腐烂茎线虫热激蛋白新基因的克隆与序列分析

文章编号:1000-1573(2007)05-0079-05腐烂茎线虫不同地理种群IT S 区序列比对及系统发育王金成1, 季 镭2, 黄国明1, 杨秀丽1, 林茂松2(1.天津出入境检验检疫局,天津300456; 2.南京农业大学植病系,江苏南京210095)摘要:为弄清我国腐烂茎线虫(Ditylenchus destr uctor )不同地理种群IT S(I nternal transcr ibed spacer)区之间的碱基差异及系统发育关系,本研究通过网络软件Clustalw 1.83对腐烂茎线虫的核糖体I T S 区核酸序列进行了比对,结果发现腐烂茎线虫的8个种群中,DEll 、DEly 、DEAY987007三个种群(I 组)内部之间的碱基差异在1%以内,其它的5个种群(II 组)之间的差异为0~1%,而I 组与I I 组种群之间的差异达到了15%(根据IT S1+ 5.8s +IT S2序列)或20%(根据IT S1+IT S2序列)。

这说明我国腐烂茎线虫很可能是1个复合种。

根据IT S 区核酸序列构建的系统发育图同样显示,我国腐烂茎线虫的7个地理种群明显分为2个分支A 和B 。

关 键 词:腐烂茎线虫;鳞球茎茎线虫;食菌茎线虫;IT S(Inter nal transcribed spacer);系统发育关系中图分类号:S 435.621.2+9文献标识码:AAlignments of rDNA -ITS sequences and phylogeny of differentgeo populations of Ditylenchus destructor in ChinaWAN G Jin cheng 1,JI Lei 2,HU ANG Gu o ming 1,YAN G Xiu li 1,LIN Mao song 2(1.T ianjin Entr y-Exit Inspection and Quar antine Bureau,T ianjin 300456,China;2.Dept.of Plant P atholog y,N anjing A gricultural U niversity ,N anjing 210095,China)Abstract :The IT S sequences of 8populations of sw eet potato stem nematode,Ditylenchus destr uctor ,w ere analyzed.The pair-w ise divergences for IT S1+ITS2sequences and IT S1+5.8s +IT S2sequences of 3populations (group I),DEll,DEly and DEAY987007,are w ithin 1%.T he pair-w ise divergence w ithin other 5populations (group II),DEjl,DEsg ,DEws,DEw y,DEhblf,varied from 0~1%.However,the divergence betw een group I and group II is 15%for ITS1+5 8s+ITS2sequences or 20%for ITS1+IT S2sequences.T he MP analysis divided the 8above-mentioned populations into tw o clades.The clade B includes DEll,DEly and DEAY987007(group I),and the other 5populations in group II belong to clade A.Key words:Ditylenchus destr uctor ; D.dip saci; D.myceliop hagus;ITS (Internal Transcribed Spacer);phy logenetic relationships收稿日期:2006-11-10基金项目:天津自然科学基金资助项目(05YF JM JC10800)作者简介:王金成(1978-),男,山东潍坊人,硕士,农艺师,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:goldcit ywang @yahoo.通讯作者:林茂松(1948-),男,江苏徐州人,博士,教授,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:linms@第30卷第5期2007年9月河北农业大学学报JOURNAL OF AGRICULT URAL UNIVERSIT Y OF H EBE IVol.30No.5Sep .2007腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为农业上重要病原线虫,也是我国重要的植物检疫性有害生物。

