DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
试管号 1 2 3 4 5 6
1mg/ml葡萄糖标准液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
蒸馏水量/ml 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
葡萄糖浓度/mg/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
PH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
DNS试剂/ml 3 3 3
3 3 3
沸水浴7min后快速冷却加入蒸馏水/ml 5 5 5 5 5 5
530nm比色。
2、酶活测定方法：
管号 空白管0 样品管1 样品管2
酶液/ml 0.5 0.5 0.5
沸水灭活10min
1%CMC-Na/ml 1.5 1.5 1.5
45℃下反应30min，沸水灭活10min
DNS试剂/ml 3 3 3
沸水浴中7min显色快速冷却后
蒸馏水/ml 5 5 5
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：TnkODmlU10001)/(酶活力
n：稀释倍数；
K：曲线斜率；
T：反应时间，min；
1000：mg换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
y = 0.56x - 0.0087R2 = 0.9976-0.100.10.20.30.40.50.600.20.40.60.811.2系列1线性 (系列1)
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
浓度
mg/ml 吸光值 总酶活（10ml） 单位
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【实验目的】
1、 学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法
2、 巩固使用分光光度计
【实验材料】
1、3、5—二硝基水杨酸显色液；
2、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；
3、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）。
【实验步骤】
1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至25ml。在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线（见表一）。
2、空白管的测定：取1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。
3、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液，冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25毫升，混匀，550nm测OD值（见表二）。
实验结果：见表一、表二：
表一 标准曲线的测定
管号 0 1 2 3 4 5
葡萄糖/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
显色液/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水至25mL word专业资料-可复制编辑-欢迎下载
A(550) 0.000 0.135 0.294 0.456 0.605 0.727
表二 样品的测定
编号 空白 样品一 样品二 样品三
酶液/mL 1(失活) 1 1 1
纤维素酶酶活测定
纤维素酶活测定方法
一、原理
纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义
纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂
羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）
50mmol NaAC-HAC、DNS试剂
三、实验仪器
容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平
四、标准曲线的绘制
五、酶活测定
由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol
NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备
CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：
取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。混匀测OD540nm。
空白对照用酶活的酶液作对照。
一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法
一、概述
羧甲基纤维素酶（carboxymethylcellulase，CMCase）是一种重要的木质素酶，它可以将木质素分解为更小体积的产物，从而可促进木质素利用。因此，测定CMCase活性对于研究木质素加工过程和利用资源至关重要。
二、试剂
①P-nitrophenyl 葡糖苷（PNPG）：20 mg/ml;
②NaHCO3：0.1 mol/L;
③Tris-HCl buffer：50 mmol/L, pH 7.2;
④凝胶分离 Buffer：30 mmol/L Tris-HCl，1.5 mmol/L EDTA，10
mmol/L Na2SO4，pH=7.2
三、实验步骤
1.溶质处理：将木质素细胞壁材料（包括原料和残渣）用凝胶分离buffer缓慢搅拌，直至得到悬浮液。
2.仪器设置：将悬浮液100 μL加入定量瓶中，并加入足量的Tris-HCl缓冲液（50 mL）。然后安装溶解度仪，并调节机器的参数，使水温调节在28-30℃，波速调节在400 Hz左右，进行10min的研磨处理。
3.测定：将研磨后的悬浮液取出，加入0.1mol/L NaHCO3 10 ml和P-nitrophenyl 葡糖苷 （100 μL），搅拌均匀，测定其吸光度，以425nm波长，示定测定CMCase活性。
4.计算：根据吸光度值计算CMCase活性：CMCase活性（U/ml）=A/B，其中A为PNPG测定液的吸光度，B为研磨后悬浮液的吸光度。
四、安全措施
1.实验时应戴好实验手套，操作时要注意卫生。
2.羧甲基纤维素酶属于酶分类，易挥发，操作时应尽量避免空气污染。
3.在实验室进行实验时，应注意实验室温度和湿度，使实验条件尽量达到推荐的实验要求。 4.搅拌完毕后，实验材料用大量水冲洗，然后再投入污水处理系统处理。
五、结论
本实验介绍了一种简便、高效的羧甲基纤维素酶活性测定方法，建立的方法可以准确、灵敏地测定羧甲基纤维素酶活性，可广泛应用于木质素加工过程和资源利用的研究中。
