胰腺癌患者手术标本及胰液脱落细胞端粒酶活性的检测

AA几种肿瘤常用检测方法1．端粒酶活性检测很多恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性,端粒酶可以作为诊断这些肿瘤的生物学标志。

在某些肿瘤中,端粒酶表达会随着肿瘤的进展而上调,因此又可作为肿瘤恶性度评价的一个指标。

端粒酶常用检测方法1) TRAP 法:端粒酶是由蛋白质和RNA 构成的逆转录酶,可以用自身的RNA 为模板合成端粒DNA 而避免端粒的缩短。

人大部分体细胞都不表达端粒酶。

由于“末端复制问题”的存在,端粒在每次细胞分裂后就会缩短一点,当端粒缩短到一定程度就无法维持染色体的稳定,细胞最终衰亡。

恶性肿瘤中端粒酶却能被重新激活而使细胞获得永生化。

自从Kim创立了端粒重复序列扩增法(telomeric repeat ampli-fication protocol ,TRAP) 检测端粒酶的活性以来,大约85 %的恶性肿瘤被检测出具有端粒酶活性。

在目前的肿瘤标志物中,端粒酶是惟一能在大部分肿瘤中都以高阳性率检测到的物质,因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志。

该方法非常敏感,只要有10 个阳性细胞存在就可以检测出其端粒酶活性。

但是除了恶性肿瘤外,端粒酶活性也在一些正常细胞中被检测到,特别是有增生能力干细胞和活化的淋巴细胞,另外如甲状腺腺瘤和肠腺瘤等一些良性肿瘤中也能检测出端粒酶活性,从而使TRAP 法得到的结果复杂起来,因此光用定性的方法有时很难确认恶性肿瘤。

但不少研究发现正常组织和良性肿瘤中端粒酶的活性相对较低,所以可以用定量的方法进一步鉴定。

传统的TRAP 法无法对端粒酶活性做准确定量。

现在有人把实时PCR 技术与传统的TRAP 法相结合发明了实时定量TRAP 法( realtime quantitative telomeric repeat amplificationprotocal ,RQ2TRAP) ,能够对端粒酶活性进行较精确的定量,为良恶性的鉴别诊断提供了有效的手段。

但由于设备和试剂很昂贵,目前还难以普及。

胰腺癌组织端粒酶逆转录酶的表达与临床病理的关系研究薛福龙【摘要】Objective Research on pancreatic cancer telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression and clinical pathologic relationship. Methods Retrospective analysis of our hospital from June 2009 to February 2014 were clinical data of 46 cases of patients with pancreatic cancer, on pancreatic cancer lesion size, site and clinical grading, organization clearly described. Using SABC immunohistochemistry, the expression of hTERT for testing. At the same time take 46 patients with tissue adjacent to carcinoma were compared. Results The study found that patients with tumor site and expression of hTERT unrelated (P>0.05). Through the observation of patients with pancreatic cancer in the pancreas, 39 patients present expression of hTERT positive, positive rate was 84.8%, in the tissue adjacent to carcinoma, 12 cases with specimen appears as positive, positive rate was 26.1%. Expression of hTERT in clinical stage statistically signiifcant (P<0.05), and its expression of hTERT pos itive rate in stageⅠ, the lowest signiifcantly below itsⅢandⅣ. It has to do with tumor grade, size,location. Conclusion Human telomerase reverse transcriptase in pancreatic cancer tissues is higher, its expression associated with tumor has a great clinical stage, indicating that hTERT expression in tumor tissue and the expression of tissue adjacent to carcinoma difference is very big.%目的：研究胰腺癌组织端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达与临床病理的关系。

端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）实验前准备1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+and Ca2+-free）4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗材均要求RNase-free）冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。

实验步骤1．PBS洗去残余培养基；2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；4．冰浴30mins；5．4℃离心12000g，20mins；6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。

*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul50X dNTP Mix 0.5ulTS Primer 0.5ulTRAP Primer Mix 0.5ulTaq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）dH2O 19.8ulTemplate 1.0ul每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），②样本热敏对照（85℃，10mins），③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），④阳性热敏对照（85℃，10mins），⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s↖70℃，1mins↙30-33cycles9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上轻摇至条带显色④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中拍照。