细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析徐梦飞;卢平萍;马勋;张艳艳;王炜烨;孟季蒙;王正荣;薄新文【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2018(027)012【摘要】旨在分析并预测细粒棘球绦虫锌指蛋白(Echinococcus granulosus zinc finger peotein,Eg-ZFP)结构、功能及其在细粒棘球绦虫发育过程中的表达模式,预测其在细粒棘球绦虫防治中潜在的作用.通过对前期细粒棘球绦虫原头蚴(protoscolex,PSC)转录组高通量测序结果中Unigene进行筛选,克隆Eg-ZFP基因并进行序列分析,实时荧光定量PCR(Reahime fluorescence quantitative PCR,qPCR)分析Eg-ZFP在原头蚴及成虫中的表达特征,利用全量组织原位杂交(Whole mount in situ hybridization,WISH)检测该蛋白mRNA在原头蚴和成虫组织中的分布情况.结果显示,细粒棘球绦虫Eg-ZFP基因的CDS序列长852 bp,具有完整的开放阅读框(852 bp),编码283个氨基酸,预测表明Eg-ZFP分子质量大小及等电点为31.6 ku和8.89;qPCR检测发现,Eg-ZFP在原头蚴及成虫阶段均有表达,且在成虫阶段表达量高;全量组织原位杂交检测结果表明,Eg-ZFP mRNA在原头蚴及成虫中分布广泛,且在成虫的生殖系统中丰度较高,提示Eg-ZFP与虫体生殖发育有关.结果表明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫发育过程中具有重要作用,为进一步研究Eg-ZFP在E.granulosus防治中的作用奠定基础.【总页数】9页(P1707-1715)【作者】徐梦飞;卢平萍;马勋;张艳艳;王炜烨;孟季蒙;王正荣;薄新文【作者单位】石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】S855.9【相关文献】1.细粒棘球绦虫EgM123基因序列分析及EgM家族基因在虫体不同发育阶段的差异表达分析 [J], 毛丽萍;王正荣;王伟;魏玉圆;翟少华;甘尚权;简子健2.红铃虫性信息素合成激活肽基因克隆、序列特征及在不同发育阶段的表达分析[J], 许冬;王玲;丛胜波;王金涛;李文静;万鹏3.细粒棘球绦虫脂肪酸去饱和酶1基因序列及不同发育阶段表达分析 [J], 徐梦飞;卢平萍;马勋;张艳艳;王炜烨;孟季蒙;王正荣;薄新文4.小麦锌指蛋白基因的克隆、序列与表达分析(英文) [J], 万平;令利军;周文娟;张文俊;凌宏清;朱立煌;张相岐5.新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析 [J], 林仁勇;丁剑冰;温浩;张文宝;李君;卢晓梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析狄婷婷;高原;聂鑫【摘要】To understand the genetic variation of cytolysin activator(CylA) gene in Enterococcus faecalis , 2 pairs of specific primers were designed and synthesized according to the CylA gene sequence from GenBank for the 4 clinical isolates causing goose septicemia. The CylA gene was cloned into pMD18-T vector, and the recomfainant plasmid was screened to sequence and compared with the CylA genes of 4 pathogenic Enterococcus faecalis from patients in foreign countries and pigs in China respectively. The homology was alignmented and phylogenetic tree was reconstructed with Lasergene 7. 0. Result showed that CylA genes of 4 strains from goose were average 1 239bp in average, where was a completed open reading frame encoding 412 amino acids. No deletion and insertion in sequences, while only one nonsense mutation did not cause the variation of amino acid. There was not much variation in the remaining 8 strains of CylA gene and the deduced amino acids. The amino acids deduced by these CylA genes of 4 strains from goose shared 100 % homology. They were also close to the amino acids deduced by CylA genes of bacteria from patients in foreign countries and pigs in China, sharing the homologies of 98. 6% to 100%. These results indicate that CylA gene in Enterococcus faecalis is highly conserved, which is likely to become the target genes of detection and diagnosis as well as immunoprophylaxis.%目的了解粪肠球菌溶血素激活因子(CylA)基因的遗传变异情况.方法根据GenBank上已发表的粪肠球菌CylA基因序列设计2对特异性引物,对临床分离的4株致鹅败血症粪肠球菌CylA基因进行克隆及序列测定,并与国外从人体分离的和国内从猪体分离的各4株致病性粪肠球菌的CylA基因,用LaSergene 7.0软件进行同源性比对和构建系统进化发育树.结果鹅源4株茵CylA基因均长1 239bp,有1个完整的开放阅读框,编码412个氨基酸；序列中无缺失和插入,仅有l处未引起其编码氨基酸变异的无义突变.其余8株菌CylA基因及推导的氨基酸变异程度均不大.4株鹅源菌CylA基因推导的氨基酸同源性为100％；与国外人源菌和国内猪源菌CylA基因推导的氨基酸遗传距离也较近,同源性为98.6％～100％.结论粪肠球菌CylA基因高度保守,有可能成为检测诊断和免疫预防的靶基因.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)007【总页数】6页(P683-688)【关键词】鹅;粪肠球菌;溶血素激活因子;克隆;同源性比对;系统进化发育树【作者】狄婷婷;高原;聂鑫【作者单位】内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042【正文语种】中文【中图分类】R378肠球菌引起医院内病人感染和死亡的例数正在逐步增加［1］，其致病菌主要是粪肠球菌［2－3］。

