作者：祝明亮罗义勇李梅云杨金奎张克勤来源：《烟草农业科学》摘要：植物病原真菌的抗药性特别是对内吸性杀菌剂的抗药性是植物病害化学防治中的一个非常严重的问题，它给多种农作物和经济作物的病害防治带来了严重困难，给国家和农民造成了大量经济损失。
研究植物病原真菌抗药菌的生物学特征以及它们的抗药机制对于改进化学农药使用策略，延缓抗药性的产生，推进植物病害的化学防治，具有十分重要的理论和实践意义。
本文综述了近年来国内外植物病原真菌对内吸性杀菌剂抗药性研究在抗性菌和敏感菌的生物学特征、内吸性杀菌剂对植物病原真菌的作用机制、植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗药机制、抗性菌株的分子检测技术以及抗药性利用等方面的成果。
关键词：植物病原真菌；内吸性杀菌剂；抗药性；研究进展植物病原真菌对杀菌剂的抗药性是指本来对药剂敏感的植物病原真菌，由于基因突变或其它原因出现了药物敏感性下降的现象。
尽管早在1954年James等[1]就提出了这一现象，但是这一问题直到20世纪60年代末才引起人们真正重视。
1969年，由于内吸性杀菌剂苯来特（Benomyl）在生产上大量地使用，首先在黄瓜白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）上产生了抗药性，随后又在其它几十种病原真菌上产生了抗药性，并且有越来越严重的趋势。
到目前为止，用于防治植物病原真菌的杀菌剂种类已经很多，与抗药性问题关系密切的有有机硫杀菌剂、内吸性杀菌剂和抗菌素类杀菌剂，特别是内吸性杀菌剂的抗药性问题最为严重。
由于杀菌剂抗药性问题的迅速出现和发展，给植物病害的防治带来了越来越大的困难，给农业造成了重大的经济损失，引起了世界各国政府和农民的普遍关注。
为了有效防止或延缓杀菌剂抗药性的产生，许多国家和地区相继开展了对杀菌剂的抗药性研究。
人们首先对敏感菌和抗药菌的生物学特征进行了大量的对比研究，试图在此研究的基础上发现抗性病原真菌的抗药机制，最终来指导农药的合理使用和病菌的有效防治。
经过大量研究人员的辛苦努力，在植物病原真菌对杀菌剂抗药性问题的研究上，尤其是对内吸性杀菌剂的研究上，目前已取得了较大的进展。
1. 抗性菌和敏感菌的生物学特征对比抗性菌生物学特征即抗性菌的越冬、越夏、生长、繁殖和对环境的适应力等方面的特征。
许多情况下，抗性菌由于遗传变异等原因，在生物学特征上表现出与敏感菌有所不同，如在菌丝生长、产孢、与温度或渗透压的关系、致病力等方面的差异，这些差异影响着抗性菌在自然界与敏感菌的竞争力。
当抗性菌的竞争力强时，比较容易形成抗药性群体；反之，只要降低选择压力，就不易形成抗药性群体。
此外，有些抗性菌对同类或不同类的杀菌剂具有交互抗药性或负交互抗药性。
因此，人们可以根据抗性菌的特点，判断合理的用药策略，延缓或阻止抗药性群体的形成。
1.1 菌丝生长、产孢、孢外酶活力和致病力等方面的差异据研究报道，大多数抗药性病原真菌突变的适合度低于敏感菌。
抗药性菌株表现出菌丝生长速率慢，产孢量和产孢密度低，孢子萌发能力弱且滞后，孢外酶活力低，致病力弱，甚至完全失去致病力等特征[2，3]。
然而并不是所有的抗药性菌株的适合度都低于敏感菌，有些抗药性菌株具有很高的适合度，与野生敏感菌没有差异，甚至比敏感菌还高。
纪明山等研究灰霉病菌（Botrytis cinerea）对多菌灵（Carbendazim）和乙霉威（Dithofencarb）抗药性时，发现抗药菌与敏感菌在生长速率、产孢能力及致病力等方面无显著差异[4]。
徐作珽等报道蔬菜灰霉病菌对速克灵（Procymidone）的抗性突变体表现出较强的适应性，能正常生长繁殖产孢和侵染致病，且生存竞争能力较敏感菌强[5]。
