青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶基因(PdPG2)的表达分析由书妍;于瑞君;刘红霞;李红叶【摘要】柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum是储藏期柑橘腐烂病最主要的病原之一,严重影响柑橘产业的发展.已有研究表明,柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶(PdPG2)对其致病性有重要作用,PdPG2基因功能缺失突变株的致病性会下降,然而有关PdPG2基因的表达研究尚不完善.本文研究了PdPG2基因在不同条件下的表达情况,结果表明PdPG2是酸性表达基因,其表达量随着pH的升高而降低,pH为3.0时其表达量为对照条件下的10倍,pH为8.0时其表达量为对照条件下的0.36倍.柑橘果胶能够诱导PdPG2的表达,其表达量为对照的3.6倍.因此,在侵染过程中PdPG2表达的升高是由于发病部位酸化以及橘皮降解物诱导共同引起的.%Penicillium digitatum is the most important pathogen causing green mold disease of postharvest citrus.Previous studies indicated that PdPG2 played an important role in pathogenicity,and disruption of PdPG2 resulted in attenuated virulence of P.digitatum.However,the expression profiles of PdPG2 were not well characterized.In this study,we investigated the expression profiles of PdPG2.The results indicated that PdPG2 was up-regulated under acidic conditions.The expression level of PdPG2 was approximately 10 fold at pH 3.0 and 0.36 fold at pH 8.0 compared with that in the control.Pectin could induce the expression of PdPG2 and the expression level was about 3.6 fold of that in the control.These results indicated that acidic condition and pectin could induce PdPG2 expression.The decreased pH of citrus rind during infection was suitable for PdPG2 expression,and pectin might be also helpful during infection.【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2017(043)002【总页数】4页(P138-140,162)【关键词】柑橘绿霉病菌;多聚半乳糖醛酸酶;基因表达【作者】由书妍;于瑞君;刘红霞;李红叶【作者单位】大连市农业科学研究院,大连116036;大连市农业科学研究院,大连116036;大连市农业科学研究院,大连116036;浙江大学农业与生物技术学院,杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S432.1柑橘绿霉病菌引起的柑橘腐烂病是贮藏期柑橘的主要病害之一,其造成的损失通常占所有损失的90%以上,严重影响了我国柑橘的经济效益[1-2]。

蓬麓；毖簿鹱秉承学校严谨的学风与１Ｊｃ良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究Ｔ作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他八已申请学位或其他用途使用过的成果。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中１乍了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处，本人承翅一切相关责任。

论文作者签名日期：————缫护链识产衩葶隳本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在较攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。

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论文作者签名导师鞯坪蛔吼一一第四军医大学硕士学位论文缩略语ＡｍｐＢＬＡＳＴｂｐＢＳＡｃＤＮＡＤＡＢＤＥＰＣｄＮＴＰＤＴＴＥＢＥ．ｃｏｌｉＥＤＴＡＩＰＴＧＫｂＯＤＯＲＦＰＡＧＥ缩略语表英文全称ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌｂａｓｅｐａｉｒｂｏｖｉＲｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｃｏＩｌｌｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃＤＮＡａｃｉｄ３－３’ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｓＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌｅｔｈｉｄｕｍｂｒｏｍｉｄｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅ－ｔｉＣａｃｊｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ—Ｂ—Ｂ—ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｋｉｌｏｂａｓｅｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙＯｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｐｏｌａｃｒｙｌａｍｉｎｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉＳｌ中文全称氨苄青霉素基本局部相似性查询软件碱基对牛血清白蛋白互补ＤＮＡ３—３’二氨基联苯胺焦碳酸二乙酯脱氧核糖核苷三磷酸二硫苏糖醇溴化乙锭大肠杆菌乙二胺四乙酸谷胱甘肽Ｓ一转移酶异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷千碱基对光密度值开放读码框聚丙烯酰胺凝胶电泳damdoc为您倾心整理(小店)(QQ@2218108823)第霾攀蔽大学矮圭学位论文ＰＢＳＲＴ—ＰＣＲＳＤＳＴｒｉＳＰｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ磷酸盐缓冲液ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ反转录聚合酶链斌ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ反旋ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ十二烷基硫酸钠Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ三羟甲基氨基甲烷２damdoc为您倾心整理(小店)(QQ@2218108823)人ＡＬＥＸ２基因的克隆、表达与纯化及生物信息学分析硕士研究生导烬张勇炳建屡教授第四军医火举病理教研室，西安７１００３２中文摘要ＡＬＥＸ２基因（Ａｒｍｐｒｏｔｅｉｎｓｌｏｓｔｉｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｎｃｅｒｓ，Ｘｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，２），矮子ＡＬＥＸ家族戎昃，豫ＡＬＥＸ２基嚣岁｝，该家族还毯舔ＡＬＥＸｌ和ＡＬＥＸ３基阑。