水稻二化螟小分子量热激蛋白21.3基因的克隆和表达分析宋杰;于同英;崔亚东;陆明星;杜予州【期刊名称】《环境昆虫学报》【年(卷),期】2018(040)003【摘要】小分子量热激蛋白(sHSPs,small heat shock proteins)在昆虫中分布广泛,能影响昆虫的生长繁殖、参与多种生理过程以及增强昆虫的温度耐受性.水稻二化螟Chilo suppressalis (Walker)是水稻上的主要害虫之一,目前在我国局部稻区危害严重.为了深入了解sHSPs在水稻二化螟生长发育及温度耐受性中的功能,利用RT-PCR和RACE技术克隆出一个二化螟小分子量热激蛋白CsHSP21.3基因.Cshsp21.3的cDNA序列全长为844 bp,其中开放阅读框(ORF)为555 bp,编码184个氨基酸,理论分子量为21.3 kDa,等电点为5.97;基因组结构分析发现,Cshsp21.3缺失内含子.实时定量PCR的实验结果表明:在脂肪体中Cshsp21.3的表达高于其它不同组织器官;在二化螟的不同发育阶段,3龄幼虫Cshsp21.3的表达水平最高,而且雌雄蛹的表达差异显著;高低温不能显著诱导Cshsp21.3的表达,说明该基因对温度胁迫不敏感.总之,Cshsp21.3与二化螟的温度耐受性之间没有密切的联系,但在二化螟的生长发育方面起着重要的作用.【总页数】9页(P505-513)【作者】宋杰;于同英;崔亚东;陆明星;杜予州【作者单位】扬州大学园艺与植物保护学院,扬州大学应用昆虫研究所,江苏扬州225009;阜阳师范学院生命科学学院,安徽阜阳236032;阜阳师范学院生命科学学院,安徽阜阳236032;扬州大学园艺与植物保护学院,扬州大学应用昆虫研究所,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,扬州大学应用昆虫研究所,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】Q963;S433.4【相关文献】1.莲草直胸跳甲小分子热激蛋白s H sp20.8基因的克隆及生物信息学分析 [J], 袁晓芳;徐朝茜;纪周瑜;马瑞燕;贾栋2.水稻中2个小分子热激蛋白基因启动子的序列分析及功能鉴定 [J], 郭虹霞;王创云;赵丽;王陆军;张丽光;邓妍3.甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5)克隆及其在转基因烟草中的表达分析 [J], 苏振华;张泽鑫;李妹芳;郭尚敬;冀芦沙4.甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5)克隆及其在转基因烟草中的表达分析(英文) [J], 苏振华;张泽鑫;李妹芳;郭尚敬;冀芦沙5.棉铃虫小分子热激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表达谱分析 [J], 杨朔;刘少凯;赵少轩;朱宇辰;徐磊;李童云;刘晓光;安世恒;魏纪珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专利名称：马铃薯腐烂茎线虫rDNA－ITS序列、特异性检测引物及一步双重PCR检测方法
专利类型：发明专利
发明人：彭德良,杨玉文
申请号：CN200510086261.0
申请日：20050819
公开号：CN1763193A
公开日：
20060426
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及“马铃薯腐烂茎线虫rDNA－ITS序列、特异性检测引物及一步双重PCR检测方法”。

