WB试剂配制

WB 实验步骤1 组织蛋白裂解（使用试剂盒：索莱宝高效RIPA 组织细胞裂解液，SIb-R0010；PMSF ） 使用方法：按照说明书，每25mg 组织样本+300uL RIPA+3uL PMSF ,放置于tube 中，使用剪刀剪碎，匀浆机匀浆，离心（4℃，15000 r ，20-30,min ），取上清。

2 蛋白定量（试剂盒：碧云天G250染色液，P0006-1） （1）在96孔板上进行加样。

第一列 第二列（2）加入200ul G250考马斯亮蓝，静置五分钟，使用酶标仪检测。

（3）酶标仪选定，检测吸光设置：波长是595nm ，3-5。

Shaking 设置：duration10s.(4) 根据标准曲线求出蛋白浓度，所有样本的蛋白使用DDW 稀释到同一浓度后与Lane Marker Loading Buffer/5x 蛋白示踪上样缓冲液/还原混合（混合比列按照说明书确定），混匀，掌上离心机离心。

（5）100℃水浴加热8min ，室温放置，冷却后使用或者-20℃储存待用。

3 制胶根据蛋白大小选择分离胶浓度 胶浓度大小 6% 8% 10% 12% 成分 H2O 5.3ml 4.6ml 3.9ml 3.3ml 30%丙烯酰胺 2ml 2.7ml 3.4ml 4.0ml 1.5M Tris 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%SDS 100ul 100ul 100ul 100ul 10%APS100ul100ul100ul100ulDDW(高压灭菌双蒸水) BSA(蛋白标准品) DDW 裂解后的蛋白 孔1 20ul 0ul 5ul 15ul 2 19ul 1ul 5ul 15ul 3 18ul 2ul 5ul 15ul 4 16ul 4ul 5ul 15ul 5 12ul 8ul 5ul 15u[ 6 8ul 12ul 5ul 15ul 7 4ul 16ul 5ul 15ul 80ul20ul5ul15ulTEMED 6ul 6ul 6ul 6ul浓缩胶4%H2O 2ml30%丙烯酰胺0.5ml1.5M TRIS 0.5ml10%SDS 40ul10%APS 30ulTEMED 4ul总体积3ml4 电泳，低电压80V跑至marker分离，后改成大电压（100-120V）电泳液Running bufferTris 3.03g甘氨酸18.77gSDS 1.0gDDW 1000ml5转膜：大电压100V，转膜蛋白是40KD以上蛋白，转膜时间（1.0胶）40min-50min；小电压90V，转膜蛋白小蛋白。

W B试剂配制5X电泳液缓冲液1X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）15.1g Tris（MW121.14） 3.02 g
甘氨酸（MW75.07）94g 甘氨酸（MW75.07）18.8g
SDS 5.00g SDS 1.00g
蒸馏水至1000ml 蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍
10X转膜缓冲液1X转膜缓冲液(采用) 甘氨酸（MW75.07）151.1g 甘氨酸（MW75.07） 2.9 g
Tris（MW121.14）30.3g Tris（MW121.14） 5.8 g
蒸馏水至1000ml SDS 0.37g
溶解后室温保存,用时稀释10倍，浓盐酸 1.8 ml
并加入甲醇至20%。

蒸馏水至800ml
通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，加甲醇200ml定容至1000ml
最加160ml甲醇，配制成800ml即
可。

（先加甲醇易产生沉淀）
10XTBS缓冲液1XTBST缓冲液
Tris（MW121.14）24.2g 10x TBS缓冲液100ml
NaCl 80.0g 蒸馏水900ml
KCl 2g Tween-20 1 ml
蒸馏水至1000ml Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取
枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。

（浓HCl调pH至7.6），混匀室温保存。

封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
1XTBST缓冲液95-100 ml
脱脂奶粉5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。

动物组织wb实验步骤
动物组织Western blot实验步骤如下：
1.样品制备：将动物组织放入2 ml的离心管中，加入1 mlPBS后放入组织研磨仪中研磨1min，离心，去除PBS。

再用1mlPBS洗涤一次，离心（12000 r，10 min）弃去PBS（冰上操作）。

2.配制1mL RIPA裂解液（0.99RIPA+0.01PMSF），加入0.5-1ml的预冷的RIPA裂解液（0.1 g组织以1:10加入含PMSF/RIPA），再放入组织研磨仪中研磨3-5次，使细胞完全破碎，然后将离心管冰浴15min，每隔5min涡旋混合仪振荡30s，保证细胞完全裂解。

3.充分裂解后，12000g，4℃离心10min，将上清液转移到新的1.5ml的离心管中，即得组织总蛋白产物。

4.产物中可加入20%的甘油，保存于-20℃~-80℃。

5.注意事项：再转移上清液时不要吸入底部的沉淀并尽可能取完全上清液。

如裂解液未加入蛋白酶抑制剂，需自行加入蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲基磺酰氟，剧毒），取适量的裂解液，再使用前数分钟加入PMSF，使其浓度为1Mm/L=0.17419g/L。

裂解蛋白的所有步骤均需要再冰上操作或4℃进行。

也可购买相关蛋白提取试剂盒按照说明书进行蛋白提取，提取变性蛋白使用国产品牌即可，如果要保持天然蛋白活性的提取，建议还是购买进口品牌。

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。

4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。

4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。

可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。

临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。

收取磷酸化WB样品的步骤操作：Western细胞裂解液使用RIPA，使用前加入（1:100）PMSF，leupeptin（1:1000），钒酸钠（1:100）以及其它蛋白酶抑制剂。

