基因克隆及克隆基因的表达

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。

三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。

四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。

（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。

（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。

2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。

（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。

（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。

3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。

（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。

（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。

2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。

3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。

六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。

基因克隆的基本原理
基因克隆是指通过技术手段复制和传递生物体的基因信息，使得新生命体具有与原生物一样的基因组成。

基因克隆的基本原理涉及以下几个步骤：
1. DNA提取：从源生物体中获取含有目标基因的DNA。

这可以通过多种方法实现，例如细胞溶解、离心、染色体提取等。

2. 载体DNA准备：选择一种外源载体（例如质粒或病毒）作为基因传递的工具。

这些载体DNA通常会被处理以使其具备接受外来基因并复制自身的能力。

3. DNA连接：将目标基因与载体DNA进行连接。

这可以通过酶切和连接的方法实现。

酶切指的是利用特定的内切酶，将目标基因和载体分别切割，然后通过连接酶将它们结合在一起。

4. 转化：将连接好的载体DNA导入目标细胞内。

这可以通过多种方法实现，例如热冲击、电穿孔、微注射等。

目标细胞内的酶系统将自动复制和表达导入的基因。

5. 筛选和分离：将转化后的细胞进行筛选，找出具有目标基因的克隆细胞。

通常会引入某种选择标记来帮助鉴定带有目标基因的细胞。

6. 培养和繁殖：将筛选出的克隆细胞进行培养和繁殖。

这样就可以得到大量含有目标基因的细胞群体或生物个体。

基因克隆的基本原理是通过将目标基因与载体DNA连接，并将其导入目标细胞中，利用细胞内的酶系统实现基因的复制和表达。

这个过程经历了多个步骤，包括DNA提取、载体DNA准备、DNA连接、转化、筛选和分离，最终得到带有目标基因的克隆细胞或生物个体。

小鼠β-actin基因的克隆表达（2）实验步骤：（1）目的基因与表达载体的连接反应：①表达载体和目的片段的酶切管号①②pGEX 4T-1 42μlPCR产物42μlBamHⅠBuffer（10×）5μl5μlBamHⅠ1μl1μlSalⅠ2μl2μl加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。

然后将酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收。

②表达载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5 μlpGEX 4T-1酶切回收产物：1 μlPfu扩增并酶切回收的片段：3μlT4连接酶：1 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。

（2）克隆载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：pMD18-T 1 μl目的片段4μllSolution Ⅰ(含连接酶和buffer) 5 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜连接。

感受态细胞的制备及转化实验目的：把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。

实验原理：所谓感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态。

关于感受态的本质说法很多。

目前主要有两种假说：1.局部原生质体化假说—细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。

2.酶受体假说—感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

DNA分子的转化过程如下：1.吸附—完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。

2.转入—双链DNA分子解链。

单链DNA进入受体菌，另一条链降解。

3.自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。

表达—供体基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。

实验步骤：（1）感受态的制备① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃ 200rpm摇菌12～1 6h。

基因克隆的一般程序
基因克隆通常包括以下步骤：
1.选择一个目标基因，并设计引物：在开始之前选择要克隆的
基因，并设计引物。

引物通常包括两个寡核苷酸序列，它们与目标基因的两端相匹配，并且在引物的末端含有限制性内切酶识别位点。

2.将目标基因PCR扩增：使用引物进行PCR扩增，从而扩增
目标基因。

PCR扩增过程中，添加限制性内切酶识别位点的
引物，则可以获得含有限制酶切割位点的PCR产物。

3.剪切PCR产物：将PCR产物用限制性内切酶进行切割，因
为PCR产物含有限制性酶切割位点，因此可以选择正确的限
制性内切酶来切割。

4.连接载体：将PCR产物和质粒（或其他载体）用T4 DNA
连接酶连接在一起。

质粒通常被用作载体，因为它们可以在细胞内稳定复制。

5.转化：将连接好的质粒导入大肠杆菌等推动器中，并将其生
长在培养基上，以让它们自我复制。

6.筛选克隆：使用蓝白斑筛选法确定哪些细菌含有转化的基因。

该方法利用质粒上的LacZ基因，这可以使含有原核素三硝基
甲酸的菌落变成蓝色，而不含此基因的细菌则是白色的。

7.确定序列：将可能的克隆 DNA 提取出来，然后将其进行测序，从而确定克隆基因的精确序列。

8.表达蛋白质：克隆基因的表达，可以用来表达蛋白质。

这可以通过让此基因插入到一个表达载体中来完成，然后将其转化至宿主细胞中，也可对其进行人工表达分析。

基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。

2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。

3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。

质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。

4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。

内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。

5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。

这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。

6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。

转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。

7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。

8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。

9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。

10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。

需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。

一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。

2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。

3. 验证目的基因的克隆是否成功。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。

三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。

2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。

3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。

4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。

5. 连接载体：线性化载体。

6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。

7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。

8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。

四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。

（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。

（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。

2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。

（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。

3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。

（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。

基因克隆的主要方法目的基因是指要研究其生物学功能的一段编码特定蛋白的DNA 序列。

在基因克隆中，首先需要利用分子生物学技术，将目的基因从染色体上分离出来，获得基因序列并构建到载体上。

一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。

正向遗传学途径以克隆的基因所表现的功能为基础，通过基因的表达产物或表型性状鉴定进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则是着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的进一步发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。

简单地说，正向遗传学是从表型变化到基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

目前，在农业生物技术领域，已经从玉米、水稻、油菜、小麦、拟南芥、烟草、番茄等多种植物与动物及微生物中克隆得到了许多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。

