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酵母菌表面展示操作结果处理步骤酵母菌表面展示操作结果处理步骤：酵母菌表面展示是一种常见的实验方法，用于将外源蛋白或多肽在酵母菌表面进行展示和检测。
在进行酵母菌表面展示实验时，我们需要对实验结果进行处理和分析。
下面将介绍酵母菌表面展示操作结果处理的步骤。
1. 收集酵母菌样品：首先，收集酵母菌样品，可以从培养基中收集菌液或者从已经生长的酵母菌菌落上收集相应数量的菌体。
确保收集的菌体数量足够进行后续实验操作。
2. 提取酵母菌蛋白：将收集到的酵母菌样品进行离心，去除培养基，然后用适当的缓冲液洗涤菌体。
接下来，使用蛋白提取缓冲液裂解酵母菌细胞壁，使蛋白释放到缓冲液中。
离心样品，将上清液收集，这个上清液中含有酵母菌蛋白。
3. 确定蛋白浓度：使用蛋白浓度检测方法（如BCA或 Bradford 方法）确定提取的酵母菌蛋白的浓度。
根据实验需求，可以进行稀释或浓缩。
4. SDS-PAGE分析：可以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对酵母菌蛋白进行分离。
将提取的蛋白样品与还原剂混合，然后在含有SDS的凝胶中进行电泳。
电泳结束后，用染色剂染色，然后观察和拍摄凝胶图像。
从图像中可以确定蛋白的相对分子质量和可能的修饰情况。
5. 免疫印迹（Western blot）分析：针对特定的蛋白目标，可以使用Western blot方法进行检测。
将酵母菌蛋白经过SDS-PAGE分离后，将其转移到膜上，同时与特定的抗体进行反应。
然后使用二抗进行检测。
免疫印迹分析可用于确定酵母菌蛋白的存在与否，以及其在不同条件下的表达水平。
6. 免疫荧光染色：免疫荧光染色可以用来直接检测酵母菌表面展示的蛋白。
将处理后的酵母菌样品接触特异性的荧光标记的抗体，通过显微镜观察标记蛋白的荧光信号。
免疫荧光染色的优势是可以在细胞水平上观察蛋白的表达和定位情况。
7. 流式细胞术（Flow cytometry）分析：利用流式细胞术可以定量分析酵母菌表面展示的蛋白。
酵母菌表面展示技术的操作步骤酵母菌是一种单细胞真核生物，广泛应用于生物学研究和工业生产领域。
酵母菌表面展示技术是一种能够将外源蛋白质展示在酵母菌细胞表面的策略，通过该技术可以实现对外源蛋白质的表达、研究以及应用，具有广泛的应用前景。
下面将详细介绍酵母菌表面展示技术的操作步骤：1. 初始准备- 在操作前，确保实验室已经消毒，并准备好无菌的培养基、试剂和物品。
2. 外源蛋白质的构建- 根据研究目的选择要展示的外源蛋白质，并将其基因序列导入到适当的表达载体中。
- 确保载体中包含适当的启动子、终止子和酵母菌表面展示所需的信号肽序列。
3. 转化酵母菌细胞- 根据实验需要，选择合适的酵母菌株，并使用合适的方法将表达载体导入到酵母菌细胞中。
- 可以使用化学转化、电转化或者凝胶转化等方法完成酵母菌的转化。
4. 选择与筛选转化的酵母菌细胞- 在转化酵母菌细胞后，将转化混合液平板涂布到选择性培养基上，用于筛选含有表达载体的酵母菌细胞。
- 通常会使用一种选择性培养基，如含有抗生素的培养基。
5. 单克隆酵母菌细胞的选取- 从选择性培养基中筛选并选取出生长良好的酵母菌单克隆，进行扩展培养。
6. 表达外源蛋白质- 在酵母菌单克隆经扩展培养后，将酵母菌细胞转移到含有适当培养基和诱导条件的培养环境中。
- 通过调节培养基的pH、温度和添加诱导物质等方式，促使外源蛋白质的表达。
7. 分析表达蛋白质- 从培养基中收集酵母菌细胞，离心去除培养基，然后进行细胞破碎、蛋白质提取和纯化。
- 利用蛋白质电泳、Western blot等方法对表达蛋白质进行分析和鉴定。
8. 酵母菌表面展示蛋白质的检测- 使用流式细胞仪或者免疫荧光染色等方法，检测和分析酵母菌表面展示的外源蛋白质。
