纤维素酶酶活的测定方法

实验8 纤维素酶活力测定

一、目的要求

（1）学习并了解生物化学实验的基本过程与基本方法，培养发现问题、解决问题的能力，

养成科学实验的良好习惯。

（2）学习并了解纤维素酶的基本特性，学习酶活力测定的方法。 （3）学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法。

（4）学习实验方案的制定与调整、数据的处理及实验报告的撰写。 二、实验基本要求

1．根据相关资料，提出实验方案

实验前，根据有关资料，了解该酶的基本特性、酶活力测定的基本原则与要求，拟订初步实验

方案，包括实验原理，实验的步骤及目的等。 2．修订实验方案

提出实验方案，经过老师修改后，确定最终的实验方案，并开始进行实验。具体任务是：制作

还原糖—吸光度的标准曲线；测定样品中的纤维素酶活力。 3．数据处理与实验报告

根据实验测定的结果，采用计算机分析处理有关实验数据，并利用计算机绘制标准曲线，计算

相关系数（r），利用回归方程计算获得实验结果。最后将整个实验过程（包括实验设计、实验操作、结果分析等过程）以实验报告形式呈交。 三、主要内容

提出实验设计，制作还原糖—吸光度的标准曲线； 测定不同底物时的纤维素酶活力。 四、参考资料——纤维素酶活性检测方法介绍

（一）原理 纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能

将纤维素彻底水解。1950 年 Reese提出了 C1-Cx概念。C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶

区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。再由Cx最终催化形成还原性单糖。而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，

EC3.2.1.4，简称 EG)。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）

即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称 CBH）。这类酶作用于β-1,4-糖苷键，

蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准 SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。

纤维素酶DNS酶活力测定方法

DNS, 活力, 纤维素酶, 测定

1 定义

1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。

2 原理

纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。

3.试剂和溶液

3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）

3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液

取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。

3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）

4仪器和设备

4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)

4.2分光光度计

含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。

5测定步骤

5.1 标准曲线绘制

分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

酸碱滴定法测酶活力计算公式

纤维素酶是一种多组分酶， 包含C1 酶、 CX 酶和¦Â-葡萄糖苷酶三种首要组分。 其间C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素持续水解成纤维寡糖，¦Â-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等复原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）复原，生成棕赤色的氨基化合物，在540nm

波长处有最大光吸收， 在必定范围内复原糖的量与反响液的色彩强度呈比例关系， 运用比色法测定其复原糖生成的量就可测定纤维素酶的生机。 更多这方面的内容生物帮上面有的，分子生物学的运用果胶酶生机测定 4.2.1 原理 果胶酶水解果胶,生成半乳糖醛酸。半乳糖醛酸具有复原性糖醛基,可用次亚碘酸法定量测定,以此来表明果胶酶的活性。 4.2.2 试剂和溶液 a.果胶粉(Sigma公司出品)

10g/L水溶液 称取果胶粉1.0000g,精确至0.0002g,加水溶解,煮沸,冷却。如有不溶物则需进行过滤。pH至3.5,用水定容至100ml,在冰箱中储存备用。运用时间不超越三天; b.硫代硫酸钠规范溶液c(Na2S2O3)=0.05mol/L 按GB 601配制与标定 0.1mol/L溶液。运用时精确稀释一倍; c.碳酸钠溶液c(1/2Na2CO3)=1mol/L 按GB 601配制; d.碘规范溶液c(1/2I2)=0.1mol/L 按GB 601配制与标定,储存于棕色瓶中; e.硫酸溶液c(1/2H2SO4)=2mol/L 取浓硫酸(d=1.84)5.6ml,缓慢参加适量水中,冷却后用水定容至100ml,摇匀; f.可溶性淀粉指示液(10g/L) 按GB 603配制; g.0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5) 甲液 称取柠檬酸(C6H8O7·H2O)21.01g,用水溶解并定容至1000mL; 乙液 称取柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)29.41g,用水溶解并定容至1000ml; 取甲液140ml、乙液60ml,混匀,缓冲液的pH应为3.5(用pH计调试)。 4.2.3 仪器 a.比色管 25ml; b.恒温水浴 50±0.2℃; c.容量瓶 25ml、50ml、100ml、200ml、250ml; d.碘量瓶 250ml; e.吸管 1ml、5ml; f.滴定管 25ml。

土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）

一、原理

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

二、试剂

1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g

KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯

2）葡萄糖标准液（1mg/mL）

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。

三、操作步骤

（1）标准曲线绘制

分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

（2）土壤蔗糖酶测定 称取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml DNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。）