1.功能克隆利用蛋白质的表达和功能信息分离鉴定出未知基因的方法称为未知基因的功能克隆（functional cloning）。

功能克隆法是根据性状的基本生化特征，鉴定已知基因的功能后分离目标基因的一种方法，该法是人类采用的第一个基因克隆策略。

其基本过程为：分离纯化感兴趣的蛋白质并测定部分氨基酸序列，设计相应的抗体待用；分离可能含有该蛋白的组织，提取RNA 和mRNA 进行体外翻译，在蛋白合成过程中，加入已制备的抗体，此时正在合成的该蛋白连同其模板mRNA 一同被沉淀；用蛋白酶消化沉淀中的蛋白质得到mRNA，进行反转录得到cDNA，进行测序获得要克隆的基因编码序列。

如果用功能克隆同源基因，其基本过程为：根据已知序列制备核苷酸探针或者蛋白抗体，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用相应蛋白的抗体探针，筛选表达载体构建的cDNA 文库获得相应克隆，对选中的克隆进行测序，获得目的基因序列。

功能克隆的关键在于需要先分离出纯度高的蛋白质，测定其部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次构建cDNA 文库或者基因组文库。

克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。

克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。

2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。

这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。

3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。

载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。

在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。

这个过程被称为“重组”。

4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。

5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。

这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。

6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。

通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。

克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。

基因克隆的几种常用方法DNA实验 2009-11-18 12:03:11 阅读119 评论0字号：大中小订阅基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。