- 可通过检测细胞表面的免疫标记或者荧光标记来进行定量和定位的分析。
总结：酵母菌表面展示技术是一种重要的生物技术手段，可用于外源蛋白质的展示、表达和分析。
通过以上操作步骤，可以实现将外源蛋白质有效地展示在酵母菌细胞表面，并对表达的蛋白质进行分析和鉴定。
酵母菌表面展示实验的结果与分析酵母菌表面展示实验是一种常用的实验方法，用于研究酵母菌表面展示的蛋白质或肽段在酵母菌细胞表面的表达情况。
通过展示外源蛋白质或肽段，可以使其被酵母菌表面的分泌途径所识别并定向到细胞表面，从而实现对目标蛋白质的高效表达和功能研究。
在进行酵母菌表面展示实验时，首先需要将目标蛋白质或肽段与适当的表达载体进行克隆，然后转化到酵母菌细胞中。
转化后的酵母菌经过培养和筛选，选择出成功表达目标蛋白质或肽段的菌落。
一旦成功表达了目标蛋白质或肽段，我们可以通过多种方法来鉴定表达情况。
其中常用的方法包括：1. 免疫荧光染色法：利用特异性抗体标记目标蛋白质或肽段，然后观察染色结果。
这种方法可以直接在酵母菌细胞表面或整个细胞上观察到目标蛋白质的表达情况和分布。
2. Western blotting：将目标蛋白质或肽段从酵母菌表面提取，然后通过电泳分离和转膜技术将其转移到膜上，最后使用特异性抗体进行检测。
这种方法可以定量地分析目标蛋白质或肽段的表达水平，并检测可能存在的剪切变异。
3. 流式细胞术（流式细胞仪）：将酵母菌细胞悬浮液通过流式细胞仪进行分析，观察目标蛋白质或肽段在细胞表面的分布和表达水平。
流式细胞术可以高效地分析大量细胞，提供了快速和准确的表达分析结果。
除了对酵母菌表面展示的蛋白质或肽段进行鉴定，还可以根据实验目的进行一系列的分析和研究。
1. 结构分析：通过X射线晶体学、核磁共振等方法对目标蛋白质或肽段的结构进行分析，了解其三维结构和功能。
2. 亲和力测定：通过亲和层析、表面等静电效应等技术，研究目标蛋白质或肽段与其他分子的相互作用，比如配体结合亲和力的测定。
3. 酶活性分析：对于具有酶活性的蛋白质或肽段，可以通过相关的酶活性分析方法，研究其催化特性和底物特异性。
总结一下，酵母菌表面展示实验的结果与分析是对目标蛋白质或肽段在酵母菌表面表达情况的鉴定及其进一步的研究。
通过免疫荧光染色法、Western blotting、流式细胞术等方法可以鉴定目标蛋白质或肽段的表达水平和分布情况。
酵母菌表面展示实验操作步骤简介酵母菌表面展示实验是一种常用的实验方法，用于研究酵母菌表面展示的蛋白质。
这些蛋白质可以通过遗传工程技术，将目标蛋白质与酵母菌表面蛋白质基因进行融合，从而使目标蛋白质在酵母菌细胞表面展示，并且能够通过特定的检测方法进行定量和定性的分析。
以下是酵母菌表面展示实验的操作步骤简介：1. 培养酵母菌菌株：选择适当的酵母菌菌株，如常用的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae。
使用含有适当营养物质和抗生素的培养基培养酵母菌菌株，确保菌株的生长和健康状态。
2. 载体构建：将目标蛋白质基因与酵母菌表面蛋白质基因进行融合，构建一个含有目标蛋白质基因的表达载体。
此步骤可以通过基因重组技术、PCR扩增、限制性内切酶酶切等方法完成。
3. 转化酵母菌：将构建好的表达载体转化至酵母菌中，使酵母菌细胞内含有目标蛋白质基因。
转化可以使用化学方法、电穿孔法、电极法等。
4. 选择性培养：将转化后的酵母菌接种至含有适当选择性抗生素的培养基中，这可以帮助筛选出含有目标蛋白质的酵母菌细胞。
5. 鉴定表达：通过Western blot、免疫荧光染色、流式细胞仪等方法检测酵母菌表面是否成功展示目标蛋白质。
这些方法可以帮助确定目标蛋白质是否成功表达以及表达的量和稳定性。
6. 表面展示检测：使用特定的探针或抗体，对酵母菌表面的目标蛋白质进行检测和定量。