我们在CA平板上测定烟草黑胫病菌对甲霜灵高抗、低抗和敏感菌株生长速率时发现，高抗菌株的生长速率较低抗和敏感菌株更快，而且高抗菌株仍然保持了较高水平的致病力。
1.2 交互抗药性与负交互抗药性交互抗药性是指植物病原真菌对一种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过但作用机制相似的药剂也产生了抗药性的现象。
与交互抗药性相反，负交互抗药性是指植物病原真菌对某种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过的药剂敏感性更强的现象。
交互抗药性和负交互抗药性在同类或不同类的杀菌剂之间普遍存在[6，7]。
1.3 多效性多效性是指抗药菌的抗性基因可以同时引起其它的性状，如对低温、高温或渗透压的敏感性。
Thomas等在研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对苯来特的抗药性时，发现在173个抗性菌株中，有6个菌株对低温敏感，3个菌株对生长温度敏感[8]。
在研究植物病原真菌对二甲酰亚胺类杀菌剂（Dicarboximides fungicide，DCFs ）的抗药性时，粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）os-1型渗透压突变菌表现出对DCFs的抗药性[9]。
2. 内吸性杀菌剂的作用机制与植物病原真菌的抗药机制内吸性杀菌剂是指能在植物发病后，通过内吸或渗透作用进入植物体内，抑制或杀死病原菌，使病株不再受害、恢复健康的药剂，主要有以下几类：苯并咪唑类（Benzimidazoles），二甲酰亚胺类，有机磷类（Organophosphates），苯酰胺类（Phenylamides），甾醇生物合成抑制剂类(Sterol Biosynthesis Inhibitors，SBIs )和甲氧基丙烯酸酯类(Strobilurins)（表 1）。
表 1 内吸性杀菌剂的种类、杀菌机制及病原菌抗药机制2.1 苯并咪唑类苯并咪唑类杀菌剂是最早也是最成功的内吸性杀菌剂，由于该类杀菌剂大量和长期的使用，病原真菌对它的抗药性问题越来越严重。
在真菌对杀菌剂抗药机制的研究中，真菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药机制的研究最系统、最深入。
该类杀菌剂的杀菌机制为：首先结合构成纺缍丝的微管蛋白，使微管的形成受阻，从而破坏纺缍丝的功能，阻碍细胞的正常有丝分裂，使菌株不能正常的生长。
研究表明，不同病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性的主要机制是病原真菌的β-微管蛋白与该类杀菌剂的结合力下降，而杀菌剂同微管蛋白的亲和性的改变又与β-微管蛋白的结构变化有关。
分子生物学研究表明，在抗药菌β-微管蛋白的192-202个氨基酸上会发生基因突变，这类突变会导致β-微管蛋白的三维构象发生变化，从而阻止药剂与β-微管蛋白的结合，使病原真菌产生抗药性。
对田间抗药菌研究表明其突变位点主要集中在氨基酸的198 位和200 位[10]，其它位点上的突变往往导致竞争力的减弱，因而在田间不易出现。
但玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）[11]和马铃薯干腐病菌（G. pulicaris）[12]对苯并咪唑类杀菌剂抗性菌的β-微管蛋白基因并没有发生改变，说明在不同病菌中或者在镰刀菌中对该类药剂发生抗药性突变的位点不同。
2.2 二甲酰亚胺类二甲酰亚胺类杀菌剂是20世纪70年代初推出的一类广谱性杀菌剂。
随着这类杀菌剂的大规模使用，很多植物病原真菌都对其产生了抗药性。
这类杀菌剂对真菌的孢子萌发、菌丝生长均有抑制作用，导致菌体形态改变，菌丝顶端产生了不正常的分枝和肿胀。
