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植物DNA的提取与测定一、目的随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
二、原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
2．SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
不同物种的DNA提取方法摘要DNA作为遗传微粒，为生物体的遗传信息复制和传递做出了巨大的贡献，而1953年J.Watson和F.Crick提出的双螺旋结构模型不仅解释了有关DNA 的性质，而且也清楚地解释了DNA的各种生物功能，进而使DNA的研究进入到了分子水平。
然而DNA是如何具体在生物体内发挥其作用的，到现在还是一个热门课题，为了研究其作用，就需要从各种物种中提取DNA，由于不同物种结构的复杂性不同，导致提取DNA的方法也是各不相同，为此，我整理了一些物种的DNA提取方法。
关键词：物种、DNA提取1、月季DNA的提取方法：之所以提取高质量的月季DNA有难度，是因为其体内富含多糖及多酚类的物质，在一般的DNA提取方法中，很难被分离，这就严重干扰了提取月季DNA的纯度以及完整性。
为了解决这个问题，北京市园林科学研究所采取五种提取方法，在其最后的实验结果表明：Draper法提取月季DNA的纯度最高，完整性最好。
2、大麦小孢子DNA的提取方法：要想分离提取小孢子的DNA，就需要降解小孢子壁，而小孢子壁由外壁和内壁组成，内壁主要由纤维素和果胶组成，这类物质能够被相应的酶所水解，而外壁的主要成分是类胡萝卜素和类胡萝卜酯的氧化多聚化的衍生物，化学物质非常稳定，到目前为止，还没有相应的酶可以水解。
因此外壁便成为提取高质量的大麦小孢子DNA的一个“拦路虎”。
对此，莱阳农学院展开了研究，他们通过“收集大麦的花药”、“分离小孢子”、“分离小孢子”。
最后“DNA的提取”等一系列的步骤，在最后的统计结果中，发现CTAB法和微量快速提取法取得不错的效果，而且DNA的得率和质量几乎一样。
这也证明了上述两种方法是有效而可行的，当然在这个研究过程，首次采用超声波法进行破壁，收到出乎意料的效果，也为CTAB法和微量快速提取法提供了必要的条件。
所谓的CTAB，其中文名是十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
4 种快速植物基因组DNA 提取方法比较：DNA 是从2 周龄水稻幼苗中提取。
（1）煮沸法：取50 mg 新鲜水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入200 μLTE Buffer，用细玻璃棒捣碎混匀；在沸水上煮10 min，冰浴10 min；于室温下13000 r/min 离心5 min；将上清储存在-20 ℃中。
（2）微波炉法：取50 mg 水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；在700 W 家用微波炉中高热处理5 min，加入100 μL TE Buffer，振荡，13000 r/min离心 5 min；将上清液储存在－20℃。
（3）碱处理法：取50 mg 水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入配好的NaOH 提取液[(Tris-HCL) = 100 mmol/L (pH8.0)，c(NaOH) =300 mmol/L(TritonX-100)=0.3 %]用玻璃棒捣碎混匀，室温静置片刻后13000 r/min 离心3min。
4）TritonX-100 提取法：取50 mg 嫩叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入200 μL 提取缓冲液[c (Tris-HCl) = 20 mmol/L (pH8.0)，c (EDTA) =2mmol/L，c (TritonX-100) = 1.2 %]用细玻璃棒捣碎混匀；65 ℃水浴15 min，13000r/min 离心5 min，将上清储存在－20 ℃。
每个方法做三次重复，分别用上清提取液进行电泳检测。
将提取所得的基因组DNA 用 1.5 %琼脂糖电泳分析，结果表明用试剂盒提取的基因组DNA 最完整，Triton X-100 提取法所得的基因组DNA 条带也较明亮，煮沸法、微波法和碱处理法没有基因组条带。