这可以帮助研究者了解目标蛋白质在酵母菌细胞表面的展示情况，并评估展示效果的高低。
7. 功能研究：利用目标蛋白质在酵母菌表面展示的特性，进行后续的功能研究。
这可以通过适当的实验方法和技术，如酵母两杂交、酵母表面亲和实验、酵母表面分子相互作用等，来研究目标蛋白质与其他分子之间的相互作用和功能。
8. 数据分析和解释：将实验获得的数据进行统计分析和解释。
根据实验结果，得出相关结论，并进行后续实验设计和研究方向的确定。
总结：酵母菌表面展示实验是一种重要的实验方法，可用于研究酵母菌表面展示的蛋白质。
酵母菌表面展示实验的结果分析与数据处理导语：酵母菌表面展示实验是一种常用的实验方法，通过将目标蛋白质与酵母表面展示系统相结合，使得目标蛋白质能够在酵母细胞表面表达与展示。
本文将对酵母菌表面展示实验的结果进行分析与数据处理，以期得出准确的实验结果。
一、实验结果分析1. 数据收集与整理在进行酵母菌表面展示实验后，首先需要整理所收集的数据。
这包括实验前后酵母菌生长的形态、数量和质量等方面的变化。
同时，也要记录实验过程中的操作步骤、实验条件和重复次数等信息。
2. 数据统计与分组对于酵母菌表面展示实验结果的数据，可以根据实验设计将数据分组进行统计。
例如，可以将不同基因型（表达目标蛋白质的酵母菌株）的实验结果分组，将不同处理条件下的实验结果分组。
这样可以更清楚地观察和分析不同变量对实验结果的影响。
3. 图形展示与比较为了更直观地展示实验结果，可以使用图形（如柱状图、折线图等）来呈现数据。
通过比较不同组别之间的数据差异，可以初步了解是否存在明显的实验效果。
同时，也可以通过图形的趋势和分布情况来推测实验结果的趋势和规律。
二、数据处理方法1. 平均值计算对于同一组别的多次实验结果，可以计算平均值来代表该组的实验效果。
通过平均值的比较，可以初步判断不同实验条件下的差异。
2. 方差分析如果实验结果中存在多组数据，可以使用方差分析（ANOVA）来分析不同组别之间的差异是否显著。
方差分析可以通过计算得到F值和P值，用于判断不同组别之间的差异是否具有统计学意义。
3. 多重比较如果方差分析结果显示不同组别之间存在显著差异，可以进一步进行多重比较。
多重比较方法（如Tukey's HSD、Bonferroni等）可以用于确定具体有哪些组别之间存在差异，并计算差异的大小。
4. 标准曲线拟合在某些情况下，需要根据实验结果绘制标准曲线来估计目标蛋白质的含量。
标准曲线通常是通过已知浓度的标准溶液进行测定，然后使用曲线拟合方法来计算未知样品的浓度。
酵母菌表面展示结果的观察与分析酵母菌是一种单细胞真菌，广泛应用于食品工业、酿酒业、发酵工艺等领域。
近年来，人们发现酵母菌表面的展示系统可以用于在其表面展示外源蛋白，这一发现为生物工程领域带来了巨大的潜力。
本文将对酵母菌表面展示结果进行观察与分析。
首先，观察酵母菌表面展示外源蛋白的方法主要包括显微镜观察、流式细胞术和免疫荧光染色。
通过这些观察手段，可以直观地看到酵母菌表面是否成功展示了目标蛋白。
同时，还可以利用荧光标记技术对目标蛋白进行定位和追踪。
酵母菌表面展示结果的分析主要包括两个方面：展示效率和展示稳定性。
展示效率是指酵母菌表面展示的外源蛋白的数量和比例。
可以通过比较基因工程酵母菌与野生型酵母菌的表面蛋白含量来评估展示效率。
常用的方法包括Western blot和ELISA。
这些方法可以定量分析目标蛋白的表达水平，并与野生型菌株进行对比。
展示稳定性是指外源蛋白在酵母菌表面的稳定性。
由于酵母菌的生命周期相对较短，展示的外源蛋白在酵母菌分裂过程中容易丢失。
因此，需要找到一种方法来提高展示蛋白的稳定性。
例如，可以利用分子生物学技术，将目标蛋白与特定的结构域相连，增加其在细胞表面的稳定性。
此外，还可以通过诱导表面蛋白展示的相关途径，如促进特定酵母菌表面结构的形成，从而增加展示稳定性。
