衣原体分泌蛋白研究进展

[收稿日期]㊀2021-02-09[修回日期]㊀2021-03-09[基金项目]㊀国家自然科学基金项目(31570179);湖南省自然科学基金项目(2020JJ4084);特殊病原体防控湖南省重点实验室资助项目(2014-5号);湖南省分子靶标新药研究协同创新中心资助项目(2015-351);湖南省重点学科资助项目(2011-76)[作者简介]㊀宋晨晨,硕士研究生,研究方向为衣原体致病机制㊁诊断及防治,E-mail 为chccso@㊂通信作者钟光明,博士,教授,硕士研究生导师,研究方向为衣原体的致病机制与疫苗,E-mail 为zhongg@㊂DOI :10.15972/ki.43-1509/r.2021.03.007㊃微生物专栏㊃生殖道衣原体质粒功能的研究进展宋晨晨1,周洲1,钟光明1,2(1.南华大学衡阳医学院病原生物学研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室,湖南省衡阳市421001;2.德州大学圣安东尼奥健康科学中心微生物免疫与分子遗传学实验室,美国德克萨斯州78229)[关键词]㊀衣原体;㊀质粒;㊀致病性;㊀生殖道[摘㊀要]㊀多数引起人类疾病的衣原体均携带质粒,大小约为7.5kb ㊂生殖道衣原体质粒含有非编码RNA 与8个开放阅读框,编码8个质粒蛋白(pGP )㊂pGP 能促进衣原体感染并调节染色体与质粒基因的表达㊂随着对生殖道衣原体与其质粒研究的不断深入,尤其是对衣原体质粒基因编辑技术的利用,人们对生殖道衣原体质粒的功能有了新的认识㊂本文对引起生殖道感染的衣原体菌株中质粒的主要功能及其潜在应用价值作一概述㊂[中图分类号]㊀R374[文献标识码]㊀AProgress on the function of Chlamydia plasmid in the reproductive tractSONG Chenchen 1,ZHOU Zhou 1,ZHONG Guangming 1,2(1.Pathogenic Biology Institute &Hunan Provincial Key Laboratory for Special Pathogens Prevention and Control ,Hengyang Medical College ,University of South China ,Hengyang ,Hunan 421001,China ;2.Department of Microbiology ,Immunology and Molecular Genetics ,University of Texas Health Science Center at San Antonio ,Texas 78229,USA )[KEY WORDS ]㊀Chlamydia;㊀plasmid;㊀pathogenicity;㊀reproductive tract[ABSTRACT ]㊀Most strains of chlamydiae carry a 7.5kb plasmid containing the non-coding RNA and encoding eight open reading frames (ORF)conventionally called plasmid glycoproteins (pGP)1-8,which can promote the chlamydial in-fection and regulate chromosome and plasmid gene expression.㊀In recent years,with the development of research on the Chlamydia and especially the editing technology of Chlamydia plasmid,people have a new understanding of the function of Chlamydia plasmid.㊀This paper briefly summarizes the main functions and potential application value of plasmid inChlamydia strains that infect the reproductive tract.