不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。

特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。

本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。

1根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。

获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。

现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。

目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。

目前,以Genbank的应用最频繁。

这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。

要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。

查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。

值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。

根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。

基因克隆主要过程一、基因克隆概述基因克隆是指将一个细胞中的某个基因序列复制并转移到另一个细胞中，从而使目标基因得以表达。

基因克隆的过程包括：选择适当的宿主细胞、构建载体、将目标基因插入载体中、转化宿主细胞、筛选转化成功的细胞并培养、分离纯化目标基因等步骤。

本文将对这些过程进行详细的介绍。

二、选择适当的宿主细胞选择适当的宿主细胞是基因克隆的第一步。

通常情况下，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等。

选择宿主细胞的标准主要包括以下几个方面：1.易于培养：宿主细胞应具备简单、廉价、高效的培养条件，以便进行大规模的培养和筛选。

2.安全性：宿主细胞不应具备对人体有害的特性，以免对生物安全造成威胁。

3.生长速度：宿主细胞应具备较快的生长速度，以便加快基因克隆的进程。

三、构建载体在基因克隆中，常用的载体有质粒、病毒和人工染色体等。

构建载体的主要目的是将目标基因插入到载体中，并确保其能够被宿主细胞所识别和复制。

构建载体的步骤如下：1.获取载体：从自然界或者实验室中获取合适的载体，并通过酶切和连接等技术进行改造。

2.插入目标基因：将目标基因与载体进行连接，一般通过限制性酶切和连接酶的作用，将目标基因与载体的开放的端部连接。

3.反选：通过选择适当的标记（如抗生素耐药性基因）进行反选，以筛选出成功插入目标基因的载体。

四、将目标基因插入载体中将目标基因插入载体中是基因克隆的核心步骤，常用的方法有PCR扩增插入法、限制性内切酶法和电泳法等。

1. PCR扩增插入法PCR扩增插入法是目前常用的一种方法。

具体步骤如下：1.PCR扩增：使用PCR技术将目标基因的DNA序列扩增得到线性DNA片段。

2.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割成开放的线性片段。

3.连接：将扩增得到的目标基因片段与载体线性片段进行连接，需注意连接时选择合适的限制性内切酶。

2. 限制性内切酶法限制性内切酶法是较为传统的方法，也是基因克隆中常用的一种方法。

具体步骤如下：1.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割为开放的线性片段。

cDNA基因克隆的原理和步骤基因克隆是分子生物学中一项重要的技术，它使得科研人员能够克隆、扩增和研究特定基因序列，为基因功能和调控机制的研究提供了强有力的工具。

cDNA克隆则是基因克隆的一种常见形式，它通过将mRNA 转录为DNA并将其插入细菌质粒中，用于研究基因的表达和功能。

本文将详细介绍基因克隆和cDNA克隆的原理和步骤。

一、基因克隆的原理和步骤基因克隆是将目标基因从宿主生物体中剪切出来，并将其克隆到载体分子中的过程。

基因克隆的原理和步骤如下：1. 分离目标基因：从生物体中提取DNA，并使用限制性内切酶切割目标基因的DNA序列。

限制性内切酶是一类能够在特定的核酸序列上切割DNA的酶。

通过选择适当的限制性内切酶，可以剪切出目标基因的特定DNA片段。

2. 构建载体分子：选择一个适当的载体分子，如质粒，将其进行限制性内切酶切割。

切割后的载体分子将产生两个或多个裂开的末端。

3. 连接目标基因和载体：将目标基因的DNA片段与裂开的载体分子末端进行连接。

这个过程需要使用DNA连接酶，如T4 DNA连接酶。

DNA连接酶能够将两个DNA片段连接在一起，形成一个完整的DNA分子。

4. 转化宿主细胞：将连接好的目标基因和载体分子转化到宿主细胞中。

通常使用大肠杆菌作为宿主细胞，转化过程中使用适当的选择性培养基，如含有抗生素的培养基。

只有带有目标基因和载体的细胞才能在选择性培养基上生长。

5. 筛选和鉴定：经过转化和培养后，筛选出含有目标基因的克隆细胞。

常用的鉴定方法包括PCR分析，限制性内切酶切割和DNA测序等。

这些方法可以验证克隆细胞是否含有目标基因，并确认其序列是否正确。

二、cDNA克隆的原理和步骤cDNA克隆是将mRNA转录为DNA并将其插入细菌质粒中的过程，用于研究基因的表达和功能。

cDNA克隆的原理和步骤如下：1. 分离mRNA：从细胞中分离出总RNA，然后使用反转录酶将mRNA转录为cDNA。

反转录酶是一种与RNA相关的DNA聚合酶，它能够使用RNA作为模板合成cDNA的第一链。

