第三讲----神经干细胞(2014)

神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。

文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。

此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。

根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。

基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。

本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。

二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。

（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。

神经系统疾病的干细胞治疗 【神经干细胞】 神经干细胞(neuralstemcell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。需要强调的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。 【神经干细胞的分类】 1.根据分化潜能分类。 (1) 神经管上皮细胞。 (2) 放射状胶质神经元。 (3) 神经母细胞。 (4) 神经前体细胞。 2.根据部位分类。 神经嵴干细胞和中枢神经干细胞(CNS-SC)。 【神经干细胞移植的方法】 1、通过静脉注射移植。 2、通过椎管注射移植。 3、通过介入方法直接移植到病变部位动脉血管。 【相关研究】 干细胞具有自我更新和多向分化的生物学特性,在生理或病理情况下能维持组织器官内环境的稳定,近年被广泛用于再生医学的研究。 1.干细胞治疗进展的研究 王裕, 王任直对神经系统疾病的干细胞治疗进展进行了研究。方法:通过Pubmed数据库检索有关干细胞治疗神经系统疾病的相关文献。检索词为“stem cells、Nervous system diseases、therapy”。初检得到298篇文献,最终保留54篇符合标准的文献进行分析。结果与结论:经过近些年的研究,干细胞被认为是神经损伤和变性疾病的一个很有前景的治疗手段。通过干细胞的移植,取代受损的神经细胞,促进受损神经网络的恢复从而重建神经功能。 2.干细胞治疗神经系统哪些疾病的研究。 由于神经组织是分裂期后终末未分化组织,损伤后不能再生。近年来研究表明,脑组织有自我修复的潜能；可塑性是中枢神经系统的一个重要特征。神经干细胞(NSC)作为神经系统自我修复的细胞学基础,已成为中枢神经系统疾病和损伤修复的研究焦点。目前,胚胎NSC已用于Pakinson病、缺血性脑血管病、肿瘤等的治疗,但面临着伦理、来源、免疫排斥等多方面的问题。而骨髓基质细胞(BMSC)在一定程度上弥补了这一不足。 3.诱导多能干细胞的研究进展。 诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是由日本学者Yamanaka等最先利用逆转录病毒载体将Oct4、Sox-2、c-Myc、Klf4这4种转录因子基因导入鼠皮肤成纤维细胞,使其重编转化为具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)形态、功能及基因表达特征的一类新的干细胞。这种通过对成熟体细胞进行人为改造得到的干细胞家族新成员,不仅改变了传统干细胞来源的局限性,同时也避免了其他类型干细胞诸如伦理学、排异反应等诸多困扰,使iPSCs在细胞移植、疾病模型制作、疾病机制研究、药物筛选等领域具有其他干细胞难以替代的优势。近年来,将iPSCs应用于神经疾病,诸如神经变性病、肌病、癫痫、脑血管病等的发病机制及治疗研究已成为干细胞研究领域最活跃的组成部分。

神经干细胞的生物学特性与临床应用神经干细胞是一类未分化的细胞，具有自我更新、增殖和分化为神经元或支持细胞的能力。

它们可以在发生损伤或疾病的情况下，再生和修复组织。

神经干细胞的生物学特性和临床应用已成为研究热点，本文将从不同角度探讨这个话题。

一、神经干细胞的来源神经干细胞的来源主要有两种：胚胎干细胞和成体干细胞。

胚胎干细胞又称为内源性干细胞，是来自早期胚胎的细胞，可以分化为三大胚层的全部细胞类型。

成体干细胞又称为外源性干细胞，分布于成体器官或组织的干细胞池中，可以分化为该器官或组织的细胞类型。

近年来发现，神经干细胞还存在于其他的成体组织中，如骨髓、脂肪组织、嗅粘膜、脑膜等。

二、神经干细胞的特性1. 自我更新与不定增殖神经干细胞具有自我更新和不定增殖的能力。

自我更新是指细胞通过对自身分裂产生相同类型的干细胞，以维持干细胞系统的完整性。

不定增殖是指神经干细胞在体外条件下，可以无限制地分裂增殖。

这些特性使得神经干细胞成为组织再生和治疗的理想来源。

2. 复杂的分化潜能神经干细胞具有复杂的分化能力，可以分化为多种组织器官和细胞类型。

特别是在神经系统中，神经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等，可以修复中枢神经系统和周围神经系统的损伤。

3. 丰富的分泌能力神经干细胞具有丰富的分泌能力，可以释放多种细胞因子和基质分子，参与细胞增殖、分化和迁移等过程，促进治疗效果。

此外，神经干细胞分泌的神经营养因子可以保护神经元免受损伤。

三、神经干细胞的临床应用1. 外周神经损伤的治疗神经干细胞可以分化为支持细胞如胶质细胞，可以与神经元形成复合体，从而修复外周神经的损伤。

研究表明，将神经干细胞移植到受损神经的切口，可以促进神经再生和重建神经肌肉接头。

2. 中枢神经系统损伤的治疗中枢神经系统损伤通常是不可逆的，神经干细胞移植可能是重建神经损伤的新途径。

神经干细胞可以分化为神经元和星形胶质细胞，可以释放神经营养因子，促进神经元的生存和生长。

神经干细胞的培养一、神经干细胞的分离和传代无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μｌ。

待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μｌ。

此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。

二、BrdU标记将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。

三、神经干细胞的诱导分化选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。

另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。

四、条件培养液的制备取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。

五、神经干细胞的定向诱导分化将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChAT免疫细胞化学染色。

