番茄VKOR基因的克隆、生物信息学分析及功能初步研究

基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第10期，第4656-4663页研宄报告Research Report番茄蛋白酶抑制剂基因从P//如的克隆、表达与生物信息学分析马宁刘亚荣崔军洪雨慧栾雨时’大连理工大学生物工程学院，大连，116024* 通信作者，丨****************.cn摘要蛋白酶抑制剂(protease inhibitor，PI)在植物系统防御中发挥着关键作用。

为研究番茄P/基因的表达 模式及其编码蛋白的相关性质，本研究从番前中克隆7 —■个P1基因家族的成员，命名 为从P//00(登录号：X P_004249682.1)。

该基因编码区长为285 b p,编码94个氨基酸、蛋白的半衰期30 h、不稳定指数37.5、脂肪族指数丨21.17、平均疏水性0.189、理论等电点9.38、相对分子量10.52 k D、为疏水性蛋 白。

经同源性分析和多序列比对得知该基因具有P I功能结构域，属于马铃薯蛋白酶抑制剂I家族。

q R T-P C R 分析显示S L P//00在番茄根中的表达量最高，其次为叶，推测其在抗土传病害和叶部病害过程中发挥重要功 能；在致病疫霉菌()的侵染下，该基因的相对表达量呈现先升尚后下降的趋势，表明 其在番茄与病原菌互作过程中发挥重要作用。

本研究为番茄P/基因功能的鉴定以及培育抗病工程植株奠定 了基础。

关键词番前CSoZfl/iu.m Zyco/;e m V u m)，蛋白酶抑制剂，克隆，生物彳目息学分析Cloning, Expression and Bioinformatics Analysis of Tomato Protease Inhibitor Gene SLPIJ00M a Ning Liu Yarong Cui Jun H o n g Yuhui Luan Yushi*School of Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian, 116024* Corresponding author, *****************.cnDOI: 10.13417/j.gab.039.004656Abstract Protease inhibitor(PI)plays a key role in plant defense systems.In order to study the related properties and expression patterns of tomato PI gene,this study cloned a m e m b e r of the PI gene family from tomato,named SLPIJ00(GenBank accession number:X P 004249682.1). The length of the coding region of this gene was285 bp, with a predicted protein sequence of94 amino acids,a half-life of30 h,an instability index of37.5, an aliphatic index of 121.17, an average hydrophobicity of 0.189, a theoretical isoelectric point of 9.38, and a relative molecular weight of10.52 k D,a hydrophobic protein.The multi-sequence alignment and protein domain prediction indicated that the protein of this gene had a PI functional domain,belonged to the potato proteinase inhibitor I(Pin I ) family.q R T-P C R analysis showed that tomato SLPI100had the highest expression in roots,followed by leaves, which was presumed to play an important role in the process of resistance to soil-bome diseases and leaf diseases; Under the induction of Phytophthora infestans,the relative expression of this gene increased at f i r s t and then decreased later,indicated that i t played a role in the interaction between tomato and pathogens.This study laid the foundation for further identification of gene functions and cultivation of disease-resistant engineering plants.K e y w o r d s Tomato(SoUurum lycopersicurn),Protease inhibitor,Cloning,Bioinformatics analysis基金项目：本研宂由国家自然科学基金项目(31872116)资助引用格式：Ma N.，Liu Y.R., Cui J.，Hong Y.Y., and Luan Y.S., 2020, Cloning, expression and bioinformatics analysis of tomato protease inhibitor gene Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology)，39(10): 4656-4663 (马宁,刘亚荣，崔军，洪雨慧，栾雨时，2020,番茄蛋白酶抑制剂基因从P//洲的克隆、表达与生物信息学分析，基因组学与应用生物学, 39(10): 4656-4663)番茄蛋白酶抑制剂基因S /,P //00的克隆、表达与生物信息学分析4657番®5(So/wium /ycopersiVum )是世界范围内广泛 种植的重要蔬菜作物(Bhattarai et al .，2016)，在其生 长发育过程中常常会受到环境和微生物的影响(Fry ,2008)。

一、实验目的1. 掌握基因工程的基本操作流程；2. 学习将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞的方法；3. 了解转基因番茄的培育过程及注意事项。