LAMP检测结果：碱处理法和微波处理法扩增出来的条带亮度低，可能是因为微波和碱破坏了基因组的完整性。
煮沸法和Triton X-100 提取法的检测效果最好，这与提取液的成分能很好的保护基因组的完整性有关，可用于现场LAMP 检测用模板DNA的快速制备。
植物提取dna的步骤及原理以植物提取DNA的步骤及原理为标题，本文将介绍植物提取DNA 的基本步骤以及相关原理。
植物提取DNA是指从植物细胞中分离出DNA分子的过程。
植物细胞中的DNA包含了植物的遗传信息，因此提取植物DNA对于遗传研究和基因工程具有重要意义。
下面是植物提取DNA的基本步骤：步骤一：准备样品需要选择一种适合的植物样品。
可以选择新鲜的叶片、茎段或种子作为样品。
样品应该尽可能新鲜，并且避免受到污染或损伤。
步骤二：打碎细胞将样品放入冰冻细胞研磨器中，加入研磨缓冲液，并用研磨器将样品研磨成细胞悬浮液。
研磨缓冲液中的盐和洗涤剂有助于破坏细胞壁，并释放细胞内的DNA。
步骤三：溶解细胞膜将研磨后的细胞悬浮液转移到离心管中，并加入含有洗涤剂的细胞裂解液。
洗涤剂能够破坏细胞膜，使DNA从细胞中释放出来。
步骤四：沉淀DNA将细胞裂解液置于高速离心机中进行离心，离心过程中，DNA会被沉淀到离心管底部形成一个白色的沉淀物。
离心后，将上清液倒掉，只保留沉淀物。
步骤五：洗涤DNA使用75%乙醇溶液洗涤DNA沉淀物，以去除离心过程中残留的盐和洗涤剂等杂质。
洗涤后，用吸管或微量移液器将乙醇溶液完全抽尽，避免干燥过程中DNA沉淀物溶解。
步骤六：溶解DNA将洗涤后的DNA沉淀物用适量的溶解液溶解，常用的溶解液包括TE缓冲液或纯净水。
溶解后的DNA溶液可以用于后续的实验操作，如PCR扩增、酶切等。
以上就是植物提取DNA的基本步骤，下面将简要介绍相关的原理。
DNA提取的原理主要基于细胞的破坏和DNA的溶解。
在打碎细胞的过程中，使用研磨缓冲液破坏细胞壁，释放细胞内的DNA。
细胞裂解液中的洗涤剂能够破坏细胞膜，使DNA从细胞中释放出来。
离心过程中，DNA分子由于其较大的分子量而沉淀到离心管底部，而其他细胞碎片和杂质则在上清液中。
洗涤过程中使用的乙醇溶液能够去除离心过程中残留的盐和洗涤剂等杂质。
最后，将DNA沉淀物溶解在适当的溶解液中，得到DNA溶液。
植物DNA提取实验方案一、实验目的本实验旨在通过提取植物组织中的DNA，了解DNA的结构和功能，学习DNA提取技术。
二、实验原理DNA提取实验基于DNA的特性进行，主要包括以下几个步骤：1.组织破碎：通过物理或化学方法将植物组织破碎，使DNA暴露出来。
2.细胞溶解：使用细胞溶解液使细胞膜破裂，释放DNA。
3.蛋白质消化：加入蛋白酶等物质，将DNA周围的蛋白质降解。
4.DNA沉淀：通过加入乙醇等溶剂，使DNA沉淀。
5.洗涤和纯化：通过洗涤和纯化步骤去除杂质。
6.分析和测定：利用凝胶电泳等技术对提取得到的DNA进行分析和测定。
三、实验材料1.植物材料（如香蕉、草莓等）2.液氮或冰块3.细胞溶解液（如PBS缓冲液、CTAB溶液等）4.蛋白酶K溶液5.乙醇6.盐溶液7. DNase-free水8.1.5mL离心管9.离心机10.电磁振荡器11.热水浴12.紫外分光光度计四、实验步骤1.将所需植物材料切碎，放入离心管中。
2.将离心管放入液氮或冰块中，立即研磨材料，直至完全破碎。
3.加入适量的细胞溶解液，如PBS缓冲液，将混合物混合均匀。
4.将混合物置于电磁振荡器中，振荡5分钟。
5.加入适量的蛋白酶K溶液，混合均匀。
6.将离心管置于热水浴中，温度为55℃，孵育1小时。
7.加入相同体积的酒精，轻轻摇匀离心管，将DNA沉淀。
9.倒出上清液，加入适量的盐溶液，轻轻摇匀离心管，使DNA残留在离心管底部。
10.使用离心机将离心管离心，离心条件同上，离心10分钟。
11.倒出上清液，加入适量的乙醇，轻轻摇匀离心管，使DNA沉淀。
12.使用离心机将离心管离心，离心条件同上，离心10分钟。
13.倒出上清液，加入适量的盐溶液，轻轻摇匀离心管，使DNA残留在离心管底部。
14.使用离心机将离心管离心，离心条件同上，离心10分钟。
15. 倒出上清液，用DNase-free水洗涤DNA三次，每次离心5分钟。
16. 将离心管中的DNA溶解于适量的DNase-free水中。
植物dna提取实验报告植物DNA提取实验报告引言DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内的遗传物质，植物DNA提取实验是一种常见的实验方法，旨在从植物细胞中提取纯净的DNA样本。