在观察和分析酵母菌表面展示结果时，还需要考虑到多种因素的影响，如培养条件、表达构建物的设计等。
培养条件对酵母菌的生长和表面展示都有重要影响。
例如，温度、pH值、培养基配方等都会对展示效果产生影响。
因此，在进行观察与分析时，应注意优化培养条件，以确保最佳的展示效果。
此外，表达构建物的设计也是影响展示结果的重要因素。
选择合适的载体和表达引物，可以提高目标蛋白在酵母菌表面的展示效率和稳定性。
此外，还可以设计特定的信号序列，用于指导目标蛋白在细胞内的定位和在细胞表面的展示。
总之，观察与分析酵母菌表面展示结果是评估酵母菌作为表面展示系统的重要步骤。
酵母菌表面展示操作步骤主要步骤详解酵母菌表面展示是一种常用的生物工程技术，可以将外源基因表达在酵母菌表面，并实现其在菌体表面的展示和分析。
下面将详细介绍酵母菌表面展示的主要步骤及操作步骤。
第一步：选择适当的酵母菌株选择适合表面展示的酵母菌株是酵母表面展示技术成功的关键。
常用的酵母菌株包括Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris等。
选择合适的酵母菌株时需要考虑其生长速度、耐受性、表面展示效果等因素。
第二步：构建目标融合基因构建目标融合基因是实现酵母菌表面展示的重要步骤。
目标融合基因通常包括目标蛋白的编码序列和酵母菌表面蛋白的信号肽序列。
信号肽序列可以将目标蛋白导向到酵母菌表面。
第三步：构建表达载体将目标融合基因插入适当的表达载体中，使其能够在酵母菌中高效表达。
表达载体通常包括启动子、选择标记基因和转录终止子等功能元件。
第四步：转化酵母菌将构建好的表达载体导入到酵母菌细胞中，使其能够表达目标融合基因。
转化的方法可以包括化学法、电转法等。
第五步：筛选表达融合蛋白的酵母菌株通过适当的筛选方法，筛选出能够高效表达融合蛋白的酵母菌株。
常用的筛选方法包括选择性培养基筛选和荧光筛选等。
第六步：表达融合蛋白的酵母菌培养将表达融合蛋白的酵母菌株进行培养，使其能够大规模生产融合蛋白。
培养条件需要优化，包括培养基配方、温度、培养时间等。
第七步：酵母菌表面展示条件优化根据目标融合蛋白的性质，对酵母菌表面展示的条件进行优化。
优化条件包括诱导条件、培养基成分、诱导时间等。
第八步：检测和分析表面融合蛋白通过合适的检测和分析方法，对表达融合蛋白的酵母菌株进行表面展示效果的分析。
常用的方法包括流式细胞术、ELISA、Western blot等。
第九步：应用和应用展望根据表面融合蛋白的性质和应用需求，将其应用于不同领域的研究或工业生产中。
酵母菌表面展示技术在药物研发、酶工程、疫苗研究等领域都具有广泛的应用前景。
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示与分析表面展示与分析在酵母菌表面展示操作步骤中扮演着重要的角色。
通过表面展示与分析的步骤，我们可以确定酵母菌表面展示的蛋白质、酸性糖和其他小分子的存在与浓度，并进一步研究它们在酵母菌表面的功能以及与其他生物体的相互作用。
下面将介绍酵母菌表面展示与分析的详细操作步骤。
步骤一：酵母菌培养和收获首先，我们需要培养酵母菌株。
将所需酵母菌株接种到含有适宜培养基的培养皿中，在恒温摇床上以适宜的温度和速度培养酵母菌。
随着时间的推移，我们可以看到酵母菌的增殖。
当培养时间达到一定程度时，需要收获酵母菌。
通过离心将培养基与酵母菌分离，然后去除上清液，保留酵母菌沉淀。
步骤二：酵母菌预处理将酵母菌沉淀洗涤数次，去除杂质和培养基残留物。
洗涤过程通常使用PBS等缓冲液进行多次离心。
这步骤的目的是为了准确检测酵母菌表面的分子，去除可能干扰的物质。
步骤三：标记酵母菌表面分子标记是表面展示与分析过程中的关键步骤。
可以使用生物素化学方法，将生物素（biotin）与酵母菌表面的分子结合。
这样，酵母菌表面的分子就被标记为生物素化的形式。
