WB试剂配制

WB 实验步骤1 组织蛋白裂解（使用试剂盒：索莱宝高效RIPA 组织细胞裂解液，SIb-R0010；PMSF ） 使用方法：按照说明书，每25mg 组织样本+300uL RIPA+3uL PMSF ,放置于tube 中，使用剪刀剪碎，匀浆机匀浆，离心（4℃，15000 r ，20-30,min ），取上清。

2 蛋白定量（试剂盒：碧云天G250染色液，P0006-1） （1）在96孔板上进行加样。

第一列 第二列（2）加入200ul G250考马斯亮蓝，静置五分钟，使用酶标仪检测。

（3）酶标仪选定，检测吸光设置：波长是595nm ，3-5。

Shaking 设置：duration10s.(4) 根据标准曲线求出蛋白浓度，所有样本的蛋白使用DDW 稀释到同一浓度后与Lane Marker Loading Buffer/5x 蛋白示踪上样缓冲液/还原混合（混合比列按照说明书确定），混匀，掌上离心机离心。

（5）100℃水浴加热8min ，室温放置，冷却后使用或者-20℃储存待用。

3 制胶根据蛋白大小选择分离胶浓度 胶浓度大小 6% 8% 10% 12% 成分 H2O 5.3ml 4.6ml 3.9ml 3.3ml 30%丙烯酰胺 2ml 2.7ml 3.4ml 4.0ml 1.5M Tris 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%SDS 100ul 100ul 100ul 100ul 10%APS100ul100ul100ul100ulDDW(高压灭菌双蒸水) BSA(蛋白标准品) DDW 裂解后的蛋白 孔1 20ul 0ul 5ul 15ul 2 19ul 1ul 5ul 15ul 3 18ul 2ul 5ul 15ul 4 16ul 4ul 5ul 15ul 5 12ul 8ul 5ul 15u[ 6 8ul 12ul 5ul 15ul 7 4ul 16ul 5ul 15ul 80ul20ul5ul15ulTEMED 6ul 6ul 6ul 6ul浓缩胶4%H2O 2ml30%丙烯酰胺0.5ml1.5M TRIS 0.5ml10%SDS 40ul10%APS 30ulTEMED 4ul总体积3ml4 电泳，低电压80V跑至marker分离，后改成大电压（100-120V）电泳液Running bufferTris 3.03g甘氨酸18.77gSDS 1.0gDDW 1000ml5转膜：大电压100V，转膜蛋白是40KD以上蛋白，转膜时间（1.0胶）40min-50min；小电压90V，转膜蛋白小蛋白。

W B试剂配制5X电泳液缓冲液1X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）15.1g Tris（MW121.14） 3.02 g
甘氨酸（MW75.07）94g 甘氨酸（MW75.07）18.8g
SDS 5.00g SDS 1.00g
蒸馏水至1000ml 蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍
10X转膜缓冲液1X转膜缓冲液(采用) 甘氨酸（MW75.07）151.1g 甘氨酸（MW75.07） 2.9 g
Tris（MW121.14）30.3g Tris（MW121.14） 5.8 g
蒸馏水至1000ml SDS 0.37g
溶解后室温保存,用时稀释10倍，浓盐酸 1.8 ml
并加入甲醇至20%。

蒸馏水至800ml
通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，加甲醇200ml定容至1000ml
最加160ml甲醇，配制成800ml即
可。

（先加甲醇易产生沉淀）
10XTBS缓冲液1XTBST缓冲液
Tris（MW121.14）24.2g 10x TBS缓冲液100ml
NaCl 80.0g 蒸馏水900ml
KCl 2g Tween-20 1 ml
蒸馏水至1000ml Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取
枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。

（浓HCl调pH至7.6），混匀室温保存。

封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
1XTBST缓冲液95-100 ml
脱脂奶粉5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。

动物组织wb实验步骤
动物组织Western blot实验步骤如下：
1.样品制备：将动物组织放入2 ml的离心管中，加入1 mlPBS后放入组织研磨仪中研磨1min，离心，去除PBS。