㊀㊀衣原体是一种特殊的细胞内寄生的革兰阴性菌,具有双相发育周期,在细胞外表现为具有传染性的原体(elementary bodies,EB),在细胞内表现为代谢活跃的网状体(reticulate bodies,RB)[1]㊂衣原体属目前公认的有11个种[2],其感染的宿主范围广泛,能引起人类和动物的多种疾病㊂其中,沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)可引起女性感染者的宫颈炎㊁子宫内膜炎㊁盆腔炎等,感染反复迁延,引发输卵管慢性炎症,并继发管腔粘连㊁狭窄甚至闭锁,形成输卵管积水,最终导致输卵管阻塞性不孕,给广大女性和家庭带来沉重的精神压力和经济负担[3]㊂用鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)在小鼠构建生殖道感染的模型是目前研究Ct与宿主生殖道相互作用的常规方法[4]㊂这类与生殖道感染致病有关的衣原体通常包含有衣原体重要的毒力物质 质粒[5]㊂质粒除了与衣原体的毒力和致病性有关外,还对衣原体自身生长代谢㊁诱导机体免疫应答作用均具有影响㊂本文对生殖道衣原体质粒的主要功能及其潜在应用价值作一概述㊂1㊀衣原体质粒的基本特征质粒是细菌中除染色体DNA外能自主复制的DNA分子㊂衣原体的质粒为环状双链DNA,大小约为7.5kb,存在于染色体外,质粒在衣原体RB二分裂阶段能达到最多拷贝数,以便将质粒有效分配于子代衣原体中[6]㊂生殖道衣原体为非接合性质粒,不编码衣原体抗生素耐药性,且不具备整合能力[7]㊂Szabo等[8]发现,所有衣原体的祖先均携带质粒,随着时间的推移质粒会产生不同的变异㊂但是,不同衣原体的质粒,遗传相似性为69%~ 99%[7]㊂Cm与Ct感染人体的D型菌株有超过90%的基因相似性,两种衣原体质粒基因均含有非编码RNA与8个开放阅读框(open reading frame, ORF),分别编码8个质粒蛋白pGP1-8[9-10]㊂小鼠阴道接种Cm导致的生殖道感染也与Ct在女性生殖道引起的感染非常相似㊂因此,Cm的质粒功能在某种程度上可以反映Ct的质粒功能㊂2㊀衣原体质粒的致病性随着小鼠模型和质粒缺失株的应用,衣原体质粒在致病性方面的研究有了新的进展㊂Hou等[11]比较了Cm质粒缺失株与质粒携带株在BALB/c小鼠中的感染情况,发现经阴道接种Cm质粒携带株的小鼠出现输卵管积水,而接种Cm质粒缺失株的小鼠未出现明显病变;甚至将Cm质粒缺失株直接注射到小鼠输卵管内依旧不能诱发输卵管积水;同样,Ct质粒缺失株在小鼠泌尿生殖道中的感染力及毒力与质粒携带株相比也显著降低[12]㊂这些结果表明,质粒在衣原体的发病机制中发挥关键作用,可能与衣原体引发宿主炎症反应并诱发输卵管病变显著相关㊂此外,质粒在衣原体定植胃肠道时也发挥重要作用㊂Cm能够感染小鼠生殖道,然后通过血液途径传播至胃肠道,Shao等[13]发现与质粒携带株相比,Cm质粒缺失株接种小鼠生殖道后扩散并定植于胃肠道的时间明显延迟,且胃肠道的衣原体载量显著减少,甚至通过静脉接种或胃部接种也不能使Cm质粒缺失株正常定植于胃肠道,因此质粒还可能在衣原体生殖道感染向胃肠道扩散㊁定植过程中发挥重要作用㊂Ma等[14]通过将Cm质粒携带株与质粒缺失株感染小鼠胃肠道不同部位发现质粒或许能够通过不同的机制提高衣原体在肠道不同位置的适应性㊂衣原体质粒的8个ORF编码8个质粒蛋白(pGP1-8),其中pGP3是唯一的分泌蛋白㊂研究者在Cm感染的小鼠模型中发现pGP3是衣原体诱发输卵管炎症及阻塞的重要毒力因子[15-16]㊂Ramsey 等[17]也发现pGP3缺乏的Ct L2型感染小鼠生殖道后引发炎症反应的能力减弱㊂除生殖道外,Cm也能感染小鼠肠道并实现长期稳定的定植[18],文献[19-20]使用pGP3缺失的Cm经不同途径感染小鼠,发现pGP3能够使衣原体通过胃黏膜屏障从而定植于胃肠道㊂Huo等[21]在小鼠模型中发现,仅缺乏pGP3的衣原体或许能够激活肠道对衣原体传播的调控㊂在衣原体感染过程中,EB会暴露在细胞外的黏膜环境中,许多黏膜效应因子对EB具有杀伤作用,pGP3能够抑制多种效应因子的抗衣原体活性从而使子代EB安全地感染下一个宿主细胞,例如,在小鼠和非人类灵长类动物感染模型中,被感染的输卵管上皮细胞裂解的细胞质中释放的pGP3能够抑制抗菌肽对衣原体的杀伤作用,通过靶向作用于抗菌肽,破坏固有免疫从而实现衣原体的持续性感染㊂该结果证明pGP3对衣原体有效免疫逃逸,并在宿主建立持续性感染中至关重要[22-24]㊂Ct 能够通过多种机制调控宿主细胞死亡的信号通路,以确保完成自身生长周期,例如,Lei等[25]发现Ct 的pGP3或许能够上调高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)的表达调控线粒体的自噬与凋亡,从而调控细胞凋亡㊂Zou等[26]发现PI3K/AKT介导的MDM2-p53通路的激活在抵抗Ct感染引起的细胞凋亡中发挥重要作用,而Ct的pGP3能够作用于该通路从而抑制HeLa细胞凋亡㊂Song等[9]发现,pGP4是pgp3与多种染色体基因的转录调控因子,包括糖原合成酶基因glgA㊂由于pGP4缺失导致pgp3等多种基因表达改变,因此很难确定pGP4除了调控表达外的其他功能㊂细胞实验中发现质粒缺失的Ct L2血清型刺激宿主产生炎症因子的能力降低,但不能确定该性状的出现是由于缺失pGP3或者pGP4的结果[27]㊂此外,拥有质粒的衣原体能够向邻近细胞扩散,而无质粒的L2血清型衣原体只能产生滞留在细胞内的包涵体㊂该性状可能是由于pGP4的缺失造成[28]㊂Zhang 等[29]发现pGP4能够通过作用于EUO调控衣原体RB到EB的转变,从而调控衣原体转录过程㊂缺失pGP5的Ct