步骤四：生物素-亲和素标记在进行生物素-亲和素标记之前，需要进行一次阻断。
将酵母菌与一定浓度的牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白质混合，以防止非特异性吸附的发生。
然后，将生物素-亲和素与酵母菌混合，让其发生特异性结合。
亲和素以及其他特异性结合剂可以根据实际需求进行选择。
步骤五：洗涤和检测洗涤是为了去除非特异性结合的物质。
可以使用PBS等缓冲液进行多次洗涤，确保只有特异性结合的生物素-亲和素留在酵母菌表面。
最后，使用适宜的检测方法来分析酵母菌表面的生物素-亲和素。
常用的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光染色、免疫共沉淀等。
这些方法可以定量检测酵母菌表面特定分子的存在以及其浓度。
此外，还可以使用其他分析方法，如质谱分析和核磁共振等，进一步鉴定和分析酵母菌表面的分子。
总结起来，酵母菌表面展示与分析的操作步骤主要包括酵母菌培养和收获、酵母菌预处理、标记酵母菌表面分子、生物素-亲和素标记、洗涤和检测。
酵母菌表面展示操作步骤的过程介绍酵母菌表面展示是一种基因工程技术，通过将目标蛋白质或多肽序列与酵母菌表面展示系统结合，实现对这些蛋白质或多肽的展示和筛选。
这种技术被广泛应用于药物研发、抗体筛选、酶工程、蛋白质相互作用研究等领域。
以下是酵母菌表面展示的操作步骤：1. 构建表面展示载体：选择合适的酵母菌表面展示系统，并根据需要构建表达载体。
常见的酵母菌表面展示系统包括酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酵母菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），大肠杆菌表面展示库（例如大肠杆菌表面展示），酿造酵母鲜酪公田展示库（例如CCAGG）。
2. 克隆目标基因：将目标基因（需要展示和筛选的蛋白质或多肽）插入构建的表达载体中。
常用的克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶联制和DNA连接等。
3. 转化酿酒酵母：将构建好的表达载体导入酿酒酵母中。
转化方法可以采用电穿孔、化学转化或冷冻复苏法等。
4. 培养酵母菌：将转化后的酵母菌接种到含有适当选择性培养基的培养基上，并在适合的温度下培养。
培养基中的选择性物质可以选择对含有目标蛋白质的菌落进行筛选。
5. 筛选目标蛋白质：根据需要对酵母菌进行筛选。
常用的筛选方法包括抗体或配体结合、酶活性分析、细胞亲和力或细胞表型选择等。
6. 测试和验证：对筛选出的目标蛋白质进行测试和验证。
可以使用多种方法，如Western blot、ELISA、流式细胞术、活细胞荧光显微镜等。
酵母菌表面展示的分析与结果解读酵母菌表面展示是一种重要的生物技术应用，它利用酵母菌作为宿主来表达、展示目标蛋白。
这种技术可以用于研究蛋白质结构和功能、开发新的药物和疫苗、以及产生高效的工业酶等。
在本文中，我们将对酵母菌表面展示的分析方法以及结果的解读进行探讨。
首先，酵母菌表面展示的分析方法主要有以下几种。
第一种是免疫荧光染色法，可以通过使用特异性抗体来检测目标蛋白的表达情况。
这种方法可以用于快速筛选高表达的酵母菌克隆，并定量评估表达水平。
第二种是流式细胞术，可以通过标记目标蛋白特定抗体或荧光标记来分析细胞表面展示蛋白的数量和分布情况。
这种方法可以用于分析细胞表面展示蛋白的动态变化以及不同条件下的表达水平。
第三种是酵母双杂交系统，通过检测靶蛋白与酵母细胞表面展示蛋白的相互作用来分析蛋白的结构和功能。
这种方法可以用于筛选潜在的结合伙伴或酵母菌表面展示蛋白的结构域。
在进行酵母菌表面展示的结果解读时，需要考虑以下几个方面。
首先是表达水平，通过以上提到的分析方法可以评估酵母菌表面展示蛋白的表达水平。
