拟南芥全长cDNA研究进展

^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春，杨莉琴，秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素，具有十分重要的生理功能。

DWF4是BRs生物合成的关键限速酶，显著影响BRs在植物体中的含量。

本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料，利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带，测序结果表明该条带为ADWF4基因；生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白，且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。

同时，研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。

本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。

关键词：拟南芥；BRs；DWF4基因；过表达载体构建DOI：10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract：BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which signifi­cantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the mate­rial to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple second­ary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overex­pression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant cal­lus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH：2016]7449号)；贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才：2018]5781号)作者简介：韦春(1995—),女(壮族)广西河池人；在读硕士，主要从事植物基因工程相关研究(E-mail：*****************).通讯作者：秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人；博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物生物技术与植物基因工程(E-nail：leequine_chin@126.com)。

拟南芥模式植物基因组研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种小型草本植物，非常适合作为模式植物进行基因组研究。

作为全基因组已经测序完整的植物之一，拟南芥的基因组研究已成为植物学领域的重要研究领域之一。

一、拟南芥基因组特点拟南芥基因组大小约为125兆碱基对（Mbp），其中包含5个染色体和25000多个基因。

其基因组相对简单，只有 ~ 15% 的DNA编码蛋白质，大部分是非编码RNA。

此外，拟南芥还具有双倍体基因组、小基因家族、低韧皮性及自交等特点，使得其成为一种研究基因功能的理想模型。

二、利用拟南芥进行功能基因组学研究拟南芥是一种经典的遗传模型植物，具有高度可控性和可重复性，其遗传和发育转录组学数据较为完整，使其在功能基因组学研究领域具有很多应用。

例如，拟南芥可以被用来探索基因网络、研究基因和环境交互作用、拓展代谢途径等。

利用拟南芥研究基因网络的目标是探索不同基因之间的相互作用，这是理解细胞内生物反应和物质代谢网络的重要步骤。

通过构建看似简单的基因互作网络，可以解释很多现象。

例如，对拟南芥维管束发育的研究表明，其拟南芥基因组中多个基因的突变都会影响维管束分化和发育，而这些基因在蛋白质互作网络中互相联系，共同作用于维管束的发育过程。

拟南芥基因组研究还可以帮助我们探索植物基因与环境相关的交互作用，从而了解许多植物性状如何受到环境因素的影响。

例如，拟南芥可以用于研究环境中物质的吸收和代谢，例如水分利用效率和盐耐受性，这些研究可以为生态学和农业生产提供重要的信息。

三、基于拟南芥的基因编辑技术基因编辑是指利用分子生物学手段，针对特定基因进行精确的改造和修复。

利用某些基因编辑工具，例如CRISPR/Cas9，可以方便性地实现特定基因的改造和编辑，从而实现拟南芥基因组工程。

这种技术可以用于研究基因的功能，也可以用于创造优良的耐逆转基因植物。

基因编辑的研究进展迅速，有助于生产显性抗性基因和克服抗性基因的缺陷，为发展更为耐逆的品种提供了帮助。

拟南芥的基因组和功能分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，因为它的基因组非常小，具有高度保守性和相对简单的生长环境。

这使得拟南芥成为研究植物基因组和生物学机制的理想模型。

拟南芥的基因组已被完整测序，它包含5条染色体和大约1.15亿个DNA碱基对。

与其他植物的基因组相比，拟南芥的基因组非常小，只有其他植物的1/10到1/25之间。

另外，拟南芥的基因组中的重复元件很少，这使得基因识别和注释变得更加容易。

拟南芥的基因组序列被广泛应用于各种基因研究，包括基因功能和表达分析、代谢组学、转录组学、蛋白质组学、细胞和发育生物学、信号转导和整个基因组水平的遗传和表观遗传研究。