马铃薯腐烂茎线虫rDNA－ITS，其具有如SEQ NO1或SEQ NO2所示的核苷酸序列；针对该rDNA－ITS序列设计的特异性检测引物SSsj与通用引物AB28结合，同时加入内标引物D3A和D3B，利用一步双重PCR方法检测，马铃薯茎线虫的PCR扩增结果能得到特异性623bp片段和345bp片段，而其它茎线虫的PCR扩增结果只能得到345bp片段。

该发明对为茎线虫的检疫检验和生产实践中茎线虫的识别提供快速准确的分子检测方法，为制定茎线虫病害综合治理决策提供理论参考。

申请人：中国农业科学院植物保护研究所
地址：100094 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司
代理人：张涛
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西北植物学报,2007,27(11):2147-2152Acta Bot.Bor eal.2Occident.Sin.文章编号:100024025(2007)1122147206*小麦TaLSD1锌指蛋白基因的电子克隆及序列分析黄新杰,郭军,屈志鹏,黄丽丽,康振生*(西北农林科技大学植物保护学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨陵712100)摘要:采用电子克隆与R T2PCR相结合的技术,在条锈菌(P uccinia str iif or mis f.sp.tr itici)侵染的小麦中克隆了一个LSD1型锌指蛋白基因,命名为T aLS D1(GenBank登录号为EF553327)。

序列分析表明,该基因全长1024 bp,编码生成1个包含3个保守LSD1型锌指结构(CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC)且长度为146个氨基酸的多肽。

进化树分析表明,T aLSD1与水稻(Oryz a sa tiva)、拟南芥(Ar a bidopsis tha liana)和芜菁(Br assica r a pa)中部分含有3个保守LSD1型锌指结构的同源基因亲缘关系较近,而与其它包含不同数目的LS D1型锌指结构基因亲缘关系较远。

推测Ta LSD1在进化中丢失了部分序列,进而执行新的功能。

半定量RT2PCR结果显示,该基因在亲和以及非亲和组合中的表达模式很相似,均表现在前期基因表达被抑制而后期恢复正常。

初步推测Ta LSD1在转录水平上的表达受光诱导,同时,作为一个细胞程序性死亡的负调控因子在小麦与条锈菌互作过程中起作用。

关键词:条锈菌;电子克隆;进化树分析;半定量RT2PCR;LS D1型锌指结构中图分类号:Q789文献标识码:AIn Silico Cloning and Sequence Analysis of a TaLSD1Zinc Finger Protein Gene from Wheat Infected by S tripe Rust FungusH UAN G Xin2jie,GU O Jun,QU Zhi2peng,H U ANG Li2li,KAN G Zhen2sheng*(College of Plant Protection and Sh aanxi Key Lab oratory of Molecular Biology for Agricu lture,Northwes t A&F University,Yangling,Shaanxi712100,China)Abstr act:Using in silico cloning and RT2PCR,an LSD1type zinc finger pr otein gene,Ta LSD1,was cloned from wheat infected by stripe rust fungus(Puccinia str iif ormis f.sp.tritici).Sequence analysis showed that the full2length cDNA of T aLSD1was1024bp,which encoded a polypeptide of146amino acids with three conserved motifs(CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC).Phylogenetic tree indicated that T aLSD1 might share a common ancestor with other LSD1type zinc finger protein genes which contained three con2 served LSD1type zinc finger motifs in rice(Or yza sativa),turnip(Bra ssica ra pa)and Ara bidopsis(Ara2 bidopsis tha liana),whereas it had a fur ther r elationship with other homologous genes with differ ent num2 ber of LSD1type zinc finger motifs.It was assumed that T aLSD1performs new function since some infor2 mation had been lost during evolution.The results of semi2quantitative RT2PCR showed that the transcrip2 tion profile of T aLSD1,which became normal after being down2regulated in the early stage,was similar in *收稿日期:2007205209;修改稿收到日期:2007209220基金项目:教育部重大科技培育项目(20042295);教育部长江学者和创新团队发展计划资助(IRT0558);国家自然科学基金资助项目(30671350);高等学校学科创新引智计划资助项目(B07049)作者简介:黄新杰(1981-),男,硕士,主要从事植物免疫学研究。