较高的表达水平通常说明酵母菌对目标蛋白的表达能力良好，但也可能导致细胞质内聚积和毒性。
其次是目标蛋白的稳定性和正确折叠情况，这可以通过免疫印迹法或质谱法来分析。
如果目标蛋白在酵母菌表面展示时出现异常聚集或不稳定的情况，可能需要对表达系统进行优化或调整。
此外，还需要检测目标蛋白的活性，通过相关的酶活检测方法来评估目标蛋白在酵母菌表面展示后是否保持了其活性。
此外，在酵母菌表面展示的结果解读时，还需考虑实验设计、条件优化和对比分析等因素。
合理的实验设计可以降低结果的偏差并提高可重复性。
条件优化可以通过改变培养基组分、温度、pH值等条件来优化酵母菌表面展示系统，以提高目标蛋白的表达水平和稳定性。
对比分析可以通过将不同变量进行比较，来分析不同因素对酵母菌表面展示的影响。
总结起来，酵母菌表面展示的分析与结果解读涉及到多种分析方法和因素的综合考虑。
酵母表面展示IGRP206-214-H-2K d单链三聚体及对NOD鼠CD8+T细胞的活化作用徐娅雯 李凯 王宇航 马旻轩 伏娇 潘兴元 钱莉 龚卫娟 季明春 （扬州大学医学院病原生物学和免疫学教研室，江苏扬州，225001）摘要：目的:为阐明胰岛细胞特异性葡萄糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白(IGRP)导致TID发病的机理，研究酵母表面展示IGRP206-214-H-2K d单链三聚体对NOD小鼠CD8+T细胞的影响。
方法：在本室已有真核表达型IGRP206-214-H-2K d单链三聚体的基础上，构建IGRP206-214-H-2K d单链三聚体的真核酵母表达载体，筛选高表达IGRP206-214-H-2K d单链三聚体的酵母菌，进而研究酵母表面展示IGRP206--H-2K d单链三聚体对NOD小鼠CD8+T细胞的影响。
结果：转染IGRP206-214-214H-2K d单链三聚体的真核表达载体的酵母菌，在含2%D-半乳糖的酵母培养基中，20°C诱导18h，有77.1%的酵母能稳定表达IGRP206-214-H-2K d单链三聚体蛋白。
体外试验证明表达IGRP206-214-H-2K d单链三聚体的酵母菌能激活NOD鼠脾脏CD8+T细胞。
结论：本研究为进一步纯化真核表达IGRP206-214-H-2K d单链三聚体蛋白以及研究其在T1D发病过程中的分子机理提供了研究基础。
关键词：I型糖尿病；H-2K d；酵母展示；CD8 + T 细胞中图分类号：R 392.2 文献标志码：A 文章编号：Displaying of IGRP206-214-H-2K d SCT on yeast surface and activation of CD8+T cellsof NOD miceXu Yawen, Li Kai, Wang Yuhang, Ma Minxuan, Fu Jiao, Pan Xingyuan, Qian Li, Gong Weijuan,Ji MingchunDepartment of Pathogeniology ＆ Immunology,School of Medicine,YangzhouUniversity,Yangzhou 225001,ChinaAbstract: Objective: To study TID pathogenesis caused by islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit related protein (IGRP). Methods: On the basis of the eukaryotic expression of IGRP206-214-H-2K d-SCT we have had, we constructed a yeast expression system for