再用1mlPBS洗涤一次，离心（12000 r，10 min）弃去PBS（冰上操作）。

2.配制1mL RIPA裂解液（0.99RIPA+0.01PMSF），加入0.5-1ml的预冷的RIPA裂解液（0.1 g组织以1:10加入含PMSF/RIPA），再放入组织研磨仪中研磨3-5次，使细胞完全破碎，然后将离心管冰浴15min，每隔5min涡旋混合仪振荡30s，保证细胞完全裂解。

3.充分裂解后，12000g，4℃离心10min，将上清液转移到新的1.5ml的离心管中，即得组织总蛋白产物。

4.产物中可加入20%的甘油，保存于-20℃~-80℃。

5.注意事项：再转移上清液时不要吸入底部的沉淀并尽可能取完全上清液。

如裂解液未加入蛋白酶抑制剂，需自行加入蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲基磺酰氟，剧毒），取适量的裂解液，再使用前数分钟加入PMSF，使其浓度为1Mm/L=0.17419g/L。

裂解蛋白的所有步骤均需要再冰上操作或4℃进行。

也可购买相关蛋白提取试剂盒按照说明书进行蛋白提取，提取变性蛋白使用国产品牌即可，如果要保持天然蛋白活性的提取，建议还是购买进口品牌。

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。

4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。

4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。

可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。

临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。

收取磷酸化WB样品的步骤操作：Western细胞裂解液使用RIPA，使用前加入（1:100）PMSF，leupeptin（1:1000），钒酸钠（1:100）以及其它蛋白酶抑制剂。

例：1mLRIPA，10μLPMSF，1μL leupeptin，10μL钒酸钠用4℃预冷的PBS漂洗细胞3次，加入裂解液（160μL）冰上裂解15min。

随后刮取细胞转移至1.5mL EP管中，冰上裂解20min，12,000rpm离心10min，取上清加入5×SDS（40μL）上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中煮沸10min。

剩余样品冻存-20℃冰箱备用。

非磷酸化收样细胞裂解液里1:100加入PMSF。

细胞洗3次，加1mL PBS，刮到离心管里，5000rpm 4℃离心10min，弃净上清，细胞可以冻于-80℃。

加120μL裂解液（1:100加PMSF），冰上裂解30min（或裂解10min后超声），12000rpm离心10min，取上清加入5×SDS（30μL）上样缓冲液，混匀后置于沸水浴中煮沸10min。

细胞裂解液配方1% Triton X-100,150 mM sodium chloride, (NaCl)20 mM sodium fluoride, (氟化钠)20 mM sodium pyrophosphate,（焦磷酸钠）20 mM Tris–HCl(pH 8.0)1 mM EDTA,1 mM EGTA,1 mM benzamidine,（苯甲脒）1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, （苯甲基磺酰氟，PMSF）0.5Ag/ml leupeptin, （亮抑酶肽）1 mM sodium orthovanadate，（原钒酸钠）可以分为A液和B液体，A液用RIPA代替，B液包括：1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, （苯甲基磺酰氟，PMSF），0.5Ag/ml leupeptin, （亮抑酶肽），1 mM sodium orthovanadate，（原钒酸钠）。

10％分离胶一块板两块板三块板四块板8%分离胶总体积（ml）6101521总体积（ml）15 dd水 2.44 5.98.3dd水 6.9 30％聚丙烯酰胺 1.98 3.35 6.9830％聚丙烯酰胺4 1.5mol/ltris-Hcl 1.5 2.5 3.8 5.3 1.5mol/ltris-Hcl 3.8 10％SDS60μL0.10.150.2110％SDS0.15 10％AP60μL0.10.150.2110％AP0.15 TEMED 2.4μL4μL6μL8.4μL TEMED6μL 5%浓缩胶两块板四块板六块板12%分离胶总体积（ml）51015总体积（ml）5 dd水 2.85 5.78.55dd水 1.6 30％聚丙烯酰胺0.8 1.6 2.430％聚丙烯酰胺2 0.5mol/ltris-Hcl 1.25 2.5 3.75 1.5mol/ltris-Hcl 1.3 10％SDS50μL0.10.1510％SDS50μL 10％AP50μL0.10.1510％AP50μL TEMED2μL4μL6μL TEMED5μL 封闭液奶粉5%抗体稀释液TBS溶液TBST溶液奶粉5g BSA 1g氯化钠8g16g1LTBS中加入1ml吐温TTBS100ml TBST 20ml氯化钾0.2g0.4gTris3g6gdd水1000ml2000mlHcl PH调7.410乘电泳液转膜缓冲液Tris30.3g Tris 4.545g 3.03g甘氨酸187.7g甘氨酸21.6g14.4g10%SDS10g+100ml甲醇300ml200mldd水定容1000ml dd水1500ml1000ml1.5mol/L Tris.Hcl 1.0mol/L Tris.HclTris45.43g Tris30.29g dd水200ml dd水200ml浓盐酸调PH至8.8，水定容至250ml 浓盐酸调PH至7.5，定容至250ml，高温灭菌0.5mol/L Tris.HclTris15.14g10%SDSdd水200ml SDS10g 浓盐酸调PH至6.8，水定容至250ml dd水100ml 10%AP过硫酸铵0.1g上样缓冲液dd水1ml 0.5mol/L Tris-Hcl 2.5ml 二硫苏糖醇0.39g SDS0.5g 溴酚蓝0.025g 甘油 2.5ml。