甘肃定西马铃薯腐烂茎线虫的发生、病原学研究及品种抗性评价马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是马铃薯贮藏期的一种重要病害,也是一种重要的全球检疫性有害生物,严重威胁马铃薯的生产。

本研究对甘肃省定西地区马铃薯腐烂茎线虫(D.destructor)的发生危害、种类鉴定、培养条件、侵染规律和抗性评价等方面进行了研究,主要研究结果如下:1.2014年12月和2015年3月,采集甘肃省定西地区马铃薯腐烂茎线虫病样,对马铃薯腐烂茎线虫为害马铃薯的症状进行观察和描述,并采用随机抽样的方法对该病在甘肃省定西地区的发生情况进行调查。

调查结果表明,甘肃定西地区马铃薯腐烂茎线虫病的发病率为2-11%,病情指数为0.72-5.33;品种间的发病程度差异较大,其中青薯9号和荷兰15号的发病程度显著高于其它品种。

2.采用形态学结合分子生物学的方法对甘肃定西马铃薯上的4个线虫群体进行了鉴定,利用UPGMA法构建线虫群体ITS序列的系统发育树,并按照柯赫氏法则进行了致病性测定。

结果表明,4个线虫群体在形态学上与马铃薯腐烂茎线虫一致,但群体DX27与群体DX11、DX16、DX19存在差异。

利用通用引物TW81/AB28扩增rDNA-ITS 序列获得了长度均为915 bp的片段;序列比对分析表明,群体DX27与其它3个群体相比,在ITS1区的96-255 bp片段内有25个位点的差异;系统发育树显示,群体DX27与马铃薯腐烂茎线虫C型群体聚为1支,群体DX11、DX16、DX19与马铃薯腐烂茎线虫B型群体聚为1支。

根据形态学特征及rDNA-ITS序列分析结果,将该病原线虫确定为马铃薯腐烂茎线虫,其中群体DX27属于C型,群体DX11、DX16、DX19属于B型。

3.选用茄镰刀菌(Fusarium solani)、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、半裸镰刀菌(F.semitectum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、交链孢(Alternaria alternate)和茄链格孢(A.solani)等8个真菌菌株,在15℃、20℃、25℃和30℃4个温度梯度下对马铃薯腐烂茎线虫的最佳室内培养条件进行筛选。

腐烂茎线虫不同群体同工酶表型与生物学特性研究甘薯茎线虫病是我国甘薯生产上重要病害之一,该病病原腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为我国检疫性病害。

腐烂茎线虫最早在马铃薯上发现,该线虫除了危害甘薯外,还危害花生、茄子、薄荷、甜菜和草莓等作物。

本实验以来自国内的10个腐烂茎线虫群体为研究材料,做了以下几方面的研究: 对国内不同地理来源的10个腐烂茎线虫群体进行同工酶表型研究。

结果表明: 1)在对DeJL和DeLJ 2个群体的同工酶梯度分析中发现,碾样200、400、600条线虫的10μl提取液中,只有碾样400条线虫提取液对DeJL和DeLJ表型研究均有较好的染色效果；2)10个群体苹果酸脱氢酶(MDH)酶谱分为2个酶型,酶型Ⅰ的相对迁移率(Rf值)约为0.21.0.26；酶型Ⅱ的Rf值约为0.21.0.26.0.31,而酯酶染色不成形；3)结合MDH表型和核糖体ITS区核酸序列分析,将腐烂茎线虫划分为3个不同遗传类型。

对国内不同地理来源的10个腐烂茎线虫群体在两个中抗甘薯茎线虫病品种(苏薯9号、宁薯9-9)上测定腐烂茎线虫群体致病力、繁殖力、雌雄比(性比)、甘薯薯块鲜重损失量。

