全长cDNA的获得_RACE及其他方法进展
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全长cDNA酶切和连接体系页数:2
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全长CDNA克隆方法页数:2
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全长cDNA主要构建方法的比较页数:4
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新基因全长cDNA的克隆策略页数:8
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一种构建全长cDNA文库的方法页数:3
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全长cDNA在功能基因组学中的意义页数:3
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RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
获得真核生物cDNA全长
获得真核生物cDNA全长★miRNA(金币+1):请按照版规发贴！！！以后不要求一律清除，请修改！【资源】获得真核生物cDNA全长1．获得真核生物cdna全长总的思路分离基因一般就从中心法则dna、rna、蛋白质的三个层次入手做工作。
随生物信息学的发展，电脑克隆基因也称为新兴的技术。
从题目获得全长cdna的要求上讲，即使上述几个途径得到的是基因片断，现有的途径也是可以完成cdna 全长的获得的（如下图示）。
因此，cdna全长的获得是技术上可以解决的问题，而目的基因的寻找，特别是未知功能的基因的克隆是比较关键的问题，下面就基因克隆的方法做一简要介绍：2．基因克隆的方法简介2-1．基因克隆的方法策略选择原则从表3中可见分离克隆基因基本上有三种类型：即三中不同的条件，可根据欲克隆的目的基因选择条件选择相应的方法。
类型i已知基因的序列（1）已知dna序列，包括三种情况，一是已知目的基因的dna全部或部分dna序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的dna序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cdna全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。
（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。
在这两种情况下一般采用pcr技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。
类型ii已有基因图位或标记，转座子等条件，分别可采用转座子标签法、t-dna标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。
类型iii为止目的基因序列（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。
可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和ddrt-pcr、ssh-pcr、rap-pcr、dna-rda、cdna捕捉法等进行克隆。
（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行，是难度较大较繁琐的策略。
从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。
由EST到全长cDNA—RACE及相关技术进展
王锋 超 高京 生 粟 永 萍
（第 三 军 医 大 学 全 军 复 合 伤 研 究 所 ， 庆 ４ ０ ３ ） 重 ００ ８
摘 要 ：由 Ｅ Ｔ 出发 获得 仝长 ｃ ＮＡ是 基 因组和功 能基 因 组研 究 的重 要 内容 之 一，ＤＮ Ｓ Ｄ ｃ Ａ末 端 快 速 扩 增技 术 （ Ａ Ｅ） 实现 此 目的 的 重 要 方 法。 本 文 对 Ｉ￣ Ｅ的 基本 原 理 及 其 改进 ， 其 是 Ａ —ＭＶ Ｒ Ｃ 是 Ｌ． Ｃ 尤 Ｍ 酶 ａ （ｅ ｐａ ｗ ｔ ） 能 的应用 带来 的技 术 革 新进 行 了综述 。 Ｓ ｔｍ ｌｔ ｓ ｉ ｈ 功 ｅ ｃ
ｅ １ ９ ２ ０ ５ ３ ）：６ ＿ ４ ０ ．９ ５．７ （ ２ ５ ４ ７ ＿ ７
［ ］ Ａ ｍ Ｖ ｕ ｅ ． ｃ ｓ ｅ ２ ０ ，８ １ ） Ｅ ６ ２ Ｎ ｄ ｉ Ａ ｉ ｓ ０ ０ ２ （ ２ ： ６ ｚ ｄＲ ［ ］ 朱 滨 等 生 物 化 学 与 生 物 物理 进 展 ，０ １ ２ （ ） ３ ２０ ，８ １ ：
关键 词 ： 达序 列标 签 ； 表 奎长 ｅ Ａ；ＤＮ ＤＮ ｅ Ａ末 端 快 速 扩 增 中 围分 类号 ： ５ Ｑ ５ Ｑ ２； ７
利 用 表 达 序 列 标 签 （ ｘ ｒｓｅ ｅｅ ｃ ｅｐｅｓｄ ｓｑ ｎｅ ｔ ，Ｓ ） ａ Ｅ Ｔ 不但 可 以对 基 因进 行染 色 体定 位 ， ｇ 而 且 通 过 比较 不 同 研 究 条 件 下 的 Ｅ Ｔ 表 达 Ｓ 情 况 ， 获得 丰 富 的 生 物 学 信 息 。但 绝 大 多 可 数 Ｅ Ｔ分 布 在 基 因 的 ３端 ， 据 库 中 代 表 基 Ｓ 数 因 ５端上游信息 的 Ｅ Ｔ只 占很小 的 比例 ， Ｓ 而 且 Ｅ Ｔ的长 度 都 在 ３ ０～５ ０ ｐ 间 ， 从 Ｓ ０ ０ ｂ之 仅
（第 三 军 医 大 学 全 军 复 合 伤 研 究 所 ， 庆 ４ ０ ３ ） 重 ００ ８
摘 要 ：由 Ｅ Ｔ 出发 获得 仝长 ｃ ＮＡ是 基 因组和功 能基 因 组研 究 的重 要 内容 之 一，ＤＮ Ｓ Ｄ ｃ Ａ末 端 快 速 扩 增技 术 （ Ａ Ｅ） 实现 此 目的 的 重 要 方 法。 本 文 对 Ｉ￣ Ｅ的 基本 原 理 及 其 改进 ， 其 是 Ａ —ＭＶ Ｒ Ｃ 是 Ｌ． Ｃ 尤 Ｍ 酶 ａ （ｅ ｐａ ｗ ｔ ） 能 的应用 带来 的技 术 革 新进 行 了综述 。 Ｓ ｔｍ ｌｔ ｓ ｉ ｈ 功 ｅ ｃ