二、实验原理多聚半乳糖醛酸酶（PG）是一种存在于植物细胞壁中的酶，能降解细胞壁中的果胶，使细胞壁软化，从而影响果实硬度。

将抗PG基因导入番茄细胞，可以降低PG的表达，提高果实硬度，延长番茄的保鲜期。

三、实验材料1. 普通番茄细胞；2. 抗PG基因；3. 农杆菌；4. 植物组织培养基；5. DNA限制性内切酶；6. DNA连接酶；7. DNA电泳仪；8. 转基因检测仪。

四、实验步骤1. 目的基因的克隆（1）提取抗PG基因，并使用DNA限制性内切酶进行酶切；（2）将酶切后的抗PG基因与质粒载体连接，形成重组质粒；（3）将重组质粒转化农杆菌。

2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化至农杆菌；（2）筛选出含重组DNA的农杆菌。

3. 农杆菌介导的基因转化（1）将筛选出的农杆菌接种于番茄叶片上；（2）在适宜条件下培养，使农杆菌与番茄细胞接触并转化。

4. 转基因番茄植株的筛选（1）将转化后的番茄叶片接种于培养基上；（2）观察植株生长情况，筛选出转基因植株。

5. 转基因植株的分子鉴定（1）提取转基因植株DNA；（2）使用DNA限制性内切酶进行酶切；（3）将酶切后的DNA进行电泳分析；（4）与标准DNA进行比对，验证转基因植株。

6. 转基因番茄植株的性状表现观察（1）观察转基因番茄植株的果实硬度、保鲜期等性状；（2）与普通番茄进行对比，验证抗PG基因的表达效果。

五、实验结果与分析1. 成功克隆抗PG基因，并将其导入农杆菌；2. 通过农杆菌转化，成功获得转基因番茄植株；3. 通过分子鉴定，验证转基因植株中存在抗PG基因；4. 转基因番茄植株的果实硬度较普通番茄高，保鲜期延长。

六、实验结论1. 成功将抗PG基因导入番茄细胞，培育出抗软化、保鲜时间长的转基因番茄；2. 该实验为番茄基因工程育种提供了技术支持。

番茄脆皮突变体的基因克隆与功能研究
番茄是一种重要的蔬菜作物，富含多种营养物质，如维生素C、胡萝卜素等。

然而，在番茄的生产过程中，硬度不足容易导致损失，影响着番茄的品质和口感。

为了解决这个问题，研究人员在番茄品种中发现了脆皮突变体，这一突变体具有较高的硬度和耐储存能力，因此备受关注。

为了深入研究脆皮突变体的特性，研究人员开始探索其基因机制。

最新的研究表明，这一突变体的基因突变位于染色体7上，导致了一个新的基因，称为SlBGAMT1（soluble beta-galactosidase mitochondrial 1）。

通过对这一基因的克隆和功能研究，研究人员发现，SlBGAMT1参与了番茄果实的细胞壁代谢过程。

具体来说，它参与了果实细胞壁构建的过程，并影响了果实细胞壁中的多糖物质的合成和解聚。

这种调控作用最终导致了独特的果实硬度和贮存性能。

此外，研究人员还发现，SlBGAMT1对番茄植株的根系发育和吸收水分等方面也有一定的影响。

这些发现不仅为进一步改良番茄品种提供了新的思路，同时也对于理解番茄果实的生长发育及其细胞壁合成机制具有一定的意义。

对于进一步研究SlBGAMT1所参与的细胞壁代谢过程，研究人员正在尝试利用基因编辑技术对其进行删除或逆转录，以期验证其作用机制，并找到更好的方法来应对相关的问题。

总之，番茄脆皮突变体的基因克隆与功能研究为我们提供了新的思路和方法，有望为改良蔬菜品种、优化农业生产等方面带来实际的应用价值。

本氏烟与番茄AtTOM类基因克隆与功能初步分析的开题报告一、选题背景烟草是我国农业经济中的重要作物之一，而其所含尼古丁成分会对人体造成不良影响。

研究烟草中尼古丁的生物合成机制，不仅能够减少其成分量，还可以为开发新型烟草和尼古丁替代品提供科学依据。

番茄是一个重要的生物模型，其拥有完整的基因组信息和丰富的遗传变异资源，能够作为人们研究其他问题的良好研究对象。

因此，将番茄作为模型生物来研究烟草中尼古丁的生物合成机制，具有很大的研究意义和应用前景。

二、研究内容本研究旨在从番茄（Solanum lycopersicum）中克隆与烟草生物合成尼古丁相关的AtTOM基因，通过组织学定位等方法验证其在番茄中的表达情况，同时利用烟草作为外源表达系统，进一步分析其具体的生物学功能。

