SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。

二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。

它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。

通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。

2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。

3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。

4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。

5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。

打开电源，调整电流和电压，开始电泳。

6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。

7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。

通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。

此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。

实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。

二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。

三、试剂和器材（一）试剂1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。

2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。

18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。

6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

4. 10%SDS，室温保存。

5. 两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。

Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。

生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。

2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。

最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。

实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。

实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

实验 6 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；掌握垂直板电泳的操作方法；运用SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。

实验原理1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。

根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。

2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：㏒10Mr = －b·m R+ K（式中：Mr为蛋白质分子量，m R为相对迁移率，b为斜率，K为截距。

在条件一定时，b 和K均为常数。

）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

实验步骤1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。

将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。

（夹子离梳子底边约2mm）2. 制备分离胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。

项目分离胶的配制（10ml）30% 丙烯酰胺（ml） 3.4分离胶缓冲液，pH8.8（ml） 2.4H2O （ml） 4.110% 过硫酸铵（ml）0.1TEMED（μl）10凝胶液的灌注和聚合：将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加乙醇。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。

二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。

在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。

这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。

蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。

然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。

三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。

2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。

3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。

4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。

5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。

首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。

6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。

一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。

四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。

条带的颜色越深，表示其含量越多。

通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。

五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。

相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。

通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。