ｅ １ ９ ２ ０ ５ ３ ）：６ ＿ ４ ０ ．９ ５．７ （ ２ ５ ４ ７ ＿ ７
［ ］ Ａ ｍ Ｖ ｕ ｅ ． ｃ ｓ ｅ ２ ０ ，８ １ ） Ｅ ６ ２ Ｎ ｄ ｉ Ａ ｉ ｓ ０ ０ ２ （ ２ ： ６ ｚ ｄＲ ［ ］ 朱 滨 等 生 物 化 学 与 生 物 物理 进 展 ，０ １ ２ （ ） ３ ２０ ，８ １ ：
关键 词 ： 达序 列标 签 ； 表 奎长 ｅ Ａ；ＤＮ ＤＮ ｅ Ａ末 端 快 速 扩 增 中 围分 类号 ： ５ Ｑ ５ Ｑ ２； ７
利 用 表 达 序 列 标 签 （ ｘ ｒｓｅ ｅｅ ｃ ｅｐｅｓｄ ｓｑ ｎｅ ｔ ，Ｓ ） ａ Ｅ Ｔ 不但 可 以对 基 因进 行染 色 体定 位 ， ｇ 而 且 通 过 比较 不 同 研 究 条 件 下 的 Ｅ Ｔ 表 达 Ｓ 情 况 ， 获得 丰 富 的 生 物 学 信 息 。但 绝 大 多 可 数 Ｅ Ｔ分 布 在 基 因 的 ３端 ， 据 库 中 代 表 基 Ｓ 数 因 ５端上游信息 的 Ｅ Ｔ只 占很小 的 比例 ， Ｓ 而 且 Ｅ Ｔ的长 度 都 在 ３ ０～５ ０ ｐ 间 ， 从 Ｓ ０ ０ ｂ之 仅
RACE原理及其应用
RACE 的简介目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA 通过转录获得全长cDNA 很困难。
近年来发展成熟的cDNA 末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE 技术已逐渐取代了经典的cDNA 文库筛选技术，成为克隆全长 cDNA 序列的常用手段。
第二 RACE 的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’ 末端，是一种简便而有效的方法，又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边 PCR(one2side PCR)。
3’RACE 的原理一)加入 oligo(dT)17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到(-)cDNA；二)以 oligo(dT)l7 和一个 35bp 的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA 末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链。
扩增的特异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补．而用接头引物来取代 dT17 一 adaptor 则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE技术
RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。
目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。
因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。
第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
cDNA末端快速扩增技术的研究进展_邬珺超
SLIC -PCR 全称为单链连接单链 cDNA 的 PCR (single strand ligation to ss -cDNA PCR), 它 是 对 RACE 技术中的加尾反应进行了改良 。
当 mRNA 数量不多或所得的组织为有限量的时 候克隆全长 cDNA 就 成为一项艰巨的工作 。 通常 , 一个序列很容易加到 5' 末端作为反转录的引物 , 与 特异引物或带有 poly(dT)尾的寡聚核苷酸配合 , 利 用大多数 mRNA 3' 末端的 poly(A)序列进行扩增[ 3] 。 也可以设计在 cDNA 3' 末端加上已知的序列 。 许多 人都考虑到用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)进 行 dG 或 dA 的加尾 , 但是这一方法有着很大的局限 性 。首先 , TdT 的反 应很难 控制而 且效率 比较低 。 其次 , 作为合成第二链的引物包含一个同聚(dC 或 dT)尾 , 会产生非特异性扩增 , 这一情况降低了低丰 度 mRNA 的分离效率 。 要避免这些缺陷 , 有些人用 双链 cDNA , 是在其两端连接上合断的 cDNA[ 9] 。
timum carbamide concentration (0 .1g/ L)as an organic nitrogen source could enhance the growth of S .platensis and the phycobiliprotein content .When carbamide concentration was over 0 .2g/ L , S .platensis grew slowly , and even died beyond 0 .4g/ L .It was also found that both the growth of S .platensis and the phycobiliprotein content were affected by sodium chloride concentration .When sodium chloride concentration was 0 %or 2 .0 %, S .platensis grew as the control (0 . 2 %), but the phycobiliprotein content was higher than the control .S .platensis grew slowly when sodium chloride concentration was over 4 .0 %, and even died after 3 days over 6 .0 %.