L2血清型不会明显影响其受质粒调控的染色体基因的表达,将Cm的pgp5基因敲除或替换为mCherry基因,导致受质粒调控的基因表达显著增高,包括tc0319,tc0181,tc0419,tc0420,tc042以及tc0357[30]㊂这些结果表明pGP5可能是Cm的负转录调控因子,而这些基因受到pGP4的正向调节㊂过去研究者认为pGP8对于质粒的维持有重要作用[9]㊂Gong等[31]发现质粒在L2型的Ct中依然维持稳定,证实维持质粒所必需的是pgp8基因序列而不是pGP8蛋白㊂此外,pgp8基因还编码一种反义小RNA,命名为sRNA-2㊂在所有Ct质粒ORF 中,sRNA-2的表达最为丰富,表明sRNA-2在调节pgp8中发挥重要作用[32]㊂pGP7的缺失在Ct L2型和Cm中都没有引起任何显著差异㊂此外,pGP7缺失的Cm诱导的输卵管积水与Cm质粒完整株诱导的输卵管积水同样严重㊂因此,pgp7缺失的衣原体可以作为致病机理研究的对照菌株㊂另外,由于pgp1㊁pgp2或pgp6基因的缺失会导致质粒的维持功能受到影响,因此难以评价它们在衣原体致病性中的作用[31]㊂3㊀质粒对衣原体生长周期的影响质粒能够通过调节染色体基因的表达从而影响衣原体的生长周期㊂Skilton等[33]通过比较携带质粒与无质粒的Cm在McCoy细胞中的生长性状及包涵体形态,证实了质粒缺失是影响衣原体生长及其染色体基因复制的重要原因㊂Gong等[31]发现Ct 和Cm质粒可调节衣原体多个染色体基因的转录, Ct质粒缺失导致糖原合成基因表达下降,使包涵体缺乏对于衣原体生存具有重要意义的糖原积累,表明质粒可能通过调控基因表达影响衣原体生长㊂Yang等[34]构建了质粒pGP1-8基因缺失的Ct L2型转化株,通过进行空斑形成实验和衣原体释放抑制实验发现衣原体空斑形成能力依赖于pGP4,通过pGP4调控F肌动蛋白的解聚促进衣原体释放,从而启动新的感染周期,最终引起空斑形成㊂4㊀衣原体质粒的应用价值研究者通过动物实验发现,无质粒衣原体菌株可作为潜在的衣原体减毒活疫苗,预防衣原体感染引起的病变[31]㊂O Connell等[35]利用小鼠模型对Cm质粒缺失株的免疫保护作用进行了检测,发现接种了Cm质粒缺失株的小鼠未发生生殖道病变,且再次感染野毒株时,小鼠产生了相应的保护性免疫㊂以Ct L2型的质粒缺失株阴道感染小鼠,发现其在小鼠体内诱导了针对衣原体的保护性免疫,该作用不会引起小鼠输卵管病变,且小鼠再次感染衣原体野毒株时阴道感染载量显著降低[36]㊂以上结果均证明无质粒衣原体菌株有望发展为有效的减毒活疫苗㊂此外,将质粒编码的免疫优势抗原pGP3免疫小鼠后,可使小鼠产生保护性免疫[17]㊂人血清抗体通过pGP3的三聚体结构识别该蛋白,该结构由一个C端结构域㊁一个N端结构域以及一个三螺旋中间结构域(pGP3m)组成,该结构可能使pGP3在衣原体引起的免疫应答中发挥重要作用,使得pGP3或许能够成为潜在的衣原体疫苗[37]㊂5㊀总㊀结质粒是否含有与表型有关的功能基因决定了质粒的功能㊂衣原体质粒编码多种毒力因子,同时也调节衣原体染色体中基因的表达,使得质粒在衣原体中发挥着关键的作用,促进衣原体以更好的生存优势和抗胁迫能力应对外界环境㊂对质粒ORF 功能的进一步研究不仅能够促进对衣原体致病机制的了解,更能加速衣原体疫苗研究的进展㊂随着衣原体生物学和各种基因工程技术的发展,人们将更加全面深入地了解衣原体致病的分子机制,从而使生殖道衣原体的质粒在其疫苗研制及应用中发挥更大的效益,并研制出衣原体感染的靶向治疗方法,更好地造福人类健康㊂[参考文献][1]COSSÉM M,HAYWARD R D,SUBTIL A.One face of chlamydia trachomatis:the infectious elementary body[J].Curr Top Microbiol Immunol,2018,412:35-58.[2]CHEN J,ZHANG H,ZHOU Z,et al.Chlamydial induction of hydrosalpinx in11strains of mice reveals multiple host mechanisms for preventing upper genital tract pathology[J].PLoS One,2014,9 (4):e95076.[3]AHAMADI M H,MIRSALEHIAN A,BAHADOR A.Association of chlamydia trachomatis with infertility and clinical manifestations:a 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收稿日期:2006-09-04;修回日期:2006-10-30基金项目:国家自然科学基金课题,N o .30500369作者简介:刘光桥(1981-),男,硕士研究生,研究方向为军事预防医学细菌检验专业。