病理性消化道息肉组织中端粒酶活性的检测及临床意义【摘要】目的探讨端粒酶在病理性消化道息肉中的检测及在早期胃癌或大肠癌诊断中的价值。

方法端粒重复序列扩增法(TRAP-PCR-PAGE) 检测175例胃镜活检标本端粒酶活性，标本均系电子内镜下取得的病理性胃、肠息肉组织。

结果增生性息肉、腺瘤、炎性息肉和息肉样胃(肠)癌组织的端粒酶阳性率分别为6.2%、19.5%、15．4%和85．7%；同时随着息肉直径的增大、数目的增多，其端粒酶的阳性表达率也逐渐增高。

结论端粒酶活性检测可作为消化道息肉恶变的早期预测指标。

【关键词】病理性消化道息肉；端粒酶；聚合链反应端粒是真核细胞染色体末端具有稳定染色体末端和阻止它们缩短、融合、重组和缺失作用的DNA序列，由端粒酶以逆转录的方式合成。

端粒酶活化是细胞永生化和肿瘤发生的关键步骤，利用端粒酶作为肿瘤的特异性标记物用以肿瘤的早期诊断具有重要意义。

1 材料与方法1．1 一般资料175例均为本院近两年门诊和住院就诊患者，年龄14~70岁，平均42岁；均于内镜下发现消化道息肉，息肉直径＜2 cm 76例，直径≥2 cm而＜2．5 cm 53例，直径＞2．5 cm 46例；单发息肉96例，多发息肉79例。

取息肉组织进行活检：增生性息肉40例，腺瘤82例(其中伴肠上皮化生26例，伴轻、中、重度不典型增生分别为26例、18例和12例)，炎性息肉39例、息肉样胃(肠)癌组织14例。

1．2 检测方法1．2．1 组织提取物制备胃黏膜活检组织置500 μl无菌生理盐水中漂洗,10 000 r/min离心10 min,弃去上清液,用消毒的眼科剪将组织剪碎,加冷裂解液50 μl ,混匀后置4℃孵育2 h,12 000 r/min离心15 min,取上清液置-70℃保存备用。

1．2．2 端粒重复序列扩增(TRAP) 取裂解上清液3 μl ,加入PCR 反应混合液25 μl ,去离子水补足至总体积50 μl 混匀,覆盖无菌石蜡油30 μl ,在PCR扩增仪上进行引物延伸及扩增反应。

特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变刘枫;李兆申;许国铭;任玥欣;周国雄;屠振兴【摘要】目的探讨胰腺癌 p16基因启动子区5'CpG岛甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系.方法应用甲基化特异性PCR法进行甲基化检测.结果 14/36例胰腺癌标本的p16基因启动子区5'CpG岛检测到甲基化,甲基化频率为38.9%,5例癌旁组织、1例正常胰腺组织、7例慢性胰腺炎及2例胰腺粘液性囊腺瘤未发现相应区域的甲基化.结论 p16基因启动子区5'CpG岛甲基化是胰腺癌p16基因失活的机制之一,是胰腺癌细胞区别与正常细胞的分子事件.检测p16基因甲基化可能有助于胰腺癌的诊断及鉴别诊断.【期刊名称】《中华胰腺病杂志》【年(卷),期】2002(002)002【总页数】3页(P82-84)【关键词】胰腺癌;p16基因;甲基化;甲基化特异性PCR【作者】刘枫;李兆申;许国铭;任玥欣;周国雄;屠振兴【作者单位】200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科;200433,上海,第二军医大学附属长海医院消化科【正文语种】中文【中图分类】R73在胰腺癌多步骤、多阶段发生过程中有多种肿癌相关基因参与。

p16基因是其中一个重要的抑癌基因，参与细胞周期的调控，控制细胞的生长和分化。

其失活的机制包括缺失、突变及5'CpG岛异常甲基化。

目前已在多种肿瘤中发现5'CpG岛异常甲基化是其灭活的主要机制[1]。

我们采用敏感的甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测了胰腺癌组织中p16基因启动子区5'CpG岛甲基化状态，探讨中国人胰腺癌p16基因甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系，为胰腺癌的早期诊断提供新的分子生物学指标。

端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）实验前准备1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+and Ca2+-free）4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗材均要求RNase-free）冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。

实验步骤1．PBS洗去残余培养基；2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；4．冰浴30mins；5．4℃离心12000g，20mins；6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。

*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul50X dNTP Mix 0.5ulTS Primer 0.5ulTRAP Primer Mix 0.5ulTaq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）dH2O 19.8ulTemplate 1.0ul每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），②样本热敏对照（85℃，10mins），③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），④阳性热敏对照（85℃，10mins），⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s↖70℃，1mins↙30-33cycles9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上轻摇至条带显色④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中拍照。