通过对拟南芥基因组的分析，可以发现许多基因的拥有相似的序列、结构和功能，这使得预测其他植物的基因功能变得更容易。

另外，可以通过比较拟南芥与其他植物的基因组序列的异同，确定哪些基因是拟南芥特有的，哪些基因是其他植物所共有的。

拟南芥的基因组研究还有助于研究植物发育和适应的机制。

通过研究拟南芥基因组中与植物生长发育相关的基因，可以揭示植物发育的激素调节、蛋白质相互作用和转录因子网络等重要机制。

这些研究为植物育种、生产和药物开发提供了基础。

除了对基因组的研究，拟南芥的功能分析也被广泛应用于基因功能研究。

对拟南芥进行基因功能研究的方法包括T-DNA插入、CRISPR/Cas9基因编辑等。

这些方法允许破坏植物中的特定基因，以确定该基因在植物发育、代谢和适应等方面的重要性。

通过这些方法，已经确定了许多重要基因的作用，如卷心菜素合成途径中的几个关键酶、植物生长素受体、植物抗病性基因等。

这些研究为植物育种、生产和生物技术的开发提供了基础。

拟南芥的基因组和功能分析为植物研究提供了宝贵的工具和资源，也为植物学家和生物技术研究者提供了更深入的理解植物生物学和基因功能的契机。

拟南芥基因编辑技术的研究与应用随着生物技术的迅猛发展，基因编辑技术成为人们研究和利用生物资源的重要手段之一。

而拟南芥作为植物研究的重要模式生物，其基因编辑技术受到了越来越多的关注和应用。

在本文中，我们将探讨拟南芥基因编辑技术的研究和应用现状，以及未来的发展方向。

一、拟南芥基因编辑技术的研究现状拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种小型的十字花科植物，体型小、世代周期短、遗传透明度高，被广泛应用于植物基因组学和生物学研究领域。

拟南芥基因组已经被测序完毕，具有良好的分子遗传学和细胞遗传学特性，成为了研究植物基因表达与调控、信号转导和代谢途径等方面的重要材料。

目前，拟南芥基因编辑技术主要包括CRISPR/Cas9和TALEN两种。

其中，CRISPR/Cas9是一种快速、高效、便捷的基因编辑工具，已经广泛应用于植物、动物和微生物等领域。

它基于靶向DNA序列的RNA导向共价结合蛋白和Cas9核酸酶的共同作用，实现了对基因组的精确编辑和修饰。

在拟南芥中，CRISPR/Cas9技术已经成功应用于基因敲除、点突变、DNA插入和基因组修改等方面。

TALEN是一种基于转录活性效应核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）的基因编辑技术，它基于在宿主细胞内靶向特定基因的核酸酶，利用其高度特异性的DNA结合能力进行基因编辑和整合。

在拟南芥中，TALEN技术已经被应用于基因敲除和点突变等方面。

二、拟南芥基因编辑技术的应用现状1. 功能基因研究基因编辑技术为拟南芥的功能基因研究提供了便捷的手段。

通过对拟南芥基因组编辑和修饰，可以揭示其基因调控网络和生物途径中的关键基因和信号分子，从而对植物生长发育、逆境响应、光合作用等方面的问题进行深入解析。

例如，通过CRISPR/Cas9技术对拟南芥的RR6基因进行敲除，研究人员揭示了该基因在茎长和生长方向调控中的功能。

一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。

在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。

RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。

本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。

四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。

五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。

突变基因的拟南芥实验研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，在生物学研究中发挥着重要的作用。

它的基因组序列已经被完整解读，并且其外观简单、生长周期短等特点，使得其成为基因功能研究的最佳实验材料。

突变基因是指由于DNA序列的变异，造成突变的基因。

拟南芥的突变基因贡献了大量关于植物发育与繁殖等方面的科学研究成果。

突变基因的发现突变基因的发现可以通过自然突变和诱导突变两种途径实现。

自然突变是指在自然条件下，由于DNA杂交、突变等自然因素，使得基因产生突变。

而诱导突变，则需要使用特殊的化学试剂或是电磁辐射等手段对DNA进行干预，从而获得突变基因。

诱导突变的方法目前，诱导突变的方法主要有以下几种：1. EMS法EMS是Ethyl methanesulfonate的缩写，是一种碱基化剂，能够导致DNA中的鸟嘌呤碱基突变。