当 mRNA 数量不多或所得的组织为有限量的时 候克隆全长 cDNA 就 成为一项艰巨的工作 。 通常 , 一个序列很容易加到 5' 末端作为反转录的引物 , 与 特异引物或带有 poly(dT)尾的寡聚核苷酸配合 , 利 用大多数 mRNA 3' 末端的 poly(A)序列进行扩增[ 3] 。 也可以设计在 cDNA 3' 末端加上已知的序列 。 许多 人都考虑到用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)进 行 dG 或 dA 的加尾 , 但是这一方法有着很大的局限 性 。首先 , TdT 的反 应很难 控制而 且效率 比较低 。 其次 , 作为合成第二链的引物包含一个同聚(dC 或 dT)尾 , 会产生非特异性扩增 , 这一情况降低了低丰 度 mRNA 的分离效率 。 要避免这些缺陷 , 有些人用 双链 cDNA , 是在其两端连接上合断的 cDNA[ 9] 。
timum carbamide concentration (0 .1g/ L)as an organic nitrogen source could enhance the growth of S .platensis and the phycobiliprotein content .When carbamide concentration was over 0 .2g/ L , S .platensis grew slowly , and even died beyond 0 .4g/ L .It was also found that both the growth of S .platensis and the phycobiliprotein content were affected by sodium chloride concentration .When sodium chloride concentration was 0 %or 2 .0 %, S .platensis grew as the control (0 . 2 %), but the phycobiliprotein content was higher than the control .S .platensis grew slowly when sodium chloride concentration was over 4 .0 %, and even died after 3 days over 6 .0 %.
cDNA末端快速扩增技术RACE
原理图
原理图
伸等方法来保证mRMA 5′末端的获取，但又需要大量的mRNA。
阳性对照RACE PCR实验
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
◇ Tota（l R3N）A无降解，OD260/280=1.
poly(C)替代poly(A)
利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。
碱基互补 配对原则
AT之间 形成两个氢键
GC之间 形成三个氢键
poly(C)替代poly(A) 增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性
增加模板中有效双链丰度 提高目的基因获取几率
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
cDNA第一链的合成机制
SMARTer RACE流程
基本RACE原理
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法列标签(express
sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 用cDRNNAa末se 端保快护速、扩S1增核(R酸A酶C谱E)和技引术物。延
GSP1：5’-RACE PCR的反义引物 GSP2：3’-RACE PCR的正义引物
注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似
GSP 与 cDNA 模板的关系
NGSP：槽式（Nested）PCR引物
扩增后的预期：
利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ， 目的序列的5′端和 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 cDNA第一链的合成机制 ◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。 目的序列的5′端和 cDNA第一链的合成机制 ◇ Total RNA无降解，OD260/280=1. NGSP：槽式（Nested）PCR引物 基本RACE 原理和方法
原理图
伸等方法来保证mRMA 5′末端的获取，但又需要大量的mRNA。
阳性对照RACE PCR实验
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
◇ Tota（l R3N）A无降解，OD260/280=1.
poly(C)替代poly(A)
利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。
碱基互补 配对原则
AT之间 形成两个氢键
GC之间 形成三个氢键
poly(C)替代poly(A) 增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性
增加模板中有效双链丰度 提高目的基因获取几率
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理
cDNA第一链的合成机制
SMARTer RACE流程
基本RACE原理
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法列标签(express
sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 用cDRNNAa末se 端保快护速、扩S1增核(R酸A酶C谱E)和技引术物。延
GSP1：5’-RACE PCR的反义引物 GSP2：3’-RACE PCR的正义引物
注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似
GSP 与 cDNA 模板的关系
NGSP：槽式（Nested）PCR引物
扩增后的预期：
利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ， 目的序列的5′端和 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 cDNA第一链的合成机制 ◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。 目的序列的5′端和 cDNA第一链的合成机制 ◇ Total RNA无降解，OD260/280=1. NGSP：槽式（Nested）PCR引物 基本RACE 原理和方法
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE技术的原理和操作
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。