另外，在该类杀菌剂的处理下，病原真菌细胞内的甘油，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等内源物的水平会显著提高。
关于DCFs作用于病原真菌的机制，Lyr在1987提出了一种假说――自由基介导的细胞毒假说。
该假说认为DCFs诱导菌体产生还原态的氧自由基，从而攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引起细胞膜脂质的过氧化反应，最终导致包括改变细胞膜通透性等一系列破坏细胞的连锁反应[13]。
关于这一假说是否成立，还存在着不同的观点。
而真菌对该类杀菌剂的抗药机制，还没有得到确切的结果。
目前，研究者们普遍认为是这些病原真菌细胞内的双组分组氨酸蛋白激酶N端的6个90氨基酸重复区的突变介导着对该类杀菌剂的抗药性（图 1）[14]。
根据抗药菌株同时具有对渗透压敏感的特征[9]，研究者们克隆了很多真菌的双组分组氨酸蛋白激酶基因，并且发现：抗药菌的N端6个90氨基酸重复区中存在着碱基的突变或缺失，从而造成氨基酸或开放阅读框的改变，所以该氨基酸重复区的突变可能是抗药性产生的原因[15，16]。
但植物病原真菌对DCFs产生抗药性的机制，还需要更进一步的研究。
图 1 双组分组氨酸蛋白激酶结构示意图2.3 有机磷杀菌剂有机磷杀菌剂是指在化学结构中含有“C-P”键的抗菌化合物，根据它们的抗菌谱可分为两类：防治白粉病的磷酰胺类（Phosporothionate）和防治稻瘟病的硫代磷酸酯类（Phosphorothiolate）。
关于这两类杀菌剂的杀菌机制，研究表明，两者各不相同。
磷酰胺类杀菌剂的作用机制以定菌磷（Pyrazophos）为例。
定菌磷在菌体内能够进一步转化成一种更毒的分子，6-乙氧基羰基-5-甲基吡唑基并[1，2a]嘧啶（pp），从而抑制真菌对氧分子的吸收。
硫代磷酸酯类杀菌剂的作用机制以异稻瘟净（Iprobenfos）为例。
异稻瘟净的分子结构与菌体内磷酯酰乙醇胺（PE）相似，可以替代PE 接受δ-腺苷高半胱氨酸提供的甲基，阻止PE转化为磷酯酰胆碱，破坏菌体生物膜的结构，抑制菌体生长。
关于磷酰胺类杀菌剂的抗药性还很少见，到目前为止只在黄瓜白粉病菌中发现对定菌磷的抗性菌株，而关于硫代磷酸酯类杀菌剂的抗药性，研究认为，室内获得的稻梨孢菌（Piricularia oryzae）高抗突变体的抗药机制是裂解药剂“S-C”键以致使其失去生物活性。
高抗菌一般生存竞争能力较低，所以在自然界很少发生。
田间产生的中抗菌的抗药机制可能与药剂靶点修饰或细胞膜透性改变有关。
2.4 苯酰胺类苯酰胺类杀菌剂是防治霜霉目真菌的专用药剂，具有显著的保护、治疗和铲除作用，广泛应用于马铃薯和番茄晚疫病的防治。
由于该类杀菌剂对病菌作用位点单一，因而很容易导致病菌产生抗药性。
由于抗药性产生而导致药效降低的事例已屡见不鲜。
该类杀菌剂在寄生组织内抑制菌丝生长和吸器形成，但不影响病原菌孢子囊的直接和间接萌发以及游动孢子的萌发[17]。
关于该类杀菌剂的作用机制，研究结果表明，它们是通过阻止尿苷掺入RNA来干扰核酸的合成（特别是γ-RNA 的合成）来实现的。
多种病原真菌试验结果表明并不是全部的RNA合成受阻。
通过研究发现，该类杀菌剂对合成细胞内核苷酸的三种RNA聚合酶有选择性抑制作用，其中对合成γ-RNA的聚合酶A的毒力最大，使核糖体不能正常工作。
关于不同真菌对苯酰胺类杀菌剂的抗性遗传机制，许多实验结果表明是属于单基因变异。
通过对莴苣霜霉病菌（Bremia lactucae）、致病疫霉（Phytophthora infestans）和寄生疫霉（P. parasitica）等的研究发现，对苯酰胺类杀菌剂的抗性是由单个主效基因控制的，其中在莴苣霜霉病菌和致病疫霉中，抗性基因为不完全显性。
