纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定

1.纤维素酶活力单位定义

在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.

2.测定原理

纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.

3.试剂与溶液

除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.

3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:

称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.

3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:

吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.

3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:

称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.

3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:

称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.

3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:

称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.

3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v) 称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.

3.7 DNS试剂

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.

4 仪器与设备

4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.

4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).

4.3 分析天平:感量0.001g.

4.4 pH计:精确至0.01.

4.5 磁力搅拌器:附加热功能.

4.6 电磁振荡器.

4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.

4.8 离心机:2000g以上.

4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.

4.10 秒表:每小时误差不超过5s.

4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.

4.12 移掖器;精度为1l.

5 标准曲线的绘制

吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.

分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.

分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.

以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.

6 试样溶液的制备

固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).

称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).

液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.

7 测定步骤

吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.

吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.

吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.

吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.

8.试样酶活力的计算

[(AE - AB)×K + CO]

XD = × 1000 (1)

M×t

式(1)中:

XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;

AE —酶反应液的吸光度;

AB —酶空白样的吸光度;

K —标准曲线的斜率;

CO —标准曲线的截距;

M —葡萄糖的分子量(180.2);

t —酶解反应时间,min;

1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.

XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.

X = XD?Df (2)

式(2)中:

X —试样纤维素酶的活力,u/g;

Df —试样的总稀释倍数.

酶活力的计算值保留三位有效数字.

9 重复性

同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)

换成其他的酶的话，基本的一样，只是底物不一样而已

初始酶活（initial activity）是相对于酶的稳定性研究中测定的活性（residentialactivity）的名称。实验中，初始酶活即酶学研究中的酶活力，对于纤维素酶而言，是比活力。

离子液体中纤维素酶初始酶活的测定方法为：10mL离子液体中，加入100mg纤维素酶，形成均一的体系。立即取出0.2mL离子液体/纤维素酶混合液于20mL刻度试管，加入1.8mL CMC溶液。按照缓冲液中酶活力的测定方法步骤，测定还原糖的生成量。

实验中纤维素酶的稳定性通过在离子液体中长时间培养纤维素酶后

测定酶活表征，此时的酶活称为剩余酶活（residential activity）。100mg 纤维素酶分散在10mL离子液体中，形成均一体系后，置于全温振荡培养箱中培养，温度50℃，转速100rpm。间隔一定时间，取出酶样，

按照前述缓冲液中酶活的测定方法，测定还原糖产量。实验中观察了七天中的剩余酶活变化。

脂肪酶的固定化

将30mg/ml的脂肪酶-磷酸盐溶液（100mM，pH 7.0，配制方法同2.2.3）置于离心管中，向试管中逐滴加入不同种类的沉淀剂于4℃下缓慢震荡2h后，加入50μl戊二醛，于25℃下继续震荡反应2h。将混合物离心10min（5000rpm），去掉上清液，将沉淀用相应的溶剂清洗（当有机溶剂做沉淀剂时用相应的有机溶剂清洗；盐或聚合物做沉淀剂时用去离子水清洗）直到上清中不再检测到任何的活力。最终得到的沉淀冷冻干燥并于4℃保存，即获得脂肪酶的交联聚集体（CLEA-PSL）。

我们选择能得到较好交联聚集体的丙酮和硫酸铵作为沉淀剂，对其固定化条件分别进行了优化。