三、研究方法1.文献调研法：收集和阅读有关烟草中尼古丁生物合成机制以及AtTOM基因的相关文献，基于前人的研究成果进行深入分析。

2.基因克隆法：经过PCR扩增，将番茄中与AtTOM基因序列高度相似的片段克隆下来，并进行序列化鉴定。

3.基因表达谱鉴定法：利用RT-PCR等方法，进行不同组织、不同开花期番茄中AtTOM基因的基因表达谱鉴定，研究其在番茄中的表达情况。

4.系统生物学法：利用酵母正反向杂交、CS-CL分析等方法，对AtTOM基因的功能进行分析。

四、研究意义本研究将通过研究烟草中尼古丁的生物合成机制，为减少烟草中尼古丁的含量以及开发新型烟草和尼古丁替代品提供科学依据。

同时，基于番茄的外源表达系统，能够更全面深入地分析AtTOM基因的功能，从而揭示烟草中尼古丁合成的分子机制。

此外，本研究对于开展植物次生代谢相关的深入研究，具备一定的理论和实践的推广应用价值。

西北农业学报2011,20(4):96-101A cta A gr icultur ae Bor eali-occidental is Sinica番茄W RK Y基因的克隆与分析金慧,栾雨时(大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连116024)摘要:W RKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生物和非生物胁迫中起重要作用。

以水杨酸诱导的番茄为材料,设计简并引物后进行R T-PCR扩增,得到4个含有WR KY结构域的EST。

选择其中之一,采用同源克隆的方法扩增出W RK Y基因的全长。

半定量PCR分析结果表明,400mmol/L N aCl、4e低温胁迫后该基因表达量发生变化,说明其可能与番茄的耐盐性和耐低温性有关。

关键词:番茄;WRK Y转录因子;基因克隆;序列分析中图分类号:Q812文献标志码:A文章编号:1004-1389(2011)04-0096-06Isolation and Analysis of W RK Y Gene from TomatoJIN Hui and LU AN Yushi(Sch ool of Life S cien ce an d Biotechnology,Dalian U nivers ity of T echnology,Dalian Liaoning116024,Chin a)Abstract:WRKY transcription facto r can regulate the expression of dow nstr eam stress resistance genes,and plays an important role in plant biotic and abiotic stress resistance.In this r esearch,sal-i cylic acid-induced to mato w as used and the degener ate primers w ere designed according to the WRKY conserv ed coding region.After RT-PCR am plificatio n four WRKY EST s containing the WRKY do-m ain w as obtained and a ful-l length cDNA o f WRKY w as am plified using hom olog y cloning.In this ex periment,sem-i quantitative PCR analysis show ed that,400mm ol/L NaCl and4e low temperature stress changed the g ene ex pression pattern,w hich indicated that salt and low tem perature tolerances w ere related to WRK Y g ene in tomato.Key words:T omato;WRKY tr anscription factor;Gene cloning;Sequence analysisWRKY转录因子是一类植物所特有的抗逆相关转录因子超家族,它具有1或2个由WRKYGQK序列和锌指结构组成的约60个氨基酸的区域。

doi ：10.19928/ki.1000-6346.2021.2004多毛番茄CIPK 基因家族生物信息学分析及低温下功能研究柴　畅1　狄成乾1　汪　杨2　王傲雪1，2*（1东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）摘　要：CIPK 基因家族是Ca 2+介导的植物信号转导途径中的一个关键家族，在植物胁迫响应和生长中起着关键作用。

本试验基于多毛番茄全基因组数据筛选出24个多毛番茄CIPK 基因家族成员，系统进化分析将家族成员分为5个亚组，家族成员内部含有5个基因复制对。

亚细胞定位分析表明，多毛番茄CIPK 基因大多定位于细胞质；少数分布于质膜、细胞核、线粒体。

共线性分析结果表明，拟南芥和栽培番茄中的CIPK 基因家族中分别有14个和12个基因与多毛番茄存在共线性关系。

顺式作用元件分析结果表明，多毛番茄CIPK 基因家族基因含有光、激素、冷胁迫等相关的元件。

实时荧光定量PCR 结果表明，低温胁迫下ShCIPK2、ShCIPK17、ShCIPK19表达量显著提高，推测这3个基因可能在多毛番茄低温胁迫应答中起重要的作用。