衣原体多形态膜蛋白研究进展刘光桥综述;朱虹审校(军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京 100071)摘 要:衣原体全基因组序列分析发现编码多形态膜蛋白(P oly m orph i c m e mbrane pro te i ns ,Pm ps)基因家族,Pm ps 与衣原体的感染和免疫机制相关。

本文就衣原体Pm ps 基因组和氨基酸序列、在细胞中的位置以及结构和功能的研究进展进行了综述。

关键词:衣原体;多形态膜蛋白中图分类号:R 374文献标识码:A文章编号:1005-5673(2007)01-0069-04衣原体全基因组测序的完成,为人们认识这一病原体的发生、进化和可能的致病机制,以及对其与典型的革兰氏阴性细菌(G -)的异同提供了线索,之后的研究重点主要集中在衣原体细胞膜。

衣原体细胞膜的结构与其它G -细菌相似,由脂多糖(Lipopolysacchar i d e ,LPS)、外膜、内膜和周浆间隙组成,但在其分子组成上有所不同,如衣原体LPS 的o -侧链比其它G -细菌短,末端分子组成是3-deoxy -D -m anno -octulosn ic aci d ,而衣原体生活周期中所出现的原体(E le m entary body ,EB)和网状体(Re -ticulate body ,RB )两种不同形态,其LPS 和外膜蛋白成分几乎没有差异。

衣原体全基因组序列分析的重大成果之一是发现编码多形态膜蛋白(Poly m orphic m e m brane pro -teins,Pm ps)基因家族的存在。

已发现鹦鹉热嗜衣原体(C hlam ydoph ila p sittaci ,Cps)至少有6个基因编码Pm p90和Pm p98蛋白家族,肺炎嗜衣原体(Ch lam ydoph ila p neum on iae ,Cpn )有21个基因编码P m p1~Pm p21,沙眼衣原体(C hlam yd iatracho m a tis ,C t)有9个基因编码PmpA ~P m p H,其中Pm pD(Cpn 的Pm p21也称为P m pD )引起了人们广泛关注。

衣原体分泌蛋白的研究阐述=“news_bd”>衣原体根据组织嗜性和导致各种疾病分成不同类型，与人类密切相关的衣原体主要包括肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体。

虽然是不同的衣原体类型，但其有相似的基因组序列和独特的发育周期。

衣原体在形态学和生理学表现出两相发育周期。

整个周期从具有传染性的原体(elementarybody，EB)开始的，原体进入易感细胞后，在细胞膜包绕形成的空泡即吞噬体中逐渐发育，体积增大进入增殖状态，形成始体(reticulate body，RB)。