克隆载体：大多是高拷贝地载体，一般是原核细菌，将需要克隆地基因与克隆载体地质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量地基因克隆，被克隆地基因不一定会表达，但一定被大量复制.克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达地蛋白质而影响别地工作.克隆载体( )：携带插入外源片段地质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物.(这是为“携带”感兴趣地外源、实现外源地无性繁殖或表达有意义地蛋白质所采用地一些分子.)其中，为使插入地外源序列可转录、进而翻译成多肽链而设计地克隆载体又称表达载体.是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体地标志.表达载体：有地是高拷贝地，有地是低拷贝地，各有各地用处，是一些用于工程生产地细菌，被导入地目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要地产物，导入地基因是由克隆载体产出地.表达载体具有较高地蛋白质表达效率，一般因为具有强地启动子.表达载体（）就是在克隆载体基本骨架地基础上增加表达元件（如启动子、、终止子等），是目地基因能够表达地载体.如表达载体是一个具有典型表达结构地大肠杆菌表达载体.其基本骨架为来自和地质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因.在表达元件中，有一个杂合强启动子和终止子，在启动子下游有位点（如果利用这个位点，要求与之间间隔），其后地多克隆位点可装载要表达地目标基因.（位点：年和首先发现，原核生物，在上有核糖体地结合位点，它们是起始密码子和一段位于上游～处地由—组成地序列.这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与，末端地富含嘧啶地序列互补，是核糖体地识别与结合位点.根据发现者地名字，命名为序列，简称序列.由于它正好与小亚基中地’端一部分序列互补，因此序列也叫做核糖体结合序列.真核生物存在于真核生物地一段序列，其在翻译地起始中有重要作用.加(), 是用来增强真核基因地翻译效率地.是最优化地环境，避免出现）克隆载体目地在于复制足够多地目标质粒，所以常带有较强地自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆.但不具备表达元件.而表达质粒有复杂地构成，为地是控制目标蛋白地表达，如各种启动子（），调节子（）等，而且以为代表地表达载体在菌体内都是低拷贝地，防止渗漏表达.克隆载体只是把你要地基因片段拿到就可以了，不管读码框什么地，但是表达载体是不但要你地目地基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你地读码框不能乱了，否则就不能得到你想到地表达产物..载体即要把一个有用地基因（目地基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（）.. 载体地分类按功能分成：（）克隆载体: 都有一个松弛地复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增.它是用来克隆和扩增片段（基因）地载体.（）表达载体:具有克隆载体地基本元件（等）还具有转录翻译所必需地顺序地载体.按进入受体细胞类型分：（）原核载体（）真核载体（）穿梭载体（）指在两种宿主生物体内复制地载体分子，因而可以运载目地基因（穿梭往返两种生物之间）.克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒地复制.问题：基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目地蛋白，那么实际应用中，我们地最终目地是要得到目地蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目地基因地大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体地功能？构建兼有克隆和表达双重功能地载体有何困难？.克隆地目地比较单一，就是将你感兴趣地片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库地建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳地目地片段地长度是有限地，而克隆载体没有表达所需地各种片段，所以可以容纳更长地目地片段，即可以克隆足够长地基因，效率更高..重组需要使用限制性内切酶，因此待克隆地目地片段两端必需有其识别位点，现在地克隆载体可以直接克隆产物，省去了两端加装识别位点地设计，效率就更高..表达载体地目地是多样化地，为了实现实际工作中地需要，不同地目地就要设计不同地载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂..细菌摄取能量地能力是一定地，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少. .细菌承受地工作负荷也是有限地，给它地工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理.原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多.所以我们一般地策略是，将目地片段克隆于非常简单地克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求地表达载体上.回答地不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助.1)“克隆载体可以直接克隆产物，省去了两端加装识别位点地设计，效率就更高.”是什么意思？克隆载体是载体地线性化后两端加了，而酶有在产物后随机加地特性，所以产物直接可以接入载体.而经典地克隆产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计引物时两端要加酶地识别位点，而加装地序列与模板不配对，因此效率会低很多.2)克隆载体只是为了得到大量地目地基因，而现在多用就可以达到这个目地.那这个目地基因地主要用途是什么？只用来测序吗？表达载体应该兼有克隆与表达地功能地吧？嗯，基本是这个意思.就测序不克隆也可以进行，克隆到载体地中就在基因两端有了可供你选择地很多限制性酶切位点，方便亚克隆到各种表达载体上.当然表达载体可以克隆，但是效率低于克隆载体.一是因为表达载体不能直接克隆产物，必须加装限制性酶切识别序列，上面已经讲过.二是表达载体地选择相对克隆载体是更加严谨型地质粒，就是每个细菌里地拷贝数较低，能量守恒，细菌摄取能量地能力是一定地，用来合成蛋白质，核酸地合成必然受一定得限制.3)我要构建一个基因地载体，.我可以将目地基因（左右）和表达载体分别作酶切后连接吗？这几天将目地基因做了一个载体连接，可是不知道下一步怎么利用？.设计引物地时候用了和，做地时候可以用酶吗？酶是必须地吗？.我选择地表达载体上和地酶切位点只是相差两个碱基，做双酶切地时候能切开吗？.如果你地目地基因已经在载体上，当然可以分别酶切后连接，但是要注意方向..如果是载体连接地引物可以不设计酶切位点.载体可以直接连接产物源于其末端错加地，所以不能使用高保真地.但是你地扩增片段较长，如果用一般地酶，合成中可能会出错，用准确度高，需要设计酶切位点.如果产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要地载体，不必借助载体.文献上有报道，按：地比例混合使用和效果更好..应该能切开，因为设计引物时保护碱基也就到个，但是最好稍微距离远一点.。