结果表明: 1)在P=0.05水平上,各群体间的致病力、繁殖力、性比差异显著,其中致病力最高的群体来自河北廊坊DeHB,对苏薯9号的致病力为75%(即苏薯的病情指数为75%)；2)在苏薯9号和宁薯9-9上,各线虫群体致病力与线虫繁殖力呈正相关；3)偏相关分析显示,在苏薯9号上不同线虫群体繁殖力与性比呈负相关,相关系数低,只为-0.213,而在宁薯9-9上不同群体繁殖力与性比呈显著正相关,相关系数高,为0.901,说明寄主品种的改变对线虫群体性别分化影响显著；4)在抗甘薯茎线虫病和保鲜力方面,宁薯9-9分别比苏薯9号高33.48%和19.86%。

将腐烂茎线虫2个基因型进行杂交,在48个正反交组合中,33个杂交组合未产生后代,15个组合产生的F1代死亡,2个组合"DeLYxDeYL"和"DeSDxDeHB"产生活力很弱的F1代幼虫,继代培养未能产生可延续的后代；所有的杂交组合中所产生的F1代均为幼虫且其数量在P0.05水平上均显著低于亲本对照组；对"DeLYxDeYL"和"DeSDxDeHB"2个组合的F1代进行ITS-PCR扩增产物和RsaⅠ、Hae Ⅲ、HinfⅠ3种内切酶的酶切(RFLP)分析显示,F1代ITS区PCR产物与其母本条带长度较一致,约为800bp,2个杂交代与其亲本的酶切图谱在3个酶切位点上差异显著；对同一基因型内的线虫种群间杂交发现,杂交均能成功且产生可育的后代,对其F1代同样进行ITS区扩增产物和RFLP分析,发现同一基因型内杂交后代ITS区扩增产物和RFLP图谱与其亲本一致。

番茄筋腐病抗感材料果实中CAD基因的表达与分析
番茄筋腐病是由普遍存在的番茄筋腐病毒引起的一种主要病害，其致病机理复杂，难
以彻底控制。

近年来，随着基因表达技术的发展，研究人员发现，植物细胞壁代谢与病害
快速发展之间存在着密切的关联关系。

而CAD基因作为细胞壁生物合成途径中的关键基因，在此领域中具有重要的研究价值。

本文旨在研究番茄筋腐病抗感材料果实中CAD基因的表达与分析，为进一步研究该病
害的发生机理及开发新的防控手段提供科学依据。

本研究采用PCR扩增技术对抗感材料的
果实中CAD基因进行了克隆，得到了包含该基因序列的PCR产物，并进行了序列比对和分析。

在序列比对方面，将得到的PCR产物序列与该基因在GenBank数据库中的参考序列进
行比对，结果显示两者在序列上高度匹配。

同时，在ORF框中检测到未发生核苷酸插入或
缺失的完整Open Reading Frame（ORF），表明该PCR产品是CAD基因的完整转录本。

此外，本研究还利用生物信息学软件对CAD基因的物理化学性质进行了预测和分析，并对其保守
性与亲缘关系进行了比对。

结果显示，该基因的保守性和亲缘关系较高，表明其在物种间
具有广泛的共同性和相关性。

此外，为了探究CAD基因在番茄筋腐病抗感过程中的表达情况，本研究对抗感材料果
实进行了实时荧光定量PCR分析。

结果表明，在病毒感染后24小时内，CAD基因显著上调表达，且表达量明显高于感材料组。

此外，在病毒感染后48小时，CAD基因表达下降至感材料组水平之下，表明该基因在抵御番茄筋腐病的初期起到了重要的作用。

马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx和Gpx基因的原核表达及2-Cys PRX抑制剂高通量离体筛选体系的建立全球农作物每年由植物寄生线虫引起的产量损失就高达1250亿美元。

目前防治线虫的方法主要是通过栽培技术、作物轮作、抗性品种的选择,结合使用一些现在仍批准使用的化学杀线虫剂。

虽然这些化学药剂对线虫防治起到了积极作用,但我国现有防治线虫病害的药剂品种少,可供选择性不强,有关杀线虫剂的研究和开发,无论是理论研究和技术开发上,都还是农药领域中非常薄弱的部分。