六、免疫细胞化学染色培养细胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分别行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫细胞化学染色，用DAB和H2O2作为呈色剂，阳性着色为棕黄色。

神经干细胞是指具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。

神经干细胞的标记物，包括Nestin、PSA-NCAM、p75神经营养R(NTR) 、Mu-sashi1等。

①NestinNestin是一种中间丝蛋白Ⅵ,它主要表达在中枢神经系统干细胞,在几乎所有成熟CNS细胞上均不表达。

Nestin作为标记物已经广泛应用在识别神经系统发育中和体外细胞培养中的CNS干细胞。

然而Nestin在CNS 干细胞生物学上的作用尚不明确。

Nestin在体外并不形成中间丝。

它的短暂表达已经证明是神经分化途径的关键一步。

Nestin 有时也在非神经干细胞群表达,例如胰岛祖细胞及造血祖细胞。

②PSA-NCAM(唾液酸-神经细胞粘附分子)脑的神经细胞粘附分子(NCAM) 亚型的调节性表达是神经发育过程的关键所在。

NCAM的胚胎型(PSA-NCAM) 主要在发育中的神经系统表达。

PSA-NCAM可能同突触的重排和可塑性相关。

在成年人PSA-NCAM 表达被限制在维持可塑性的地区。

高表达PSA-NCAM 的神经元-限制性前体可以自我更新和分化为多种神经细胞表型。

PSA-NCAM+新生脑前体细胞被限制在向神经胶质方向发展,甲状腺激素可以调控其向少突神经胶质细胞发展。

唾液酸变性作用极大地降低了NCAM粘附性，因此，也有人认为PSA-NCAM是作为单一的抗粘附分子来调节大脑可塑性发展中的细胞-细胞相互作用。

越来越多的证据表明，PSA-NCAM 和一些信号分子相互作用，在脑的发育中起指导性作用。

③p75神经营养R(NTR)p75NTR也称作低亲合力神经生长因子(NGF)受体，是属于肿瘤坏死因子受体超家族的一类跨膜蛋白。

它同等地结合NGF、BDNF、NT23和NT4(低亲合力) 。

当被Trk活化时,p75NTR 增加对神经亲和力的反应。

在神经系统发育过程中TrkC受体和p75NTR 起着重要作用。

神经系统发育和神经干细胞神经系统的发育是一个极其复杂和精细的过程，其涉及到大量的细胞、分子和信号通路的协调。

在这个过程中，神经干细胞（neural stem cell）发挥了关键的作用，它们是神经系统发育的基石。

神经干细胞是一种具有自我更新和分化潜能的细胞，它们能够产生神经元、神经胶质细胞以及部分其他细胞类型。

神经干细胞在早期的神经系统形成中起着决定性的作用。

它们既能够不断自我更新，同时也能按需分化，以满足组织发育和修复的需要。

神经干细胞主要存在于神经系统的特定区域，如脑室壁和髓鞘周围等处。

它们主要来源于胚胎发育过程中的神经诱导，也可以在成年时期产生。

在成年人中，神经干细胞主要存在于大脑、脊髓以及周围神经系统中。

这些成年神经干细胞能够不断产生新的神经元和神经胶质细胞，以补充损失的细胞或增加神经系统的适应能力。

在正常的神经系统发育过程中，神经干细胞受到许多调控因素的影响。

这些调控因素包括各种生长因子、激素、细胞外基质、神经递质以及内在的遗传因素。

这些因素能够直接或间接地影响神经干细胞的增殖、分化、迁移和成熟，进而影响神经系统的形成和发育。

神经干细胞的发育过程通常可以分为两个阶段。

第一阶段是增殖和扩张阶段，即神经干细胞不断分裂，产生大量的后代细胞，并逐步形成神经发生的祖细胞。

这个阶段的关键调节是保持神经干细胞的自我更新和扩张能力，同时控制其分化方向，以保证足够数量和不同类型的神经元和神经胶质细胞的形成。

第二阶段是分化和成熟阶段。

在这个阶段中，神经发生的祖细胞会接受各种信号的影响，分化成为不同类型的神经元和神经胶质细胞，并逐步成熟。

这个阶段的关键调节是控制神经细胞的分化方向和细胞功能的稳定，以确保神经系统的正常功能。

神经干细胞因其自我更新和分化潜能而成为治疗神经退行性疾病和神经系统损伤的重要细胞来源。

近年来，关于神经干细胞的研究发展迅速，相关技术也逐渐成熟。

例如，神经干细胞的体外培养、分化和移植技术已经开始应用于临床实践中。