西北植物学报,2020,40(12):2023-2030A c t aB o t .B o r e a l .-O c c i d e n t .S i n.d o i :10.7606/j .i s s n .1000-4025.2020.12.2023 h t t p ://x b z w x b .a l l jo u r n a l .n e t 收稿日期:2020-08-20;修改稿收到日期:2020-10-30基金项目:国家自然科学基金(31560568,31760587)作者简介:方 颖(1996-),女,硕士研究生,研究方向为花色生理及遗传育种㊂E -m a i l :1173030051@q q.c o m *通信作者:金雪花,副教授,硕士生导师,主要从事园林植物遗传育种研究㊂E -m a i l :x h _k i m l i a n @126.c o m华丽龙胆G s F 3'5'H 和G s F N S 基因的克隆及表达分析方 颖,黄启群,金雪花*(昆明理工大学建筑与城市规划学院,昆明650500)摘 要:该研究以华丽龙胆(G e n t i a n a s i n o -o r n a t a )5个不同开放阶段(H 1~H 5)的蓝色花冠为试材,利用R T -P C R技术克隆G s F 3'5'H 和G s F N S 全长序列,并进行生物信息学分析,比较G s F 3'5'H 和G s F N S 在不同组织和不同开放阶段的基因表达模式㊂结果显示:(1)所克隆的G s F 3'5'H 和G s F N S 基因分别包含1560b p 和1590b p 开放阅读框(O F R ),并分别编码520和529个氨基酸㊂(2)结构分析显示,G s F 3'5'H 和G s F N S 均具有典型的F 3'5'H 和F N S Ⅱ蛋白保守结构域㊂(3)系统进化树分析表明,G s F 3'5'H 和G s F N S 亲缘关系最近的物种是三花龙胆(G e n t i -a n a t r i fl o r a )㊂(4)q R T -P C R 结果显示,G s F 3'5'H 和G s F N S 基因在根㊁茎㊁叶和花冠中均表达,其中G s F 3'5'H 基因在花冠H 3阶段表达量最高㊂G s F N S 在根中表达量最高,其次在花冠H 4阶段两基因的表达均较高㊂研究推测,G s F 3'5'H 基因表达产生的飞燕草素苷和G s F N S 表达产生的黄酮共着色作用可能使华丽龙胆的花冠呈更稳定艳丽的蓝色,为蓝色花分子育种提供重要的基因资源㊂关键词:华丽龙胆;蓝色花;G s F 3'5'H ;G s F N S ;表达分析中图分类号:Q 785;Q 786文献标志码:AC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f G s F 3'5'H a n d G s F N S G e n e s f r o m G e n t i a n a s i n o -o r n a t aF A NG Y i n g ,HU A N G Q i qu n ,J I N X u e h u a *(F a c u l t y o f A r c h i t e c t u r e a n d C i t y P l a n n i n g ,K u n m i n g U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,K u n m i n g 650500,C h i n a )A b s t r a c t :T o i n v e s t i ga t e t h e f u n c t i o n o f G s F 3'5'H a n d G s F N S i n G e n t i a n a s i n o -o r n a t a ,w i t hb l u ec o r o l l ad u r i n g 5d i f fe r e n tf l o w e r i ng s t a g e s (H 1-H 5)a s th e t e s t m a t e ri a l ,w e c l o n e d t h e f u l l -l e n g t h c D N A b yu s i n g R T -P C R t e c h n i q u e s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t :(1)G s F 3'5'H a n d G s F N S c o n t a i n 1560b p an d 1590b p o p e n r e a d i n g f r a m e (O F R ),w h i c h e n c o d e 520a n d 529a m i n o a c i d s ,r e s p e c t i v e l y.(2)S t r u c t u r a l a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t b o t h G s F 3'5'H a n d G s F N S h a d t y p i c a l c o n s e r v e d d o m a i n s o f F 3'5'H a n d F N S Ⅱ.(3)P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t G e n t i a n a t r i fl o r a w a s t h e c l o s e s t r e l a t i v e s p e c i e s b e t w e e n G s F 3'5'H a n d G s F N S .(4)q R T -P C R s h o w e d t h a t G s F 3'5'H a n d G s F N S w e r e e x pr e s s e d i n r o o t s ,s t e m s ,l e a v e s a n d c o r o l l a ,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f G s F 3'5'H w a s t h e h i g h e s t i n c o r o l l a H 3s t a g e ,t h e e x pr e s s i o n l e v e l o f G s F N S w a s t h e h i g h e s t i n r o o t s ,w h i c h f o l l o w e d b y t h e c o r o l l a H 4s t a g e .I t s h o w e d t h a t t h e c o -p i gm e n -t a t i o n e f f e c t o f d e l p h i n i n a n d f l a v o n e e x p r e s s e d b y G s F 3'5'H a n d G s F N S m a y ma k e t h e c o r o l l a o f G e n t i -a n a s i n o -o r n a t a m o r e s t ab l e a n d b l u e r ,w h ic h p r o v id i n g i m po r t a n t g e n e t i c r e s o u r c e s f o r t h e m o l e c u l a rb r e e d i n g o f b l u e f l o w e r s.K e y w o r d s:G e n t i a n a s i n o-o r n a t a;b l u e f l o w e r s;G s F3'5'H;G s F N S;e x p r e s s i o n a n a l y s i s龙胆是龙胆属植物中生长最快的一年生草本植物[1],而华丽龙胆(G e n t i a n a s i n o-o r n a t a)是龙胆属中最为美丽珍贵的种,它具有的艳丽深蓝色花冠是培育和研究龙胆属植物蓝色花呈色机理的理想材料㊂植物呈色物质一般可分为类胡萝卜素㊁类黄酮和生物碱三大类,其中类黄酮化合物是一类广泛分布于植物体内的次生代谢产物,能产生淡黄色到蓝紫色的颜色[2]㊂迄今为止蓝色花育种是花色研究的一大热点,已有研究表明,蓝色花形成的主要原因是飞燕草素苷的积累[3],复杂的飞燕草素苷酰基化作用[4]或来自金属离子的螯合作用[5]㊂类黄酮3'5'-羟化酶(f