IGRP206-214-H-2K d-SCT displayed on the yeast cell surface, screen the yeast with high expression of IGRP206-214-H-2K d-SCT, and then to study the effect of yeast surface display IGRP206-214-H-2K d-SCT on CD8+T cells of NOD mice. Results: After screened inducing expression condition, 77.1% of yeast cells are expressed IGRP206-214-H-2K d protein under condition of 2% of D-galactose and 18h of induced period at 20 °C. Then, we proved that yeast expressed specific proteins could activate spleen CD8+T cells of NOD mouse in vitro. Conclusion:Our results provide base research for extracting IGRP206-214-H-2K d protein and study molecular mechanism of T1D pathogenesis induced by IGRP206-214.[KEY WORDS]Type 1 diabetes mellitus;H-2K d;Yeast expression system;CD8 + T cellsI型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1D）是以胰岛β细胞受到自身反应性T细胞破坏为主要特征的一种慢性自身免疫性疾病[1]。
目前研究已表明CD8+Ｔ淋巴细胞对胰岛细胞的浸润以及其分泌的细胞因子对T1D发病发挥重要作用[2]。
CD8+T淋巴细胞是参与细胞免疫的主要效应细胞，以TCR识别抗原肽-MHC-I复合物（Major Histocompatibility Complex，MHC-I）的方式识别靶细胞表面的多肽抗原后活化成为抗原特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTLs）[3]，并通过分泌穿孔素，合成一氧化氮、IFN-γ、IFN-α、IFN-β等细胞因子等途径促进胰岛细胞的死亡[4]。
葡萄糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白（IGRP）是在I型糖尿病的发病进程中出现的自身抗原，Ko等研究表明12周后NOD鼠血液中特异性结合IGRP206-214的CD8+T细胞迅速增加，并伴随整个T1D发病过程[6]。
因此，胰岛细胞IGRP206-214抗原肽与CD8+细胞的识别互作在T1D发病过程中起着关键作用。
但是，其具体分子机理尚未明确。
为了探索IGRP206-214对小鼠体内IGRP特异性CTL的影响，我们实验室采用二硫键捕获型MHC单链三聚体（disulfide-trap single-chain trimer, dtSCT）技术[7]将IGRP206-214肽段、β2微球蛋白（β2m）和H-2K d依次串联成单链三聚体，构建IGRP206-214-H-2K d单链三聚体真核表达载体。
采用IGRP206-214-H-2K d 单链三聚体真核表达载体接种7周龄NOD母鼠，发现过表达IGRP206-214-H-2K d 单链三聚体显著提高血糖值和发病率，表明IGRP206-214特异性CTLs与T1D发病关系密切【待发表】。