开发新型、低毒、高效杀线虫剂成为必然趋势。

植物线虫抗氧化系统机制的深入研究为药物靶点的开发和利用提供了理论依据和新的切入点。

1.本文采用马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为研究对象,将谷胱甘肽过氧化物酶基因(DdGpx)克隆到pET-41b载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,并对其表达条件进行了IPTG浓度优化和温度优化。

结果显示,SDS-PAGE凝胶电泳在60 kD处有一条明显的带。

经质谱鉴定,此条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫GPX匹配。

表明重组Dd-GPX蛋白表达成功。

IPTG浓度对其表达量无明显影响,但温度影响明显,当温度在18℃时,重组Dd-GPX蛋白基本以可溶性形式表达,25℃时,表达部分可溶性蛋白,37℃时,全部以包涵体形式表达。

2.将马铃薯腐烂茎线虫2-Cys Prx基因(DdPrx)克隆到pET-41b载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,并对其表达条件进行了IPTG浓度优化和温度优化。

结果显示,SDS-PAGE凝胶电泳在55 kD处有一条明显的带。

经质谱鉴定,此条带有2个肽段与马铃薯腐烂茎线虫PRX匹配。

表明重组Dd-PRX蛋白表达成功。

IPTG浓度对其表达量无明显影响,但温度影响明显,温度为18℃和25℃时,重组Dd-PRX蛋白基本以可溶性形式表达,37℃时,表达部分可溶性蛋白。

马铃薯腐烂茎线虫对低剂量杀线虫剂的适应性研究马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是引起植物病害的主要病原物之一,每年都会给农业生产带来巨大的损失。

已有大量的杀虫剂相关文献报道指出低剂量杀虫剂可提高害虫对环境的适合度,从而诱导害虫再猖撅加重危害。

为此,本研究拟应用杀线虫剂阿维菌素、丙溴磷和涕灭威三种药剂,在低剂量条件下探讨药剂对马铃薯腐烂茎线虫的侵染活性的影响,同时研究热激蛋白70在化学农药胁迫下的诱导表达,初步探讨其生化机制,为进一步理解植物寄生线虫在低剂量杀线虫剂胁迫生境中的适应性以及合理使用杀线虫剂提供基础数据和科学依据。

本研究以Pluronic(?)F-127凝胶为培养基质,对马铃薯腐烂茎线虫分别采用2种处理方式来评价药剂的活性：1是将马铃薯腐烂茎线虫接种至含系列浓度药剂的基质与胡萝卜苗共培养；2是先将线虫采用系列浓度药液处理再接种至基质与胡萝卜苗共培养。

分别于14天后采用酸性品红染色,观察阿维菌素、丙溴磷、涕灭威3种杀虫剂对马铃薯腐烂茎线虫侵染胡萝卜苗的影响。

研究结果表明,2种不同处理方式对药剂活性的影响基本一致。

供试药剂中涕灭威对马铃薯腐烂茎线虫侵染的抑制活性最高,丙溴磷次之,阿维菌素的抑制活性较低。

本研究还采用RT-PCR和RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)三个热激蛋白70基因,分别命名为Dd-Hsp70-A (GenBank登录号KF792307)、 Dd-Hsp70-C(GenBank登录号JQ422276)和Dd-Hsp70-F (GenBank登录号JQ422277),并利用Real-time PCR检测了马铃薯腐烂茎线虫经低剂量(10、1、0.1、0.01和0.001μg/mL)杀线虫剂阿维菌素、丙溴磷和涕灭威处理24h后,三个热激蛋白70基因表达量的变化。

结果表明,Dd-Hsp70-A基因的cDNA全长为2081bp,开放阅读框为1938bp,编码了645个氨基酸；Dd-Hsp70-C基因的cDNA全长为2436bp,开放阅读框为2019bp,编码了672个氨基酸；Dd-Hsp70-F基因的cDNA全长为2092bp,开放阅读框为1959bp,编码了652个氨基酸。

马铃薯腐烂茎线虫6个抗氧化酶基因的克隆及低剂量杀线虫剂对其表达的影响马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是引起植物病害的重要病原物之一,每年给农业生产带来巨大的损失。