l a v o n o i d-3'-h y d r o x y l a s e,F3'5'H)是合成飞燕草素苷的前体[3],培育蓝色花最有效的途径是通过F3'5'H催化植物花青素苷合成途径内二氢堪非醇(D H K),生成二氢杨梅黄酮(D HM)并积累飞燕草素苷[6]㊂例如,通过引入编码类黄酮3'5'-羟化酶的基因,可以在玫瑰(R o s a r u g o s a)[7]㊁康乃馨(D i a n t h u s c a r y o p h y l l u s)[8]等多种花卉中积累飞燕草素苷,在矮牵牛(P e t u n i a g r a n d i f l o r a P r i m e T i m e )中过度表达蝴蝶兰(P h a l a e n o p s i s)F3'5'H 会导致飞燕草素苷的积累并产生了蓝色花[9]㊂但是有研究发现飞燕草素苷单独出现在植物中花色会呈现紫红色,此时需要黄酮作为共着色物质才能呈现出蓝色[10]㊂同时黄酮对花青素苷具有稳定作用[11],可作为飞燕草素苷在蓝色花植物中的共着色物质和紫外线吸收剂,形成复合体使花冠可见光吸收最大值变长,使花色更蓝[12]㊂黄酮合成酶(f l a v o n e s y n t h a s e,F N S)在高等植物已经进化出2个完全独立的酶系统(F N SⅠ和F N SⅡ)来催化黄酮的合成[13],它们均以柚皮素为底物却不会同时出现在同一植物中,但F N SⅡ普遍存在植物中生成黄酮[14]㊂本研究以课题组前期建立的华丽龙胆转录组数据库为基础,利用R T-P C R技术从华丽龙胆花冠中分离得到1个F3'5'H基因和1个F N S基因,命名为G s F3'5'H和G s F N S㊂利用生物信息学软件进行初步的分析,再应用q R T-P C R分析G s F3'5'H 和G s F N S在华丽龙胆不同开放阶段的花冠以及根㊁茎㊁叶组织中的表达模式,为后续G s F3'5'H㊁G s F N S的生物学功能研究以及解析华丽龙胆蓝色花冠的呈色机理方面提供重要理论基础和参考依据㊂1材料和方法1.1实验材料试验材料为云南迪庆高山地区采摘的华丽龙胆(G e n t i a n a s i n o-o r n a t a),分离出根(G)㊁茎(J)㊁叶(Y)以及5个不同开放阶段(H1~H5,图1)的花冠,分别液氮速冻后存于-80ħ超低温冰箱备用㊂1.2实验方法1.2.1华丽龙胆c D N A的合成采用华越洋R N A 提取试剂盒(华越洋0416-500型,中国)提取华丽龙胆不同开放阶段花冠以及根㊁茎㊁叶的R N A,用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和清晰度,并用紫外分光光度计检测其质量后,参照P r o m e g a生物公司提供的M-M L V T r a n s c r i p t a s e反转录试剂盒合成c D N A第一链后于-20ħ保存㊂1.2.2G s F3'5'H和G s F N S基因克隆从本课题组前期建立的华丽龙胆花冠转录组库中,筛选功能注释为G s F3'5'H和G s F N S的序列,并在N C B I数图1具有不同开放阶段花冠(H1~H5)的华丽龙胆F i g.1 D i f f e r e n t c o r o l l a d e v e l o p m e n t s t a g e s(H1-H5)o fG e n t i a n a s i n o-o r n a t a4202西北植物学报40卷表1用于基因克隆与表达分析的特异性引物T a b l e1 S p e c i f i c p r i m e r s f o r g e n e c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n a n a l y s i s试验E x p e r i m e n t基因G e n e引物P r i m e r(5'ң3')正向F o r w a r d反向R e v e r s eO F R扩增O F R a m p l i f i c a t i o n G s F3'5'H A T G C C C A T A A A A A T G T C A C C C A T A G A A G T T T G G T A T G A A T A T G A G T A A G s F N S C A C A A A T T C T T T T A T T C A C C C T T C A A A T G A T G C T T C T T G A T T A C T T T T A C荧光定量P C RQ u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R G s F3'5'H C A A C C A T C C T A A T C C G A G C C C C A C A T T G A G C C G A G T C C C T T T G s F N S C C T T A C G G T C C C T A C T G G A A A T A C C G G C T C G A A A T G G G T G A G A T内参基因R e f e r e n c e g e n e s G A P DH C T T G C A C A A C A A A T T G C C T T G C C C A C A G C C T T A G C C G C A C Cß-t u b u l i n G C T T T C T T G C A T T G G T A C A C C G T C T T C T T C C T C T T C G T A T T C C T C C据库上分析序列特征,利用P r i m e r6.0设计特异性引物(表1),再应用R T-P C R技术分离出二者的全长序列,引物合成和测序均由昆明硕擎生物有限公司完成㊂P C R扩增体系为20μL,包含10ˑP C R B u f f e r(M g2+p l u s)2μL,d N T P M i x t u r e1.6μL,c D N A1μL,β-t u b u l i n-F和β-t u b u l i n-R0.4μL,d d H2O14.5μL和T a K a R a T a q0.1μL,G s F3'5'H 和G s F N S序列扩增条件均为:94ħ预变性5m i n, 94ħ变性50s,54ħ退火35s,72ħ延伸1m i n, 35个循环,72ħ延伸10m i n㊂用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果㊂经过P C R回收纯化后连接到p M D19-T载体,转入大肠杆菌感受态细胞,挑选阳性克隆测序㊂1.2.3G s F3'5'H和G s F N S生物信息学的分析利用O F R F i n d e r(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/o r f f i n d e r)查找G s F3'5'H和G s F N S序列开放阅读框,将分析预测成功的G s F3'5'H和G s F N S利用N C B I C o n s e r v e d D o m a i n s(h t t p://w w w.n c b i.n l m. n i h.g o v/S t r u c t u r e/c d d/w r p s b.c g i)进行保守域分析,使用P r o t p a r a m(h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/p r o t-p a r a m/)和P r o t s c a l e(h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/c g i-b i n/p r o t s c a l e/p r o t s c a l e.p l)预测蛋白质的理化性质和亲㊁疏水性㊂借助N e t p h o s2.0s e r v e r(h t t p://w w w.c b s.d t u.d k/se r v i c e s/N e t P h o s-2.0/)预测基因磷酸化位点㊂利用B