关键词：多毛番茄；CIPK ；生物信息学；低温离子通道，调控细胞质中游离钙离子浓度变化，产生相应生理反应。

这些传感器主要包括钙调素蛋白（CaM ）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK ）和类钙调磷酸酶B 蛋白（CBL ）。

CBL 作为传感器需要与相互作用的蛋白激酶（CIPK ）特异性结合形成功能上的复合物传递植物信号，调控离子流入。

CIPK 蛋白包含保守的N 端的激酶结构域和C 端的调节结构域。

前者包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域，有可以磷酸化的激活环。

后者包含磷酸酶相互作用域PPI 和自调节结构域NAF （又称FISL 基序）。

特征氨基酸Asn （N ）、Ala （A ）、Phe （F ）、Ile （I ）、Ser （S ）和Leu （L ）组成的NAF 基序是结合CBL 蛋白所必需的（Albrecht et al.，2001）。

番茄CIPK 基因家族鉴定及生物信息学分析王傲雪，刘思源（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨150030）摘要：为挖掘番茄中CIPK 基因家族成员序列信息，以拟南芥CIPK 基因家族成员氨基酸序列为参照，用tBLASTn 方法鉴定22个番茄CIPK 基因家族成员，分析其理化性质。

MEGA 软件构建系统进化树、GSDS 软件绘制番茄CIPK 基因家族结构图。

plantCARE 对CIPKs 上游1500bp 顺式作用原件作功能预测。

运用STRING 软件探究番茄中CBL 与CIPK 基因家族互作情况，分析冷胁迫下番茄转录组数据确定番茄CIPKs 表达情况。

根据系统进化关系发现CIPK 基因家族可分为八个亚组，每个亚组中均含番茄CIPK 成员，存在多个平行同源基因对。

SlCIPK 基因分为内含子富集（11~14）和少内含子缺失（0~1）两类。

经鉴定，在番茄CIPKs 基因的上游1500bp 序列中存在不同顺式作用元件，预测番茄CIPK 基因家族在逆境胁迫中可能发挥作用，且番茄CBL-CIPK 存在较多互作通路，可能在低温胁迫下发挥作用。

研究结果为揭示CIPK 家族成员生物学功能奠定基础。

关键词：番茄；CIPK 基因家族；生物信息学；遗传进化中图分类号：S641.2文献标志码：A文章编号：1005-9369（2018）02-0031-08王傲雪,刘思源.番茄CIPK 基因家族鉴定及生物信息学分析[J].东北农业大学学报,2018,49(2):31-38.Wang Aoxue,Liu Siyuan.Identification and bioinformatics analysis on CIPK gene family in tomato[J].Journal of Northeast Agricultural University,2018,49(2):31-38.(in Chinese with English abstract)Identification and bioinformatics analysis on CIPK gene family in tomato/WANG Aoxue,LIU Siyuan(School of Horticulture and Landscape Architecture,NortheastAgriculture University,Harbin 150030,China)Abstract:In order to explore the sequence information of CIPK gene family in tomato,22CIPKgene family members of tomato were identified by tBLASTn based on the amino acid sequence of CIPK gene family of Arabidopsis thaliana .Also their physico-chemical properties were ing MEGA software to construct the phylogenetic tree,GSDS software was used to study the structure information of tomato CIPK gene family.Picked up 1500-bp sequences upstream the 5'end of the full-length cDNAs for SlCIPK genes to identify putative stress-responsive cis -elements.STRING software was used to explore the interaction between CBL gene family and CIPK gene family in tomato and the expression of CIPKs under cold stress was analyzed according to the tomato transcriptome data.According to the phylogenetic relationship,CIPK gene family could be divided into eight subgroups,and each subgroup contained the distribution of CIPK members of tomato,in which there existed multiple parallel homologous gene pairs.CIPK genes were divided into exon-rich (11-14)and exon-poor (0-1)groups.It has been identified that there were multiple cis -acting elements that responded to different收稿日期：2018-01-15基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFE0105000）；黑龙江省现代农业产业技术协同创新体系岗位专家项目作者简介：王傲雪（1973-），教授，博士，博士生导师，研究方向为植物分子细胞生物学。