向 PCR 定点突变法构建其突变体。
方法 构建 CA-MA 杂合肽重组克隆载体，采用 PCR 体外定点突变技术,设计一对方向相反的引物,其中一个引物引入突变点，应用高保真的 Polybest DNA 多聚酶进行重组克隆质粒 pUC-18–CA-MA 的 PCR 扩增,使 CA-MA 杂合肽第 16 位密码子由 AGT 变为 TGG ,将扩增片段自身连接，构建 CA-MA 杂合肽突变重组克隆质粒。
结果 DNA 测序结果表明在预期位点发生突变。
结论 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体及其突变体成功构建。
关键词：CA-MA；杂合肽；聚合酶链反应；定点突变中图分类号：Q7860. 引言天蚕素 A (1～8) - 蛙皮素(1～12) 杂合基因抗菌肽为天然抗菌肽 Cecropin A 第1～8 位氨基酸与蛙皮素第1～12 位氨基酸融合的抗菌肽片段,它既保持了天蚕素 A 的广谱抗菌活性，而且获得了蛙皮素的抗微生物活性[1]。
CA-MA 杂合肽与其亲代肽比较,抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。
国外有学者以 CA-MA 杂合肽作为模版肽设计了几种类似物，发现在抗菌、抗病毒方面，其类似物的活性均明显高于 CA-MA 杂合肽[2]。
目前的研究均是用人工合成肽的方法来改造抗菌肽的结构以达到增强抗微生物的作用,但人工合成的方法成本过高。
本文通过 PCR 体外定点突变技术，寻找合适的突变位点，成功构建突变体。
1. 材料与方法1.1 材料1. 1. 1 目的基因、质粒与菌株CA-MA杂合肽基因片段由上海生物工程公司合成。
克隆载体pUC-18、工程菌 E.coli DH5α均由本室保存。
1. 1. 2 主要生化试剂限制性内切酶及其配套缓冲液、TaKaRa MutantBEST Kit 、质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司。
DNA Marker 购自上海生工生物工程公司。
1.2 方法1.2.1 目的基因片段的复性、酶切及回收纯化：参照文献[3] 进行。
1.2.2. 克隆载体pUC-18双酶切、去磷酸化及琼脂糖凝胶电泳胶回收：参照文献[3] 进行。
1.2.3克隆重组体的构建：（1）、 CA-MA杂合肽基因与克隆载体pUC-18的连接：参照文献[4] 进行。
1本课题得到国家“863”计划项目(2006AA10A208-1-4 ) 资助。
（2）、感受态大肠杆菌DH5α细胞的制备、连接产物的转化及Amp和α互补筛选：参照文献[3]进行。
1.2.4 克隆重组体的鉴定：阳性重组体送上海生工测序鉴定。
1.2.5 定点突变（1）、PCR 引物设计 按照突变引物设计原理,根据 CA-MA 杂合肽基因序列设计一对方向相反的引物 Primer 1 和Primer 2 , ,并利用 Primer Premier 5 引物设计软件对引物进行分析,确保引物内无发夹结构,引物间无二聚体形成,引物与模板其它部位无特异性结合。
然后送交上海生工生物工程公司合成。
Primer 1 引入突变位点,即 CA-MA 第 16 位氨基酸密码由AGT 突变为 TGG 。
（2）、PCR 扩增 按照 PCR 体外定点突变法[5,6],用携带突变碱基的引物 Primer 1 和Primer 2 以 CA-MA 杂合肽重组克隆载体为模板进行扩增,反应成分为: Polybest DNA polymerase (5U/µL)，0.25 µL；10×Polybest buffer Ⅱ ,5 µL ；dNTP Mixture(各2.5mM) , 4 µL ; Primer 1 (20µM) 和Primer 2 (20µM) 各 1 µL ；pUC-18-CA-MA（1ng/µL）, 1µL; 加 ddH2O 至 50µL 。
扩增条件为: 94 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec ，72 ℃ 5 min ，共进行 30 次循环,末次循环后置 72 ℃延伸 10 min。
取 PCR 产物 100 µL ,做 1 % 琼脂糖凝胶电泳后,切取 3 kb 左右片段进行胶回收。
（3）、Blunting Kination 反应 DNA 片段 5 µL , 10× Blunting Kination buffer 2µL, Blunting Kination Enzyme Mix 1µL , 加 ddH2O 至 20µL ,37 ℃ 10min。
将反应液用酚-氯仿抽提后乙醇沉淀。
再用高效连接试剂Ligation Solution I 进行自身连接(环化反应)。
1.2.6 突变重组体的构建及鉴定将自身连接后的突变重组质粒 pUC-18- W16-CA-MA 转化入E.coli DH5α感受态细胞中（方法同前）。
阳性重组体送上海生工测序鉴定。
2. 结果2.1 连接反应物的转化结果蓝色菌落为不含重组质粒的阴性菌落，白色菌落为含重组质粒的阳性菌落。
图 1 pUC-18-CA-MA 重组体转化 E.coli DH5α2. 2 PCR 扩增、质粒克隆2. 2. 1 pUC-18-CA-MA 突变 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳将 1.2.5 中 PCR 扩增产物行 1% 琼脂糖凝胶电泳, 扩增产物在 3000 bp 附近出现单一条带, 符合预期目的基因片段大小(图 2)。
图 2 突变 PCR 产物电泳M: 15 000 bp DNA Marker1～2：pUC-18- W16-CA-MA PCR2. 2. 2 突变质粒克隆自身连接转化后的质粒经抗氨苄青霉素筛选，获得阳性菌落，抽提突变质粒,做质粒酶切及 PCR 鉴定。
将 1.2.6 中抽提的突变体质粒及双酶切后的突变体质粒行 1% 琼脂糖凝胶电泳。
突变体质粒出现三条带，为超螺旋、线状、以及半开环三种不同状态，双酶切后的突变体质粒在 3000 bp 附近出现单一条带, 二者均符合预期目的基因片段大小（图3）。
图 3 突变质粒抽提及酶切电泳M: 15 000 bp DNA Marker1～2：pUC-18- W16-CA-MA3：pUC-18- W16-CA-MA / EcoR Ⅰ＋ Sal Ⅰ2. 2. 3 突变重组质粒的测序鉴定测序结果证实, 重组质粒 pUC- W16-CA-MA 第 16 位氨基酸的碱基序列为 TGG ,其余碱基序列全部一致, 在预定点发生突变，达到预期构建目的（图4）图 4 重组质粒测序图3. 讨论重组基因抗菌肽与人工设计合成的抗菌肽在保持高效抗微生物活性的前提下，具有热稳定性、没有抗原性、没有溶血作用等优点，具有较好的开发应用前景[7]。