l a s t p(h t t p s://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i#a l n H d r_A Z S49192)㊁D N AMA N9.0软件和M E G A9.0软件进行氨基酸同源性搜索,保守结构分析并构建进化树㊂1.2.4G s F3'5'H和G s F N S基因表达模式分析利用P r i m e r6.0设计G s F3'5'H和G s F N S2个基因的实时定量P C R引物(表1)后,再应用A B I2720 P C R仪器和G e n e9600定量P C R仪器对产物进行定量分析㊂P C R扩增反应体系为2ˑS Y B R G r e e n q P C R M a s t e r M i x5μL,50μm o l/L正反引物各0.1μL,c D N A模板10μL㊂反应程序为:94ħ预变性10m i n,95ħ变性15s,最佳温度退火30s,60ħ延伸30s,39~40个循环㊂制备60~95ħ溶解曲线㊂目的基因相对转录表达水平的计算参照L i v a k 等[15]的方法,计算公式为2-ΔΔC t,并以G A D PH和β-t u b u l i n表达量的几何平均值为内标,每个样品进行3次生物学重复,最后利用S P S S软件进行显著性检测㊂2结果与分析2.1G s F3'5'H和G s F N S的全长克隆与序列分析以华丽龙胆c D N A为模板进行P C R扩增,分别获得1744b p和1628b p的G s F3'5'H和G s-F N S全长c D N A片段(图2),利用O F R F i n d e r分析G s F3'5'H和G s F N S开放阅读框分别为1560 b p和1590b p,各编码520和522个氨基酸㊂结构域分析显示G s F3'5'H和G s F N S均属于细胞色素P450家族㊂其中G s F3'5'H等电点为9.02,平均亲水性(G R A V Y)为-0.109,该预测表明G s F3'5'H为亲水性蛋白,有9个S e r磷酸化位点,3个T h r磷酸化位点和6个T y r磷酸化位点㊂G s F N S等电点为8.78,平均亲水性(G R A V Y)为-0.237,该预测表明G s F N S为亲水性不稳定蛋白,图2华丽龙胆G s F3'5'H和G s F N S基因O F R扩增结果F i g.2 O F R a m p l i f i c a t i o n r e s u l t s o fG s F3'5'H a n dG s F N S g e n e s i n G.s i n o-o r n a t a520212期方颖,等:华丽龙胆G s F3'5'H和G s F N S基因的克隆及表达分析有14个S e r磷酸化位点,7个T h r磷酸化位点和3个T y r磷酸化位点㊂2.2G s F3'5'H和G s F N S基因编码蛋白同源及进化分析用D N AMA N9.0软件将G s F3'5'H基因完整开放阅读框编码的氨基酸序列与其他物种F3'5'H 氨基酸序列进行同源比对分析,结果表明G s F3'5'H 与其他物种F3'5'H相似性达到92.55%,其中与柳叶龙胆(G e n t i a n a a s c l e p i a d e a)㊁三花龙胆(G e n t i-a n a t r i f l o r a)㊁龙胆草(G e n t i a n a s c a b r a)F3'5'H氨基酸序列相似性达到88%以上,具有相似的保守结构域(图3)㊂F3'5'H含有起始于35位左右的 P P G P红色方框所示依次为细胞色素P450酶系(C Y P) P P G P 基序㊁I螺旋区㊁C端血红素结合区㊁脯氨酸富集区㊁催化活性中心和亚铁血红素结合区图3华丽龙胆与其他植物已知G s F3'5'H和G s F N S蛋白氨基酸序列比对R e d b o x i n d i c a t e s P P G P m o t i f,I-h e l i x m o t i f,h a e m-b i n d i n g r e g i o n,p r o l i n e-r i c h r e g i o n,c a t a l y t i c p r o p e r t ya n d h e m e-b i n d i n g r e g i o n o f C y t oc h r o m e(P450)F i g.3 A l i g n m e n t s b e t w e e nG s F3'5'H a n d G s F N S i n G.s i n o-o r n a t a a n d k n o w n G s F3'5'H a n dG s F N S p r o t e i n a m i n o a c i d s e q u e n c e s i n o t h e r p l a n t s6202西北植物学报40卷结构域,这是细胞色素P450家族的特征氨基保守序列[16],华丽龙胆N端48~51处 P P G P 基序在不同的物种中均高度保守㊂353~357处的Ⅰ螺旋(I-h e l i x m o t i f)基序 A G T D T 序列不仅是形成氧分子的结合域,还与底物的选择和结合相关[17]㊂C端血红素的结合区(h a e m-b i n d i n g r e g i o n)以 F G A G R R I-C A G (H B R)为中心,左右各氨基酸围绕半胱氨酸形成特定结构[18],但是可以看到华丽龙胆487~496之间第494位异亮氨酸突变为苏氨酸,即 F G A G R R T C A G ,此处保守氨基酸的定点突变对其功能的影响,需要进行后续的研究分析㊂因此推测G s F3'5'H属于黄酮-3',5'-羟基化酶㊂将G s F N S与其他物种F N S进行同源序列比对分析,结果表明G s F N S与其他物种F N SⅡ氨基酸序列相似性达到72.28%以上,其中与三花龙胆(G e n t i a n a t r i f l o r a)F N SⅡ氨基酸序列相似性达到92.26%,与其他物种F N SⅡ基因具有相似的保守结构(图4)㊂P450家族蛋白质的空间结构在进化过图4 G s F3'5'H和G s F N S蛋白与其他物种蛋白的系统发育树F i g.4 M o l e c u l a r p h y l o g e n e t i c t r e e o fG s F3'5'H a n dG s F N S b a s e d o n a m i n o a c i d s e u e n c e s 程中有3个保守的结构区:脯氨酸富集区(p r o l i n e-r i c h r e g i o n,L P P S P X X X X P)㊁催化活性中心[c a t a-l y t i c p r o p e r t y,A G T D T(T/S)]和亚铁血红素结合区(h e m e-b i n d i n g r e g i o n,P F G X G R R X C P G)[19]㊂G s F N S N端33~41处的 L P P S P F A L P 脯氨酸富集区㊁350~355处的 A A T D T T 催化活性中心以及448~458处 的P F G T G R R G C P G 亚铁血红素结合区在不同的物种中均高度保守㊂但是可以看到华丽龙胆和三花龙胆351氨基酸处甘氨酸突变为丙氨酸,同样此处保守氨基酸的定点突变对其功能的影响是否是龙胆科植物特有的需要进行后续的研究㊂因此,推测G s F N S属于黄酮合成酶Ⅱ㊂利用M e g a9.0软件将G s F3'5'H和G s F N S编码的蛋白质氨基酸序列与其他同源基因编码的蛋白质氨基酸序进行系统进化树分析㊂结果(图4)表明,华丽龙胆的G s F3'5'H与同属的龙胆科三花龙胆(G e n t i a n a t r i f l o r a)和龙胆草(G e n t i a n a s c a b r a)最先聚在一支,它们的亲缘关系最近,再上一级则和柳叶龙胆(G e n t i a n a a s c l e p i a d e a)聚为一支,这3个物种同属于龙胆属㊂G s F N S与同属的龙胆科三花龙胆(G e n t i a n a t r i f l o r a)最先聚在一支,它们的亲缘关系最为接近㊂2.3G s F3'5'H和G s F N S基因在花冠不同开放阶段和不同组织中的表达通过q R T-P C R对G s