通过对拟南芥幼苗进行EMS浸泡处理，可以获得大量的突变体。

2. Gamma射线法Gamma射线是一种高能辐射，能够直接影响DNA分子结构，从而导致基因突变。

使用Gamma射线进行诱导突变，可以获得不同类型的突变体，包括缺失、插入、点突变等。

3. T-DNA插入法T-DNA是一种细菌表现元（bacterial virulence factor），广泛存在于土壤中的根际细菌Agrobacterium tumefaciens中。

因为T-DNA能够与植物基因组发生同源重组，因此可以通过向植物中转化Agrobacterium，从而将T-DNA插入到植物基因组中，诱导基因突变。

突变基因的分析方法了解突变基因的表达情况，可以通过基因表达谱、荧光素酶检测、Northern blotting、Western blotting等多种方法实现。

其中基因表达谱是最常用的一种方法，能够快速、准确地检测基因的表达情况。

拟南芥突变基因的研究拟南芥作为模式植物，其突变基因的研究对于植物的发育和繁殖等方面具有重要的意义，以下是一些拟南芥突变基因的研究案例。

模式植物拟南芥遗传应用综述摘要：拟南芥作为一种比较经典的“模式植物”，在研究相关的其他生物的生命活动规律中，因其结构简单，相似性高，而表现出其他生物无法比拟的优越性，成为了科学家们最理想的研究对象。

本文分别从问题的提出、历史的发展、现状的分析和前景的预测四个方面对拟南芥在科学界的地位及作用进行了综合性的总结和叙述。

关键词：拟南芥；模式植物；遗传；应用一、前言纵观过去和现在，科学界对拟南芥的重视程度以及拟南芥在生物遗传学的地位有着巨大的差异。

尤其是近几年来，科学界对拟南芥的热衷程度日渐加深，完全不同于90年代以前的冷淡。

而且现在的科学家们对于拟南芥的研究方向是各种各样的，越来越广泛。

本文就是对拟南芥在不同研究课题下所起的作用、在遗传应用上所表现的优越性进行一个总结性的综述，探讨产生此种现象的原因，从而得出此种作物在生物学上的大致研究方向，并作出相应的前景预测，让我们对它的研究潜力进行进一步的挖掘，让它的贡献更大化。

此外，也希望通过本文，让大家对拟南芥在过去和现在的发展有一个更加清楚的了解，把握住大致的脉络，并对今后的研究提供相应的指导和帮助。

二、历史的发展：虽然孟德尔以豌豆为实验材料开创了现代遗传学, 后来麦克林托克又研究了玉米, 发现了惊人的“跳跃基因”, 但总的来说, 这些植物都不是研究分子遗传学的良好材料。

高等植物通常需要较大的种植面积, 特殊的条件, 而且繁殖周期长。

更糟的是, 植物的基因组通常都很大（例如, 玉米的基因组比果蝇的大两个数量级）, 使人们难以分离到特定的基因[1]。

因此, 虽然K’Roberts早就认为植物是研究发育的良好系统,但迄今为止, 在研究植物的细胞分化和形态发生等方面一直进展迟缓。

长期以来, 分子生物学家们一直希望能在植物中找到象动物中的黑腹果蝇(Drosophila me-lanogaster)那样繁殖快, 易于在实验室中培养,并能用分子生物学和遗传学技术进行广泛研究的实验材料,以便从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。

植物芥子酶研究进展摘要：芥子酶防御系统为白花菜目植物特有，由芥子酶及其底物硫代葡萄糖苷组成，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，在受到病虫侵袭时，底物和酶相遇，硫代葡糖苷被降为有毒化合物，起防御作用，对植物芥子酶防御系统研究进展进行了综述，包括基因家族的结构、基因的表达调控、芥子酶的细胞定位、植物以外其它生物的芥子酶、硫代葡糖苷／芥子酶系统起源进化以及其可能功能等。

关键词：芥子酶；硫代葡糖苷；防御；起源进化；细胞定位1硫代葡糖苷／芥子酶防御系统简介十字花科植物分布很广，一般来说，它们在生物界具有一定生存和扩张的优势，这种优势得益于其独特的硫代葡糖苷／芥子酶体系，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，在必要时，如机械损伤时，底物和酶相遇，硫代葡糖苷被降解为有毒化合物，抵御病虫侵袭，这就是人们所说的“芥子炸弹”，然而，有些害虫(专性昆虫)通过协同进化，已克服了硫代葡糖苷降解产物的毒性，因此，硫代葡糖苷／芥子酶体系的防御功能主要针对兼性昆虫。