杀线虫剂施用后主要以低剂量的形式存在于土壤中,低剂量的杀线虫剂可能产生活性氧,从而对生物体产生损害,而生物体将产生抗氧化酶家族来抵御这种损害。

本文以马铃薯腐烂茎线虫为研究对象,采用RT-PCR和RACE方法成功克隆了马铃薯腐烂茎线虫三个超氧化物歧化酶基因：胞外铜锌超氧化物歧化酶(Extracellular CuZn SOD, EC-CuZn SOD),胞浆铜锌超氧化物歧化酶(Cytosolic CuZn-SOD, CT-CuZn SOD)和锰超氧化物歧化酶(MnSOD),一个过氧化物还原酶(Peroxiredoxins, Prx)、一个谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidases,GPx)和一个过氧化氢酶(Catalase, CAT)基因。

采用real time PCR 对分析了上述6种基因在低剂量(10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001μ/ml)杀线虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、涕灭威和丙溴磷处理,分析经低剂量杀线虫剂处理下基因表达量的变化。

Dd-EC-CuZn SOD-1(KC460330) soD-CT-CuZn SOD (KC460329)和Dd-MnSOD (JQ609354)的cDNA全长分别为848、680和1006bp,分别编码了长度为217、159和221个氨基酸残基的蛋白质。

序列分析结果表明,Dd-EC-CuZn-SOD-1预测蛋白N端含有19个氨基酸残基组成的信号肽和2个跨膜结构域,但在Dd-CT-CuZn-SOD-1和Dd-MnSOD-1预测蛋白均没有发现上述结构域。

Dd-EC-CuZn-SOD-l、 Dd-CT-CuZn-SOD-1和Dd-MnSOD-13个基因的基因组全长分别为1673bp、1597bp和2090bp,其中Dd-EC-CuZn-SOD-1、和Dd-MnSOD-1包括5个内含子和6个外显子,Dd-CT-CuZn-SOD-1含有3个内含子和4个外显子。

马铃薯腐烂茎线虫的鉴定及分子检测马铃薯腐烂茎线虫是侵染植物地下部分的一种迁移性内寄生线虫,在无高等寄主植物存在的情况下,它们主要取食土壤里的真菌而生存,是能够造成严重危害的重要植物病原线虫之一。

该线虫在我国北京、天津、山东、河北、河南、江苏、浙江、福建、辽宁、甘肃、海南等省市均有发生,以山东、河北两省发生最为严重。

本文对我国河北、江苏及韩国等不同地区的马铃薯、甘薯、大蒜茎线虫群体进行了形态鉴定和分子鉴定;对其ITS区域进行序列测定和分析,根据测定的序列设计了马铃薯腐烂茎线虫的特异性探针,建立了实时荧光PCR检测马铃薯腐烂茎线虫的方法。

通过研究主要取得以下几方面的结果:1.借助光学显微镜的形态鉴定结果表明:河北省张北送检的马铃薯的病原线虫为马铃薯腐烂茎线虫,这在我国还是首次报道。

与其它几个供试群体比较主要形态特征上无明显差异,与腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)基本一致。

2.本实验还对马铃薯腐烂茎线虫的培养方法进行筛选,认为最佳的培养条件是:以胡萝卜愈伤组织作为培养基质,在黑暗中,温度25℃,相对湿度70%。

3.供试样品的rDNA-ITS序列分析:用通用引物对rDNA1/rDNA2扩增供试群体rDNA-ITS区域,产生了序列长度不等的片段。

河北张北的马铃薯群体、韩国的大蒜群体和江苏的甘薯群体扩增片断长度均为1130bp。

而北京、北京大兴、河北抚宁的甘薯群体的扩增片段长度为942bp,与以上群体相比,在ITS区具有一个188bp的缺失片段。

根据Subbotin(2005)所公布的D.destructor的rDNA-ITS序列(GenBank NO:AY987007)确定ITS区域(包括5.8S全序列),Blast发现河北张北的马铃薯群体与其同源性最高,达到100%,进一步证实了种类形态鉴定的准确性。

比对后确定缺失片段位于ITS1区,而且该片段含有多个可重复小片段,这可能是造成碱基缺失的原因。