本文将介绍植物DNA提取实验的步骤、原理和结果分析。
实验步骤1. 样本准备：选择一种植物作为实验对象，如洋葱。
将洋葱切成小块，放入离心管中备用。
2. 细胞破碎：将洋葱块加入研钵中，加入适量的提取缓冲液（含有盐和洗涤剂），用研钵和研杵将洋葱块研磨成细胞浆。
3. 过滤：将细胞浆倒入筛网中，用玻璃棒轻轻压榨，使细胞浆通过筛网，滤掉固体残渣。
4. 沉淀DNA：将过滤后的细胞浆转移到离心管中，加入冷乙醇，轻轻摇晃离心管，使DNA沉淀出来。
5. 分离DNA：使用微量移液器将DNA沉淀物转移到干燥的离心管中，加入去离子水溶解DNA。
6. 纯化DNA：使用DNA纯化试剂盒，按照说明书进行纯化步骤，去除杂质。
实验原理植物DNA提取实验的原理基于细胞破碎、DNA沉淀和纯化的过程。
首先，细胞破碎步骤使用提取缓冲液中的洗涤剂和盐的作用，破坏细胞膜和核膜，释放出细胞内的DNA。
接着，通过过滤和离心的方式，将细胞浆中的固体残渣和蛋白质去除，使DNA沉淀出来。
最后，通过纯化试剂盒中的化学试剂，去除杂质，得到纯净的DNA样本。
结果分析实验结束后，可以通过多种方式对提取的DNA进行分析。
常用的方法包括凝胶电泳、PCR扩增和测序等。
通过凝胶电泳，可以观察到DNA的带状图谱，判断DNA的大小和纯度。
PCR扩增可以使用特定引物对DNA进行扩增，进一步验证提取的DNA是否可用于后续实验。
测序则可以获得DNA的序列信息，对植物基因组进行研究。
实验注意事项1. 实验器材的消毒和无菌操作十分重要，以避免外源性DNA污染。
2. 实验过程中，尽量避免DNA的降解，注意保存条件和时间。
3. 实验中使用的试剂和溶液要严格按照说明书操作，避免误操作导致实验失败。
4. 实验室操作时要注意安全，佩戴实验手套和护目镜，避免实验物品对身体造成伤害。
实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。
吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。
反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。
生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。
植物提取dna的方法
植物提取DNA的方法通常包括以下步骤：
1. 样品收集：选择新鲜的植物组织（如叶片、根部、种子等），避免使用死亡或腐烂的组织。
2. 组织破碎：将植物组织切碎或研磨，以释放DNA。
可以使用刀片、搅拌器、搅拌器研磨器等工具。
3. 细胞破裂：将组织样品置于研磨缓冲液中，并使用低温（如液氮）或高温（如加热至95C）进行热处理，破坏细胞壁以释放DNA。
4. 清理组织混合物：将组织破碎液通过滤纸等过滤，除掉固体残渣，获得纯净的液体样品。
5. 提取DNA：使用DNA提取试剂盒或自制的DNA提取缓冲液，根据试剂盒说明书或简单的化学反应步骤，将DNA从提取液中分离出来。
6. 纯化DNA：通过酒精沉淀、洗涤和干燥等步骤，去除可能存在的杂质和污染物，提高DNA的纯度和浓度。
7. DNA定量和质量检测：使用紫外吸收光度计或荧光探针等方法，测量提取得
到的DNA的浓度和纯度，确保其适合后续实验应用。
需要注意的是，不同植物物种的DNA提取方法可能存在差异，具体步骤和试剂使用可以根据研究目的和样品特点进行调整和优化。
同样，商业化的DNA提取试剂盒也提供了一种方便和快速的方法，避免了自制试剂的繁琐操作和优化步骤。
植物DNA提取实验方案目的：1、了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。
2、掌握DNA提取的方法和步骤。
原理：提取DNA的一般原理，是将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇提取的方法去除蛋白质，得到的DNA经过乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。
用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质从而减少了蛋白质对DNA的污染。
然后用CTAB处理在特定的盐浓度下CTAB使基因组DNA处于溶解状态而蛋白质仍为沉淀。