电泳缓冲液（10x）：Tris-Hcl：30.2gGly：187.7gSDS:10g定容至1L,稀释成1x：100ml电泳缓冲液（10x）+900ml单蒸水电转缓冲液1x：Tris-Hcl：3.03gGly：14.4dH2O：900ml100ml：甲醇，定容至1LTBS(10x，1L)Tris-Hcl：12.1gNacl：87.7g调节pH至7.6，用时稀释10倍，加1ml Tween 20，即：TBST=100ml（10x TBS）+900ml dH2O+1ml Tween 20容量为1L5x SDS-page蛋白凝胶上样缓冲液（10ml）1M Tris-Hcl：0.6ml10% SDS：2ml甘油：2.5mlBeta-巯基乙醇：0.5ml溴酚蓝：0.01g(先溶于4.4ml水中)ddH2O:4.4mlWestern blot样品制备以及蛋白质定量1. 取冰，将4°C离心机提前降温。

2. 将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。

3. 弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。

4. 视细胞量的多少加入细胞裂解液。

（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。

PMSF常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。

）5. 冰上裂解30min每隔10min震荡一次，离心：4°C，12000rpm，10min。

或者用超声裂解仪裂解蛋白。

6. 小心将上清转移至新EP管，记下吸取的量。

如：100μL。

7. 将收集好的蛋白保存与—20°C。

（可长期保存）蛋白质定量配置BCA工作液：根据BSA 标准品和待测样品的数量，将试剂A 和试剂B 以50：1 的体积比混匀。

Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。

4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。

4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。

可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。

临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。

WB实验步骤Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。

2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。

于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。

3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。

（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。

6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。

2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。

a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。

（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。

⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。

Westernblot常用试剂配制Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．用浓盐酸调节pH值至8.8。

4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。

注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。

（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。

丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。

5．于棕色瓶中4 oC保存。

注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。

聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。

Western blot 步骤1、SDS聚丙烯酰胺凝胶配制：1. 准备好1mm的厚玻璃板以及薄玻璃板各一块，洗净、烘干，将两块板的、侧面、底部分别对齐后放入固定架，垂直夹在制胶架上。

2. 配制分离胶，以配制一块10%的分离胶为例（可根据分子量大小选择所需的分离胶，分子量越大，分离胶浓度越小，反之亦然）。

用移液枪取水1.9mL，30%丙烯酰胺1.7mL，Tris 8.81.3mL，10%SDS 50uL，10%AP 50uL，TEMED 2uL（TEMED为促凝剂，一旦加入要快速混匀，进行以下步骤）充分混匀后，迅速注入两块玻璃板之间，大约4.5~5mL即可，要留出浓缩胶所需空间（梳子齿长再加0.5cm）。

随后立即用水均匀压平分离胶，水层约2cm，防止空气进入产生气泡。

3. 大约20min后，观察分离胶与水层之间出现明显分界线后，就表示分离胶已经凝固。

倾倒水层，用纸巾擦干，准备好梳子备用（根据实验选择10孔或15孔的梳子，并且梳子规格要为1mm，与厚玻璃板对应）。

4. 5%浓缩胶的配制，也以一块胶为例，用移液枪取水1.35mL，30%丙烯酰胺335uL，Tris 6.8 250uL，10%；SDS 20uL，10%AP20uL，TEMED 3uL，充分混匀后注入玻璃板中分离胶上，插入梳子，待凝固即可。