天蚕素A-蛙皮素杂合基因抗菌肽〔CA (1～8) - MA (1～12) 〕由天蚕素 A 和蛙皮素的 N 端区域组成,与它们的亲代肽比较,其抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。
Lee DG 等发现 CA-MA 杂合肽第 16 位的丝氨酸对抗微生物活性具有重要作用，其疏水性对于 CA-MA 杂合肽抗微生物活性有重要影响[2]。
本实验运用不同的生物学软件对 CA-MA 杂合肽基因进行分析，模拟 CA-MA 杂合肽结构，寻找合适的突变位点[8]，用色氨酸取代 16 位的丝氨酸，以增强其抗微生物活性。
定点突变有寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变和以 PCR 为基础的定点突变等方法[9]。
近几年来,以 PCR 为基础的定点突变得到不断的创新和改进。
PCR 体外定点突变技术是研究 DNA 结构和功能关系的重要途径，可在 DNA 片段的任何位置定点突变[6]。
通过定点突变 DNA 片段可以达到改造蛋白结构和功能的目的;与人工合成肽的方法相比,成本较低,同时还可为用生物法大规模制备蛋白提供一定的技术支持[10]。
本研究采用 PCR 体外定点突变技术[11]，成功地对其进行定点突变。
实验表明，该方法且快速、简便、准确、突变率高，是一种较为实用的定点突变方法。
本实验成功构建了CA-MA 杂合肽的克隆载体及其突变体W16-CA-MA ，初步研究了运用基因工程技术生产天蚕素A-蛙皮素杂合基因抗菌肽的可能性和可行性，希望能开辟一条生产新型抗菌药物的路子。
参考文献[1] Shin SY, Kang JH, Lee MK, et al. Cecropin A - magainin 2 hybrid peptides having potent antimicrobial activity with low hemolytic effect. Biochem Mol Biol Int. 1998 May;44(6):1119-26.[2] Lee DG, Park Y, Jin I. Structure-antiviral activity relationships of cecropin A-magainin 2 hybrid peptide and its analogues. J Pept Sci. 2004 May;10(5):298-303.[3] 萨姆布鲁克J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.[4] LU S D(卢圣栋) . Current Frotocols for Molecular Biology (现代分子生物学实验技术) ,Beijing :High Education Press ,1993[5] Andreas Urban ,Susanne Neukirchen ,Karl-Erich Jaeger. A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR [J] .Nucleic Acids Research ,1997 ,25 (11) :2227 - 2229. [6] Yang YX, Feng Y, Wang BY, et al. PCR-based site-specific mutagenesis of peptide antibiotics FALL-39 and its biologic activities. Acta Pharmacol Sin 2004 Feb; 25 (2): 239-245[7] 陈菲; 严明;韦萍. 从Granulysin 抗菌机理出发合理设计抗菌肽,生物加工过程,2005,3(1): 66-70[8] Shin SY, Kang JH, Jang SY Effects of the hinge region of cecropin A(1-8)-magainin 2(1-12), a synthetic antimicrobial peptide, on liposomes, bacterial and tumor cells. Biochim Biophys Acta. 2000 Feb15;1463(2):209-18[9] 罗师平,冷希冈. 基于PCR 的体外诱变技术[J] . 国外医学生物医学工程分册,2005 ,3 (28) :188 - 192.[10] 黃春晓, 段学军.以PCR为基础的定点诱变方法研究进展. 河南农业科学, 2006,12:5-8[11] 许小霞;徐兴耀;金丰良等. 家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建. 蚕业科学, 2004 ;30 (1) :90-93.Cloning and Mutation of CA-MA Hybrid PeptideFeng Weiping，Han YuewuDepartment of Biochemistry and Molecular Biology , School of Basic Medicine ,LanzhouUniversity，Lanzhou （730000）AbstractAIM: Construct recombinant pUC-18-CA-MA,make full use of the technology of PCR to make a mutation. METHODS : A one step polymerase chain reaction (PCR) was used for the point directed mutation. The primers (P1, P2) were designed according to the sequence encoding CA-MA Hybrid Peptide, and mismatch was introduced into P1 with TGG for AGT substitution at position 16. PCR product of W16-CA-MA gene was performed in a one step PCR, and inserted into pUC-18 vector. RESULTS : DNA sequencing results show that the expected site mutations. CONCLUSION: The recombinant pUC-18-CA-MA and it\'s mutant were constructed successfully.Keywords：cecropin A (1–8)-magainin (1–12) (termed CA-MA) hybrid peptide; polymerase chain reaction ( PCR ); rite-directed mutagenesi。