经细胞破碎液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理其中酚是高效的蛋白变性剂可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉然后用氯仿、异戊醇处理一方面可达到去蛋白的目的另一方面还可去除残留的酚。
一、材料植物的根、茎、叶。
最好选择叶子部分做实验。
二、设备移液管，冷冻高速离心机，台式高速离心机，陶瓷研钵，1.5mL 离心管。
三、试剂1、CTAB或Nacl溶液 4.1克NaCl溶解于80ml水缓慢加入10克CTAB加水至100ml。
2、其它试剂 氯仿、异戊醇24 1酚 氯仿 异戊醇25 24 1异丙醇TE10%SDS蛋白酶K20mg/ml5mol/LNaCl。
四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干用蒸馏水洗两次然后用超纯水洗一遍吸干剪碎称0.5-0.25克。
2、将所取材料放入预冷的研钵研钵提前要灭菌研成粉末后置于7ml离心管内可以换为将样品放置到7ml离心管中800ul后用玻棒捣碎。
3、加入2.4ml65℃预热的CTAB充分混合后65℃水浴90min以上冷却到室温加入等体积氯仿异戊醇24 1轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀-20℃度放置20min4℃离心5000g×5min去上清。
提取植物dna的方法及其原理嘿，朋友们！今天咱就来聊聊提取植物 DNA 这档子事儿。
你说这植物 DNA 啊，就像是植物的小秘密宝库，藏着好多好多关于它们的信息呢！要提取植物 DNA，首先得准备好一些工具和材料。
就好像你要去挖宝藏，得有把趁手的铲子不是？咱得有新鲜的植物样本呀，这可是关键。
然后呢，还得有一些化学试剂，就像打开宝藏大门的钥匙。
那具体咋操作呢？第一步，把植物样本好好处理一下，就跟给它洗个澡似的，把杂质啥的都去掉。
然后呢，把它放到一个合适的容器里，加入那些神奇的化学试剂。
这时候啊，就好像给植物来了一场奇妙的化学反应之旅。
这原理呢，其实也不难理解。
植物细胞就像一个个小房子，DNA就住在里面。
那些化学试剂呢，就负责把房子的墙壁啊啥的打破，让DNA 能跑出来。
这就好比你要从一个坚固的城堡里把宝贝取出来，得动点小脑筋，用点小技巧才行。
接下来，经过一系列的操作，DNA 就慢慢浮现出来啦！哇，你能想象那种感觉吗？就好像你找到了藏在深处的宝贝一样惊喜。
你想想看，通过提取植物 DNA，我们能知道好多植物的秘密呢！比如它们的遗传信息，这就像是植物的“家族谱”。
我们可以了解它们是怎么一代代传承下来的，多有意思啊！而且哦，这提取植物DNA 可不只是在实验室里玩玩的。
在农业上，这可是大有用处呢！可以帮助农民伯伯们培育出更好的品种，让庄稼长得更壮，收成更多。
这不就像是给农业加了一把助力的小火箭嘛！在医学上也有它的用武之地呢！说不定能通过研究植物 DNA 找到一些治病的新方法。
哎呀呀，这可真是太神奇啦！总之呢，提取植物 DNA 就像是打开了一扇通往植物神秘世界的大门。
让我们能更深入地了解这些绿色小伙伴们。
朋友们，不妨自己也动手试试，去探索一下植物 DNA 的奇妙世界吧！怎么样，是不是很心动呀？别犹豫啦，赶紧行动起来吧！。
收稿日期:2005-07-05修回日期:2005-08-22作者简介:申丹(1985-),女,湖南邵东人,主要从事生物化学研究。
*中央级科研院所社会公益研究专项资金项目"石质岩溶山地生态综合整治技术研究与示范"(项目编号:2001D I B 10067)的部分内容。
**通讯作者。
广西科学G u a n g x i S c i e n c e s2005,12(4):340～3424种石山植物D N A 提取方法筛选*T o t a l D N AE x t r a c t i o nf r o m F o u r L i m e s t o n e P l a n t s申丹1,2,曾杰1**,周世良3,徐大平1,白嘉雨1S h e nD a n 1,2,Z e n gJ i e 1,Z h o uS h i l i a n g 3,X uD a p i n g 1,B a i J i a y u1(1.中国林业科学研究院热带林业研究所,广东广州510520;2.北京中医药大学药学院北京望京100102;3.