表面展示是在保持相对独立的空间结构和生物活性的基础上使表达的多肽以融合蛋白形式展示在核糖体、病毒或细胞表面，从而研究多肽的性质、相互识别和作用。
酵母是真核生物，在蛋白质的折叠和分泌机制方面与哺乳动物相似，同时也具有折叠酶、分子伴侣、内质网等，所以可以用来展示糖基化和二硫键异构化等修饰的真核生物蛋白质。
为进一步研究IGRP206-214特异性CTL在NOD小鼠T1D发病中的作用，本研究将IGRP206-214-H-2K d单链三聚体以融合蛋白形式表达在酵母表面，经过诱导条件筛选提高融合蛋白表达量，接着用展示了IGRP206-214-H-2K d单链三聚体的酵母与淋巴细胞共培养，检测其对特异性CD8+ T细胞的作用，为特异性CD8+ T细胞的抗原表位研究提供新思路。
1 材料与方法1.1 IGRP206-214-H-2K d单链三聚体酵母展示载体构建以真核表达载体‘pcDNA3.1-1’为基础，将插入的IGRP206-214-H-2K d单链三聚体重组到酵母表达载体pCT302中。
由于该载体多克隆位点酶切位点为Eco RI和Nhe I，而IGRP206-214-H-2K d单链三聚体中334～339碱基位点含有Eco R I酶切位点，因此需要先用SOE-PCR[9]将此酶切位点突变掉，突变位点为336位的A变为G，最终在5′端和3′端分别加上EcoR I和Nhe I酶切位点，克隆到pCT302载体中，并转化DH5α感受态中，-80°C保存备用。
构建过程中使用的引物见表1。
PCR具体反应体系及反应如下：50ng的模板DNA；1µl 10×PCR buffer；1µl dNTP（2mM）；1µl 上、下游引物（10µM）；5.4µl ddH2O；0.1µl Taq酶，1.5µl ddH2O。
PCR扩增程序如下：94 °C预变性3min；94°C变性45s；55°C退火40s；72°C延伸1min，2-4步骤重复35个循环；72°C延伸10min。
限制性内切酶Eco R I、Nhe I、T4连接酶、Taq酶试剂均购自Takara 公司。
连接步骤参照试剂盒说明，Purified anti-mouse H-2Kd为Bio-Legend公司产品(SF1-1.1)。
表1 引物序列Table1 Primer sequences名称Name 引物序列（5’-3’）Sequence (5’-3’)备注NoteW1 AATGAATTCGTGTACCTGAAGACCAACGTCTTCCTC FW2 CTCAGTGGGGGTGAGTTCAGTGTGAGCCAGG RW3 CCTGGCTCACACTGAGTTCACCCCCACTGAG FW4 CGCTAGAGAATGAGGGTCATGAACCAT RW5 CAGGAACTGACAACTATATGC FW6 AATGCTAGCAAAAACATACTGTGTGTTTATGG R 使用上海生工生物工程技术有限公司的UNlQ-10柱式酵母质粒DNA抽提试剂盒，提取重组酵母IGRP206-214-H-2K d单链三聚体-pCT302质粒DNA。
将上述产物进行酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送往上海生工生物工程技术有限公司测序。
1.2 酵母细胞转化及外源蛋白诱导条件的筛选真核表达受体为酿酒酵母菌（EBY100），将提纯的阳性质粒pCT302-IGRP206-214-H-2K d单链三聚体及空载体pCT302分别通过电击转化法转化至EBY100感受态细胞内。
转化菌液涂布在选择培养基平板上（2%D-葡萄糖，0.67%酵母氨基氮源，1%酪蛋白氨基酸，2%琼脂），培养30°C，48h后挑选阳性单菌落在选择液体培养基（2%D-葡萄糖，0.67%酵母氨基氮源，1%酪蛋白氨基酸）中摇菌，培养条件为30°C，24h，200rpm/min振荡培养。