端粒酶活性的检测与胃癌预后关系的研究摘要】目的本研究检测胃癌组织中端粒酶活性蛋白的表达，旨在探索端粒酶表达与胃癌的生物学行为和患者预后的关系。

方法应用TRAP-PCR银染法检测40例胃癌组织和15例正常胃组织中端粒酶活性。

同时收集每一例胃癌患者的临床病理资料，并将上述标记物与患者的临床病理参数（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、pTNM分期）进行相关性分析。

结果端粒酶在正常胃粘膜的表达为13.3%(2/15)，胃癌组织中端粒酶阳性表达率为77.5%（31/40）, 差异有显著性P＜0.01；端粒酶的表达与肿瘤浸润深度、pTNM分期及有淋巴结转移呈正相关P＜0.01。

Logistic多因素回归分析示：端粒酶活性是与肿瘤浸润深度相关的危险因素（P﹤0.05）。

结论胃癌组织中端粒酶活性与胃癌的浸润转移密切相关，对它的检测有助于对胃癌患者的转移和预后做出更准确地判断，更好的指导胃癌的治疗。

【关键词】胃癌端粒酶活性临床病理参数预后转移胃癌是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一，胃癌发病率在全球范围内仅次于肺癌居第二位，胃癌在亚洲地区更为突出，在我国男性胃癌发病率仅次于肺癌，女性胃癌为第四位高发癌[1]。

侵袭与转移是胃癌的重要生物学行为之一，其全过程包括：癌基因的激活[2]；抑癌基因失活[3]；端粒酶(telomerase)活化-细胞永生化；细胞转移相关基因及凋亡抑制基因的失调等。

这些基因和蛋白表达的增加或降低均为临床检测浸润转移提供了分子标记物。

近年来分子生物学研究的进展极大帮助研究人员从分子生物学水平认识恶性肿瘤的发生与演进。

本课题采用TRAP-PCR银染法检测胃癌组织中端粒酶活性,探讨其与病人临床病理学特征的关系，旨在从分子水平分析胃癌转移相关因素，并评价上述生物学指标判断胃癌预后的价值。

1 资料与方法1.1病例及手术标本收集收集我院胃肠外科2010年3月至2010年10月之间的40例行胃癌根治术的新鲜瘤体组织标本，所有标本修剪后用生理盐水清洗，冻存在-80℃冰箱中做长期保存。

胰腺癌患者手术标本及胰液脱落细胞端粒酶活性的检测龚晓明;陈元方;陈原稼;陆星华【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2002(011)001【摘要】目的研究胰腺良、恶性患者手术标本,经ERCP所获胰液脱落细胞的端粒酶活性的表达,探索胰腺癌诊断的新方法.方法采用TRAP-ELISA的方法检测胰腺癌细胞株、胰腺良恶性疾病组织物、胰液细胞的端粒酶活性.结果6株胰腺癌细胞株均检测到了端粒酶活性,胰腺癌手术标本端粒酶的阳性率为63%(5/8),而4例正常胰腺组织和2例胰腺良性疾病患者的胰腺标本未检测到端粒酶活性.胰腺癌患者的胰液细胞中,有58%(11/19)检测到有端粒酶活性的表达,而胰腺良性疾病也有高达62.5%(5/8)的阳性率,两者无差别.结论胰腺癌组织标本中有较高的端粒酶活性表达;胰液脱落细胞检测端粒酶活性无助于鉴别胰腺良恶性疾病.【总页数】4页(P50-53)【作者】龚晓明;陈元方;陈原稼;陆星华【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院,妇产科,北京市,100730;中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科;中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科;中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.粪便肠脱落细胞端粒酶活性检测对老年大肠癌的早期诊断价值 [J], 徐梅华;蔡克银;赵勇2.胆管癌患者胆汁脱落细胞端粒酶活性和p53基因突变检测的临床意义 [J], 郑强;薛平;卢海武;胡以则3.联合检测尿液Survivin浓度及脱落细胞端粒酶活性在膀胱移行细胞癌中的诊断价值 [J], 刘岗;宋永胜4.胰腺癌患者胰液中端粒酶活性表达及临床意义 [J], 叶远红;张安忠5.粪便肠脱落细胞端粒酶活性检测对大肠癌的早期诊断价值 [J], 徐梅华;蔡克银因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。