F3'5'H和G s F N S进行表达模式分析,结果表明G s F3'5'H和G s F N S在不同开放阶段的花冠以及根㊁茎㊁叶中均有表达(图5)㊂其中,G s F3'5'H在H1~H3表达量递增,在H4不同小写字母表示同一基因在组织间的表达差异显著(P<0.05)图5G s F3'5'H和G s F N S在不同组织中的表达D i f f e r e n t n o r m a l l e t t e r s i n d i c a t e t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e s a m eg e n e i s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n t i s s u e s(P<0.05)F i g.5 R e l v t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o fG s F3'5'H a n d G s F N Si n d i f f e r e n t t i s s u e s720212期方颖,等:华丽龙胆G s F3'5'H和G s F N S基因的克隆及表达分析中的表达量下降,在H5表达量下降至最低;花冠中G s F3'5'H表达量较根㊁茎㊁叶中高,且茎中只有微量表达㊂前期对华丽龙胆花冠总花青素苷含量进行测定发现蓝色花冠中飞燕草素苷占总花青素苷的95%以上,可推断飞燕草素苷是华丽龙胆花瓣呈蓝色的主要原因[20]㊂同时根据G s F3'5'H表达量与飞燕草素苷含量的变化发现随着G s F3'5'H基因表达量的上调,飞燕草素苷含量也在上升,当G s F3'5'H 基因表达量开始降低,飞燕草素苷含量也随之降低[20]㊂G s F N S表达量在H1到H2递减到最低,降低了67%,在H3到H4递增到最高,此阶段与华丽龙胆G s F3'5'H表达量趋势相反,但H2到H3中G s-F N S与G s F3'5'H表达趋势一致,且增长幅度是G s F N S高于G s F3'5'H,到H5阶段G s F N S表达量又降低㊂在根㊁茎㊁叶和花冠中G s F N S的表达量从华丽龙胆形态学上端到下端逐渐减弱,呈现出较大的差异性㊂S P S S软件分析表明,G s F3'5'H和G s-F N S在不同开放阶段花冠和根㊁茎㊁叶中表达量存在显著差异(P<0.05)㊂3讨论本研究采用R T-P C R方法首次从华丽龙胆中分离出1个G s F3'5'H和1个G s F N S基因全长序列,两个基因分别编码520和522个氨基酸,序列分析表明G s F3'5'H和G s F N S属于细胞色素P450超家族且都具有P450家族特有保守结构域㊂F3'5'H 是花青素苷生物合成途径中催化蓝色飞燕草素苷合成的关键酶[9],F N S作为黄酮合成酶直接在黄烷酮C-2和C-3之间引入双键合成黄酮[21],黄酮与飞燕草素苷的共着色作用使蓝色花更加艳丽[22]㊂与前人的研究结果对比发现,F3'5'H在相同物种不同发育以及组织中具有不同的表达模式,存在时空特异性㊂例如在蓝色和紫色瓜叶菊(S e n e c i o c r u e n t u s)[23]中F3'5'H仅在Ⅰ级花瓣中高丰度表达,其他级别的花瓣中未表达,说明花瓣未开放第Ⅰ阶段前的高表达已经决定了合成的花青素苷种类㊂在川头乌(A c o n i t u m c a r m i c h a e l i D e b x)[24]中A c-F3'5'H表达量随花朵发育递增,而在根㊁茎㊁叶中并不表达㊂但在蔓长春花(V i n c a m a j o r)[25]㊁蝴蝶兰(P h a l a e n o p s i s)[26]以及中国桔梗(P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u s)[27]中F3'5'H均在2~4阶段表达信号强,在其他阶段表达信号微弱,在花开放前的阶段F3'5'H高丰度表达模式与G s F3'5'H表达模式类似㊂因此F3'5'H的表达量的差异可能是不同物种着色程度及发育情况不同造成的[28]㊂此外,马璐琳等[29]研究黄草乌(A c o n i t u m v i l m o r i n i a n u m)蓝色花朵中A v-F3'5'H时发现其在第3时期的表达量最高,随后又逐渐降低,与G s F3'5'H表达模式相符㊂同时有研究认为抑制F N S基因表达会导致黄酮含量下降[30],并且许多药用植物如少花龙葵(S o-l a n u m p h o t e i n o c a r p u m N a k a m u r a e t O d a s h i-m a)[31]㊁乌拉尔甘草(G.u r a l e n s i s)[32]幼苗期发育阶段黄酮含量最高,随后开始下降,后期为了抵御紫外线,保持在所处环境中的生长优势,黄酮含量又会开始逐渐增加㊂在水母雪莲(S a u s s u r e a m e d u s a)中, F N SⅡ的表达趋势与木犀草素一致可以调控黄酮的合成[33]㊂在灰毡毛忍冬(L.m a c r a n t h o i d e s)[34]中L m F N S I I-1.1的表达水平在S4期最高,且表达水平与花蕾中黄酮的积累模式一致,这与G s F N S表达模式类似㊂同时植物体内黄酮的高积累也有利于增强植物自身抗逆性以及化学防御功能,对植物适应不良环境发挥着重要作用[35]㊂而华丽龙胆G s F N S 在根中表达量是其他部位的5倍左右,推测华丽龙胆在根中可能积累了大量黄酮以提高对不良环境的适应性㊂这与黄芪(S c u t e l l a r i a v i s c i d u l a)[36]中S v F N S-Ⅱ-2在根中高表达导致药用活性成分黄芩苷含量的增加类似㊂同时在蓝紫色花色形成中有一部分取决于花青素苷与黄酮的复合作用,二者的共着色作用可以形成更纯㊁更稳定的蓝色花[10,21]㊂例如A i d a等[37]研究发现蓝色蓝猪耳(T o r e n i a f o u r n-i e r i L i n d.)中黄酮含量高于花青素苷含量时二者形成的复合物可以使蓝色更蓝,转基因康乃馨(D i a n-t h u s c a r y o p h y l l u s)[13]中发现的黄酮衍生物产生的共着色作用会导致花瓣呈淡蓝色类似㊂因此,我们认为华丽龙胆中G s F3'5'H表达产生的飞燕草素苷和G s F N S表达产生的黄酮间可能发生共着色作用使华丽龙胆的花色更蓝㊂参考文献:[1]MU J P,P E N G Y H,N I U K C.D i v e r g e n t s e e d p r o d u c t i o n r e s p o n s e s o f w h i t e a n d b l u e f l o w e r s o f G e n t i a n a l e u c o m e l a e n a (G e n t i a n a c e a e)t o w a r m i n g a n d w a t e r i 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一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。

2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。

3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。

4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。

5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。

四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。

2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。

3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。

4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。

5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。