例：1mLRIPA，10μLPMSF，1μL leupeptin，10μL钒酸钠用4℃预冷的PBS漂洗细胞3次，加入裂解液（160μL）冰上裂解15min。

随后刮取细胞转移至1.5mL EP管中，冰上裂解20min，12,000rpm离心10min，取上清加入5×SDS（40μL）上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中煮沸10min。

剩余样品冻存-20℃冰箱备用。

非磷酸化收样细胞裂解液里1:100加入PMSF。

细胞洗3次，加1mL PBS，刮到离心管里，5000rpm 4℃离心10min，弃净上清，细胞可以冻于-80℃。

加120μL裂解液（1:100加PMSF），冰上裂解30min（或裂解10min后超声），12000rpm离心10min，取上清加入5×SDS（30μL）上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中煮沸10min。

细胞裂解液配方1% Triton X-100,150 mM sodium chloride, (NaCl)20 mM sodium fluoride, (氟化钠)20 mM sodium pyrophosphate,（焦磷酸钠）20 mM Tris–HCl(pH 8.0)1 mM EDTA,1 mM EGTA,1 mM benzamidine,（苯甲脒）1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, （苯甲基磺酰氟，PMSF）0.5Ag/ml leupeptin, （亮抑酶肽）1 mM sodium orthovanadate，（原钒酸钠）可以分为A液和B液体，A液用RIPA代替，B液包括：1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, （苯甲基磺酰氟，PMSF），0.5Ag/ml leupeptin, （亮抑酶肽），1 mM sodium orthovanadate，（原钒酸钠）。

10％分离胶一块板两块板三块板四块板8%分离胶总体积（ml）6101521总体积（ml）15 dd水 2.44 5.98.3dd水 6.9 30％聚丙烯酰胺 1.98 3.35 6.9830％聚丙烯酰胺4 1.5mol/ltris-Hcl 1.5 2.5 3.8 5.3 1.5mol/ltris-Hcl 3.8 10％SDS60μL0.10.150.2110％SDS0.15 10％AP60μL0.10.150.2110％AP0.15 TEMED 2.4μL4μL6μL8.4μL TEMED6μL 5%浓缩胶两块板四块板六块板12%分离胶总体积（ml）51015总体积（ml）5 dd水 2.85 5.78.55dd水 1.6 30％聚丙烯酰胺0.8 1.6 2.430％聚丙烯酰胺2 0.5mol/ltris-Hcl 1.25 2.5 3.75 1.5mol/ltris-Hcl 1.3 10％SDS50μL0.10.1510％SDS50μL 10％AP50μL0.10.1510％AP50μL TEMED2μL4μL6μL TEMED5μL 封闭液奶粉5%抗体稀释液TBS溶液TBST溶液奶粉5g BSA 1g氯化钠8g16g1LTBS中加入1ml吐温TTBS100ml TBST 20ml氯化钾0.2g0.4gTris3g6gdd水1000ml2000mlHcl PH调7.410乘电泳液转膜缓冲液Tris30.3g Tris 4.545g 3.03g甘氨酸187.7g甘氨酸21.6g14.4g10%SDS10g+100ml甲醇300ml200mldd水定容1000ml dd水1500ml1000ml1.5mol/L Tris.Hcl 1.0mol/L Tris.HclTris45.43g Tris30.29g dd水200ml dd水200ml浓盐酸调PH至8.8，水定容至250ml 浓盐酸调PH至7.5，定容至250ml，高温灭菌0.5mol/L Tris.HclTris15.14g10%SDSdd水200ml SDS10g 浓盐酸调PH至6.8，水定容至250ml dd水100ml 10%AP过硫酸铵0.1g上样缓冲液dd水1ml 0.5mol/L Tris-Hcl 2.5ml 二硫苏糖醇0.39g SDS0.5g 溴酚蓝0.025g 甘油 2.5ml。

电泳缓冲液（10x）：Tris-Hcl：30.2gGly：187.7gSDS:10g定容至1L,稀释成1x：100ml电泳缓冲液（10x）+900ml单蒸水电转缓冲液1x：Tris-Hcl：3.03gGly：14.4dH2O：900ml100ml：甲醇，定容至1LTBS(10x，1L)Tris-Hcl：12.1gNacl：87.7g调节pH至7.6，用时稀释10倍，加1ml Tween 20，即：TBST=100ml（10x TBS）+900ml dH2O+1ml Tween 20容量为1L5x SDS-page蛋白凝胶上样缓冲液（10ml）1M Tris-Hcl：0.6ml10% SDS：2ml甘油：2.5mlBeta-巯基乙醇：0.5ml溴酚蓝：0.01g(先溶于4.4ml水中)ddH2O:4.4mlWestern blot样品制备以及蛋白质定量1. 取冰，将4°C离心机提前降温。

2. 将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。

3. 弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。

4. 视细胞量的多少加入细胞裂解液。

（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。

PMSF常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。

）5. 冰上裂解30min每隔10min震荡一次，离心：4°C，12000rpm，10min。

或者用超声裂解仪裂解蛋白。

6. 小心将上清转移至新EP管，记下吸取的量。

如：100μL。

7. 将收集好的蛋白保存与—20°C。

（可长期保存）蛋白质定量配置BCA工作液：根据BSA 标准品和待测样品的数量，将试剂A 和试剂B 以50：1 的体积比混匀。

Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。

4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。

4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。

可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。

临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。