始体经二分裂方式繁殖出众多子代，形成致密的包涵体。

始体在包涵体内逐渐成熟为子代原体，然后从破坏的感染细胞中释出，再感染新的易感细胞，开始新的发育周期。

每个发育周期约为48～72小时，整个周期即从原体-始体-原体的过程。

衣原体与宿主细胞间的相互作用对于研究衣原体的致病机制是重要的。

研究发现，衣原体分泌蛋白通过三型分泌系统(type 3secretion system，T3SS)或者其他分泌系统如二型分泌系统(type2secretion system，T2SS)进入到宿主细胞胞浆、衣原体包涵体膜、包涵体内腔。

有些分泌蛋白对衣原体EB侵入宿主细胞有重要的作用，同样对EB在细胞内存活有重要的作用。

有些分泌蛋白能够促进细胞内衣原体的存活与复制，并为EB侵入新细胞提供基础。

本文对衣原体与宿主间相互作用的过程中，一些起到作用的分泌蛋白作一综述。

1包涵体膜蛋白(Incs)衣原体包涵体膜蛋白由衣原体基因编码，表达在包涵体膜上的蛋白质，其在感染期间表达，定位于包涵体膜上，是衣原体特有的蛋白质。

包涵体膜蛋白呈现了衣原体基因组的7-10%，其主要有两个特征：一个N末端能编码三型分泌信号区域和一个C末端至少包含两个跨膜螺旋的亲水区域，Incs的N末端和C末端区域暴露在宿主细胞浆。

当RB形成时，衣原体能够产生一些新合成的分泌蛋白，这些新合成的分泌蛋白通过III型分泌系统(T3SS)分泌产生，此包括包涵体膜蛋白。

衣原体肺炎的免疫学研究及疫苗开发进展报告衣原体肺炎是由衣原体感染引起的一种呼吸道感染性疾病。

它是目前全球范围内最常见的肺炎病原体之一，严重影响了公共卫生领域。

近年来，对衣原体肺炎的免疫学研究及疫苗开发取得了显著进展。

本文将对这方面的研究进展进行综述。

一、衣原体肺炎的病原学及流行状况衣原体肺炎是由衣原体感染引起的呼吸道感染疾病，常表现为咳嗽、喉咙痛、胸痛等症状，严重时可导致肺炎等严重后果。

此病常见于年轻人和老年人，尤其是免疫功能低下者。

根据世界卫生组织的统计数据，每年约有数百万人因衣原体肺炎导致的死亡，尤以发展中国家为甚。

二、衣原体肺炎的免疫学研究进展免疫学研究是衣原体肺炎疫苗开发的重要基础。

在过去的几十年中，研究人员对衣原体肺炎的感染机制、免疫反应及免疫保护作用进行了广泛而深入的研究。

首先研究者发现，衣原体感染后会引起机体免疫系统的应答，包括产生抗体和细胞免疫反应。

特别是测定衣原体特异性抗体可以用于诊断和治疗衣原体肺炎，这为疫苗研发提供了参考。

其次，对衣原体的免疫保护作用进行了深入研究，发现免疫系统的参与和激活对于抵御衣原体感染具有重要作用。

此外，也有研究人员针对衣原体的蛋白质进行了研究，探索其在免疫保护中的作用。

三、衣原体肺炎疫苗的研究和开发进展疫苗的研发对于预防和控制衣原体肺炎具有重要意义。

研究者主要从四个方面进行了疫苗的研究和开发：基于衣原体蛋白质的疫苗、基于多糖的疫苗、基于基因工程技术的疫苗和新型疫苗佐剂的研究。

四、基于衣原体蛋白质的疫苗基于衣原体蛋白质的疫苗是最为常见的一类疫苗。

研究者通过提取、纯化或重组衣原体的蛋白质，制备成疫苗。

这类疫苗能够诱导机体免疫系统产生特异性抗体，从而提高机体对衣原体的免疫保护能力。

一些研究表明，这类疫苗在实验室动物中具有一定的保护效果，但在临床试验中仍需进行更多的研究。

五、基于多糖的疫苗多糖疫苗是另一种重要的疫苗策略。

通过将衣原体的多糖制备成疫苗，可以诱导机体产生多糖特异性抗体，增强机体对衣原体的免疫保护作用。