基因克隆及克隆基因的表达

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。

三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。

四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。

（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。

（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。

2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。

（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。

（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。

3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。

（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。

（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。

2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。

3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。

六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。

基因克隆的基本原理
基因克隆是指通过技术手段复制和传递生物体的基因信息，使得新生命体具有与原生物一样的基因组成。

基因克隆的基本原理涉及以下几个步骤：
1. DNA提取：从源生物体中获取含有目标基因的DNA。

这可以通过多种方法实现，例如细胞溶解、离心、染色体提取等。

2. 载体DNA准备：选择一种外源载体（例如质粒或病毒）作为基因传递的工具。

这些载体DNA通常会被处理以使其具备接受外来基因并复制自身的能力。

3. DNA连接：将目标基因与载体DNA进行连接。

这可以通过酶切和连接的方法实现。

酶切指的是利用特定的内切酶，将目标基因和载体分别切割，然后通过连接酶将它们结合在一起。

4. 转化：将连接好的载体DNA导入目标细胞内。

这可以通过多种方法实现，例如热冲击、电穿孔、微注射等。

目标细胞内的酶系统将自动复制和表达导入的基因。

5. 筛选和分离：将转化后的细胞进行筛选，找出具有目标基因的克隆细胞。

通常会引入某种选择标记来帮助鉴定带有目标基因的细胞。

6. 培养和繁殖：将筛选出的克隆细胞进行培养和繁殖。

这样就可以得到大量含有目标基因的细胞群体或生物个体。

基因克隆的基本原理是通过将目标基因与载体DNA连接，并将其导入目标细胞中，利用细胞内的酶系统实现基因的复制和表达。

这个过程经历了多个步骤，包括DNA提取、载体DNA准备、DNA连接、转化、筛选和分离，最终得到带有目标基因的克隆细胞或生物个体。

小鼠β-actin基因的克隆表达（2）实验步骤：（1）目的基因与表达载体的连接反应：①表达载体和目的片段的酶切管号①②pGEX 4T-1 42μlPCR产物42μlBamHⅠBuffer（10×）5μl5μlBamHⅠ1μl1μlSalⅠ2μl2μl加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。

然后将酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收。

②表达载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5 μlpGEX 4T-1酶切回收产物：1 μlPfu扩增并酶切回收的片段：3μlT4连接酶：1 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。

（2）克隆载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：pMD18-T 1 μl目的片段4μllSolution Ⅰ(含连接酶和buffer) 5 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜连接。

感受态细胞的制备及转化实验目的：把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。

实验原理：所谓感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态。

关于感受态的本质说法很多。

目前主要有两种假说：1.局部原生质体化假说—细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。

2.酶受体假说—感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

DNA分子的转化过程如下：1.吸附—完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。

2.转入—双链DNA分子解链。

单链DNA进入受体菌，另一条链降解。

3.自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。

表达—供体基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。

实验步骤：（1）感受态的制备① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃ 200rpm摇菌12～1 6h。

基因克隆的一般程序
基因克隆通常包括以下步骤：
1.选择一个目标基因，并设计引物：在开始之前选择要克隆的
基因，并设计引物。

引物通常包括两个寡核苷酸序列，它们与目标基因的两端相匹配，并且在引物的末端含有限制性内切酶识别位点。

2.将目标基因PCR扩增：使用引物进行PCR扩增，从而扩增
目标基因。

PCR扩增过程中，添加限制性内切酶识别位点的
引物，则可以获得含有限制酶切割位点的PCR产物。

3.剪切PCR产物：将PCR产物用限制性内切酶进行切割，因
为PCR产物含有限制性酶切割位点，因此可以选择正确的限
制性内切酶来切割。

4.连接载体：将PCR产物和质粒（或其他载体）用T4 DNA
连接酶连接在一起。

质粒通常被用作载体，因为它们可以在细胞内稳定复制。

5.转化：将连接好的质粒导入大肠杆菌等推动器中，并将其生
长在培养基上，以让它们自我复制。

6.筛选克隆：使用蓝白斑筛选法确定哪些细菌含有转化的基因。

该方法利用质粒上的LacZ基因，这可以使含有原核素三硝基
甲酸的菌落变成蓝色，而不含此基因的细菌则是白色的。

7.确定序列：将可能的克隆 DNA 提取出来，然后将其进行测序，从而确定克隆基因的精确序列。

8.表达蛋白质：克隆基因的表达，可以用来表达蛋白质。

这可以通过让此基因插入到一个表达载体中来完成，然后将其转化至宿主细胞中，也可对其进行人工表达分析。

基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。

2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。

3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。

质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。

4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。

内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。

5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。

这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。

6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。

转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。

7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。

8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。

9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。

10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。

需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。

一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。

2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。

3. 验证目的基因的克隆是否成功。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。

三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。

2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。

3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。

4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。

5. 连接载体：线性化载体。

6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。

7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。

8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。

四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。

（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。

（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。

2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。

（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。

3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。

（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。

基因克隆的主要方法目的基因是指要研究其生物学功能的一段编码特定蛋白的DNA 序列。

在基因克隆中，首先需要利用分子生物学技术，将目的基因从染色体上分离出来，获得基因序列并构建到载体上。

一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。

正向遗传学途径以克隆的基因所表现的功能为基础，通过基因的表达产物或表型性状鉴定进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则是着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的进一步发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。

简单地说，正向遗传学是从表型变化到基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

目前，在农业生物技术领域，已经从玉米、水稻、油菜、小麦、拟南芥、烟草、番茄等多种植物与动物及微生物中克隆得到了许多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。

1.功能克隆利用蛋白质的表达和功能信息分离鉴定出未知基因的方法称为未知基因的功能克隆（functional cloning）。

功能克隆法是根据性状的基本生化特征，鉴定已知基因的功能后分离目标基因的一种方法，该法是人类采用的第一个基因克隆策略。

其基本过程为：分离纯化感兴趣的蛋白质并测定部分氨基酸序列，设计相应的抗体待用；分离可能含有该蛋白的组织，提取RNA 和mRNA 进行体外翻译，在蛋白合成过程中，加入已制备的抗体，此时正在合成的该蛋白连同其模板mRNA 一同被沉淀；用蛋白酶消化沉淀中的蛋白质得到mRNA，进行反转录得到cDNA，进行测序获得要克隆的基因编码序列。

如果用功能克隆同源基因，其基本过程为：根据已知序列制备核苷酸探针或者蛋白抗体，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用相应蛋白的抗体探针，筛选表达载体构建的cDNA 文库获得相应克隆，对选中的克隆进行测序，获得目的基因序列。

功能克隆的关键在于需要先分离出纯度高的蛋白质，测定其部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次构建cDNA 文库或者基因组文库。

克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。

克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。

2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。

这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。

3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。

载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。

在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。

这个过程被称为“重组”。

4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。

5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。

这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。

6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。

通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。

克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。