中国科学院植物研究所系统与进化植物学开放实验室,北京香山100093)(1.R e s e a r c hI n s t i t u t e o f T r o p i c a l F o r e s t r y ,C h i n e s e A c a d e m yo f F o r e s t r y ,G u a n g z h o u ,G u a n g d o n g ,510520,C h i n a ;2.S c h o o l o f C h i n e s e Ma t e r i a Me d i c a ,B e i j i n gU n i v .o f C h i n e s e Me d i c i n e ,Wa n g j i n g ,B e i j i n g ,100102,C h i n a ;3.L a b o r a t o r yo f S y s t e m a t i c a n dE v o l u t i o n a r yB o t a n y ,I n s t i t u t e o f B o t a n y ,C h i n e s e A c a d e m yo f S c i e n c e ,X i a n g s h a n ,B e i j i n g ,100093,C h i n a)摘要:以石山木本植物掌叶木(Ha n d e l i o d e n d r o n b o d i n i e r i )、东京桐(D e u t z i a n t h u st o n k i n e n s i s )、伊桐(I t o a o r i e n t a l i s )和肥牛树(C e p h a l o m a p p a s i n e n s i s )为材料,在常用C T A B 法的基础上改良,开发出适合这4种木本植物总D N A 提取的3种方法,并将提取出的D N A 样品进行I S S R 分析,确定出提取这4种石山木本植物的总D N A 最佳方法,为研究石山木本植物的遗传多样性奠定基础。
关键词:植物D N A 提取I S S R 石山中图法分类号:Q 347文献标识码:A文章编号:1005-9164(2005)04-0340-03A b s t r a c t :G e n e t i c d i v e r s i t yo f l i m e s t o n e p l a n t s w a s l e s s r e p o r t e d i nC h i n a .I nt h i s p a p e r t h e m e t h o d s w e r e d e v e l o p e do nt h e b a s i s o f C A TB ,t oe x t r a c t t o t a l D N A f r o m y o u n gl e a v e s o f f o u r l i m e s t o n e p l a n ts p e c i e s i n c l u d i n gt w os p e c i e s i n v o l v e di nt h eR e dB o o k o fC h i n e s e P l a n t s (V o l .1)s u c ha s Ha n d e l i o d e n d r o n b o d i n i e r i a n dD e u t z i a n t h u s t o n k i n e n s i s ,a n dt w os p e c i e s w i t hh i g he c o n o m i c v a l u e s u c ha s I t o a o r i e n t a l i s a n d C e p h a l o m a p p a s i n e n s i s .T h e D N A s a m p l e s w e r e s u c c e s s f u l l y u s e d i n I S S R a n a l y s i s .T h e i m p r o v e dm e t h o d s w i l l b e u s e di ns t u d i e s o ng e n e t i c d i v e r s i t yo f t h e s e s p e c i e s i nt h e f u t u r e.K e y w o r d s :p l a n t s ,D N A ,e x t r a c t i o n ,I S S R ,l i m e s t o n e 我国石灰岩山地分布面积大,植物种类繁多,然而其遗传多样性方面的研究少见报道,仅见周厚高等[1]应用等位酶标记研究了广西石灰岩地区蜈蚣蕨(P t e r i s v i t t a t a )天然居群的遗传多样性。