硫代葡糖苷一方面是十字花科植物的防御工具，另一方面，又对菜籽油的品质和菜籽饼蛋白质的利用有不利影响，如何培育植株高硫而种子低硫的品种引起了油菜育种家的高度重视，硫代葡糖苷的种类很多，已鉴定结构的超过100种，它们的差别在于R-基团的不同，与生氰葡糖苷类似，硫代葡糖苷的侧链也来自氨基酸，芥子酶是专一降解硫代葡糖苷的酶，甘蓝型油菜大约有20～25个这样的基因，目前还不清楚是否存在不同基因编码的酶对底物有不同的要求，但有证据显示，拟南芥的TGG1和TGG2的功能是冗余的。

根据油菜(B.napus)和拟南芥芥子酶eDNA推断，芥子酶单体的分子质量为59kD左右，然而，所有植物芥子酶都不同程度糖基化，使芥子酶单体分子质量达到65～75kD，在植物体内，芥子酶一般以二聚体形式存在，分子质量在135～150kD之间，芥子酶的二维结构已得到阐明，它折叠为(α/β)。

桶状，与得到详细研究的、来自Trifolium repens的生氰葡糖苷酶的结构非常相似，一般认为，芥子酶起源于生氰葡糖苷酶(eyanogenie glucosidase)，芥子酶(S-β-葡糖苷酶)的一级结构与O-β-葡糖苷酶的一级结构有很高的同源性，尽管还有一些不同意见，一般认为，区别S-β-葡糖苷酶和O-β-葡糖苷酶的有效方法是看该多肽在187位(以S.alba结晶芥子酶为参照)是谷氨酸还是谷氨酰氨，到目前为止，所有芥子酶都是谷氨酰胺残基，而O-β-葡糖苷酶都是谷氨酸残基，谷氨酸残基(酸性氨基酸)是O-β-葡糖苷酶活性中心的重要组成部分，是硫代葡糖苷降解时的质子供体，在芥子酶中，这一位置被谷氨酰胺取代后，酶活性需要低浓度的抗坏血酸来激活，以抗坏血酸作为质子供体，这一变化可能增加了植物对酶的作用的时空调控的机制，对芥子酶的晶体结构分析结果表明，抗坏血酸位于芥子酶的活性中心，可能代替。

拟南芥基因功能研究与应用拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常见的模式植物，是目前植物分子生物学和遗传学研究中最为常用的实验材料。

通过对拟南芥基因的功能研究，我们可以更深入地了解植物的生长发育、代谢途径、基因网络等方面的知识。

同时，拟南芥的研究还能为我们提供许多应用价值，比如农业上的基因编辑和新型植物品种的筛选。

一、拟南芥的基因组学研究拟南芥的基因组学研究已经取得了长足的进展。

在2000年，拟南芥的基因组测序项目得以完成，它的基因组大小为125 Mb，共有5条染色体，包含26000余个基因。

拟南芥的基因组拥有丰富的遗传资源，胞浆基因和线粒体基因都可以被水平转移，同时基因重组速度快、自交能力强，基因突变率高。

这些特点使得拟南芥成为一种理想的植物模式生物。

二、拟南芥基因功能研究拟南芥基因功能研究广泛应用于植物分子生物学、细胞生物学、生物化学等领域。

比如拟南芥基因敲除实验，利用现代分子遗传学技术破坏拟南芥基因的表达，以此探究基因的功能。

还有过表达和突变蛋白分析、遗传与表观遗传调控分析、基因互作网络分析、表型分析等多种研究技术手段，可以帮助我们深入研究拟南芥基因的功能。

三、拟南芥基因功能研究的应用1. 基因编辑拟南芥基因编辑是一种基于CRISPR/Cas9技术的新型技术，它可以通过选择特定的目标基因进行切割，进而实现基因敲除、基因修饰等目的。

利用基因编辑技术可以实现植物的遗传改良，比如提高植物的产量、抗病性等方面的性状，为农业生产提供更好的品种资源。

2. 新型植物品种筛选通过对拟南芥基因的研究，我们可以找到一些控制植物生长发育的基因，并进一步利用这些基因构建新型植物品种。

比如通过分离拟南芥的苯丙素羧化酶基因、ABA感受蛋白基因，已经构建出了抗旱、抗盐的拟南芥新品种。

通过利用这些基因，未来我们有可能构建出更加强壮、生产率更高的植物品种。

四、拟南芥基因功能研究面临的挑战拟南芥基因功能研究虽然已经取得了很好的进展，但仍然面临一些挑战。