2、SDS-PAGE电泳1. 电泳缓冲液配制：甘氨酸18.9g，Tris-base 3.02g，SDS1g，纯水定容到1000mL即可。

2. 将配好的胶板固定在电泳槽中，加入电泳液，确定不漏液后垂直拔掉梳子，加入蛋白样品和marker。

3. 样品加好后，盖好电泳槽盖子，红色接触器对红色，黑色对黑色。

通上电源，电压80V跑电泳20min左右，至浓缩胶loading跑平，marker分离开，暂停仪器，加压到120V，跑电泳40min左右，使loading跑到胶的底部即可。

3、转膜1. 电转缓冲液的配制：甘氨酸14.42g，Tris-base 3.02g，10%SDS2mL，纯水600mL，甲醇200mL，调节PH到8.2~8.3加水到定容到1000mL即可。

1.1 40% Bis-acrylamide with2.6% C （Acrylamide:Bis, 38.95:1.05）acrylamide 77.9gBis-acry 2.1gTotal 200ml1.2 30%胶溶液:Bis-acry 0.8gacrylamide 29.2gtotal 100ml1.3 3M TrisHCl , pH 8.4536.3g TrisbaseTotal 100ml1.4 WG ( water + Glycerol):Water: 58mlGlycerol: 36mlTotal: 94ml1.5 10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3Trisbase 60.5gTricine 89.5gSDS 5gtotal 500ml1.6 10% SDSSDS 10gTotal 100ml1.7 2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8:0.25M Tris 15.14g0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDStotal 500ml1.8 transfer buffer25mM Tris 3g192mM glycine 14.4g40% methanol 400mlTotal 1000ml1.9 TBST10mM Tris-HCl, pH7.4100mM NaCl0.2% Tween-20Total 1000mlAll recipes are designed for 1.5mm gel1.1 做分离胶，加水封胶，待其凝固。

1.2 去除封胶水，做间隙胶，加水封胶，待其凝固。

1.3 去除封胶水，做浓缩胶，插梳子。

1.4 待浓缩胶凝固后，拔掉梳子，并将架子转移到电泳槽中，先在中部加入1x Electrophoresis Buffer pH8.3，点样。

1.5 调节电压到60v,开始电泳，一小时后电压升至120v。

实验基本步骤提取细胞蛋白↓BCA定量↓制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）↓蛋白样品变性↓电泳↓转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓二抗↓TBST洗涤↓显影↓结果分析试剂配制1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾 0.24g磷酸氢二钠 1.44g氯化钠 8g氯化钾 0.2g加入500ml纯水，调PH=7.2定容至1L,高压蒸汽灭菌2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0.25ml吐温-203.电转液500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷4.电泳液（1X）10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水5.TBS6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-207.封闭液TBST1X+5%奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热WB实验一、蛋白样品制备准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。

用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，8000r离心5min，然后弃去上清。

重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后，于4℃下12000 rpm离心5 min。

7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。

二、蛋白含量的测定（BCA定量）准备：96孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），50mlEP管，1xPBS，BSA标准液1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液（Running buffer）5×5×Tris—甘氨酸电泳缓冲液:15。

1g Tris碱和72ｇ甘氨酸,5ｇ电泳级的SDS,双蒸水定容至1L，pH值为8。

3.使用前,将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液（Sending buffer)（现用现配)必须新鲜配置,因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310％SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS，C12H25O4NaS)溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制,50-68度搅拌溶解,浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris。

HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存.5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配.4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

6 10×TBS （Tris—buffered saline）的配置加HCl调pH到7。

6,室温储存。

7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液(loading buffer）的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。

8 0。

5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6。

4ml,10％SDS 12。

8ml，巯基乙醇3。

2ml，0。

05%溴酚蓝1。

6ml，H2O 32ml混匀备用.按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20—25ul，总蛋白量100μg。

9 stacking gel buffer （4×)10 5×Sample buffer （10ml）11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% （w/v）nonfat dried milk 或者1％BSA0.01％antifoam A （Sigma）0。