随着现代分子生物学的快速发展,R A P D 、I S S R 、A F L P 以及S S R 等分子标记逐渐应用于遗传多样性研究领域,促进了植物遗传多样性研究的发展。
植物总D N A 的提取是开展这些研究的前提,我们以国家一级保护植物掌叶木(Ha n d e l i o d e n d r o n b o d i n i e r i )、二级保护植物东京桐(D e u t z i a n t h u s t o n k i n e n s i s )以及具重要经济价值的伊桐(I t o a o r i e n t a l i s )和肥牛树(C e p h a l o m a p p as i n e n s i s )等4种石山木本植物为对象,在常用C T A B(十六烷基三甲基溴化胺)法[2]的基础上设计3种D N A 提取方案,通过比较分析,确定出最佳的总D N A 提取方法,为其遗传多样性研究奠定基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1试验材料试验材料均于2004年5月采自天然林,掌叶木采于广西百色市老山林场,伊桐和东京桐采于广西木论自然保护区,肥牛树采于广西天等县。
供试样品均为嫩叶,用硅胶快速干燥。
43G u a n g x i S c i e n c e s ,V o l .12N o .4,N o v e m b e r 20051.1.2主要试剂高盐溶液:5m o l/LN a C l;1%β-巯基乙醇;1.5%P V P(聚乙烯基吡咯烷酮)40000。
提取缓冲液A:200m m o l/L T r i s-H C l p H值8.0;250m m o l/LN a C l;50m m o l/LE D T A(乙二胺四乙酸);1.5%P V P40000;1%β-巯基乙醇。
提取缓冲液B:100m m o l/LT r i s-H C l p H值8.0;20m m o l/LE D T A;1.4m o l/LN a C l;2%C T A B(十六烷基三甲基溴化胺)。
提取缓冲液C:100m m o l/L T r i s-H C l p H值8.0;25m m o l/L E D T A;1.5m o l/L N a C l;3%C T A B。
0.1×T E:10m m o l/L T r i s-H C l p H值8.0;1m m o l/LE D T A。
高盐T E:1m o l/L N a C l;10m m o l/L T r i s-H C l p H值8.0;1m m o l/LE D T A。
1.2D N A提取方法1.2.1方法一(1)取40m g干叶,加入少量石英砂,研磨成粉末后,加入1m l冰上预冷的提取缓冲液A,冰浴10m i n,7000r p m离心10m i n,弃上清液。
若上清液粘稠,用提取缓冲液A再抽提1次。
(2)加入600µl提取缓冲液C,置于65℃下温浴1 h,不时摇晃。
(3)加入等体积的C l(氯仿:异戊醇=24:1),缓慢摇动10m i n,10000r p m4℃离心10m i n,转移上清液。
若上清液浑浊,重复此步。
(4)往上清液中加入1/2体积(300µl)5m o l/LN a C l,轻轻混匀,加入2/3体积(600µl)冰冷的异丙醇,于-20℃下放置1h,缓慢颠倒析出沉淀,10000r p m离心10m i n,弃液体。
(5)加入1m l70%的酒精清洗沉淀,风干后溶于100µl的高盐T E中。
(6)加入2倍体积(200µl)冰冷的无水酒精, -20℃下放置30m i n,10000r p m离心10m i n,用70%的酒精清洗沉淀,风干后溶于100～200µl0.1×T E中。
1.2.2方法二(1)取40m g干叶片,加入少量石英砂,研磨成粉末后,加入1m l冰上预冷的高盐溶液,65℃温浴30m i n,10000r p m10m i n,弃上清液。
(2)加入100µl N a C l(5m o l/L)和600µl提取缓冲液B,65℃下温浴30m i n,加入600µl C l抽提2次。
(3)往上清液中加入2/3体积(400µl)冰冷的异丙醇,-20℃下放置1h,缓慢颠倒析出沉淀,10000r p m10m i n,弃液体。