松褐天牛、棉卷叶野螟泛素基因的克隆与表达的开题报告
一、研究背景和意义
松褐天牛和棉卷叶野螟是两种重要的害虫，它们能够在林业和农业生产中造成巨大的经济损失。

目前，研究表明泛素在调节昆虫生长发育、免疫、生殖等多个生理功
能中发挥重要作用，因此克隆和表达松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因，对于深入研究
其生物学特性、开发特异性杀虫剂等方面具有重要的理论和实际意义。

二、研究内容和方法
1. 克隆松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因。

通过生物信息学技术，设计引物并进行PCR扩增，克隆出松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因的全长cDNA序列。

2. 构建表达载体。

选用高表达载体pET-28a，将松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因克隆到该载体中。

3. 表达并纯化蛋白。

将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在IPTG诱导条件下进行表达，利用亲和层析柱纯化表达的松褐天牛和棉卷叶野螟泛素蛋白。

4. 常规分子生物学技术分析蛋白表达特性。

利用Western blot、SDS-PAGE等分子生物学技术分析表达的泛素蛋白的分子量、纯度等特性。

三、预期结果和意义
通过克隆和表达松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因，在分析其结构和生物学特性的同时，为研究它们的生长发育、免疫、生殖等重要生理功能提供了有力的工具和基础，为研发特异性杀虫剂提供了新的研究思路，具有广阔的应用前景和意义。

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析朱惠君;唐玉瑾;张胜平;张朝红;李琰【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(046)007【摘要】[目的]克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系.[方法]通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式.[结果]克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132 bp,ORF为741 bp,编码246个氨基酸.氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2.表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3～5倍.[结论]VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系.【总页数】8页(P139-146)【作者】朱惠君;唐玉瑾;张胜平;张朝红;李琰【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨凌712100;南京中山制药有限公司,江苏南京210046;西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S663.1【相关文献】1.葡萄耐铝毒基因MATE的克隆与表达分析 [J], 张永福;莫丽玲;徐金会;徐仕琴;裴徐梨2.金线莲呋甾皂苷26-O-β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达分析 [J], 林江波;王伟英;邹晖;戴艺民3.茶树中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(CsG6PDHs)的克隆与表达分析 [J], 王彦丁;钱文俊;王缓;李娜娜;王璐;郝心愿;王玉春;丁长庆;杨亚军;王新超4.葡萄VvSUC27基因的克隆及病原响应表达分析 [J], 吴佳鸿;黄金宝;刘梅;彭军波;乔广行;邢启凯5.小桐子磷酸葡萄糖变位酶cPGM与pPGM基因的克隆及原核表达分析 [J], 王海波;李芙蓉;杨金翠;高永;郭俊云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(１):３９￣４６ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ唐跃辉ꎬ赵雨凡ꎬ蒋心言ꎬ等.麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(１):３９￣４６.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０１.００４麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析唐跃辉ꎬ㊀赵雨凡ꎬ㊀蒋心言ꎬ㊀张英颖ꎬ㊀王㊀寒ꎬ㊀包欣欣ꎬ㊀范雨杰ꎬ㊀李㊀彤(周口师范学院生命科学与农学学院ꎬ河南周口４６６００１)收稿日期:２０２３￣０９￣０２基金项目:河南省高等学校重点科研项目(２４Ａ１８００２９)ꎻ河南省周口师范学院大学生创新创业训练计划项目(２０２２１０４７８０３８㊁２０２２１０４７８０４０)作者简介:唐跃辉(１９８５－)ꎬ男ꎬ河南许昌人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事植物基因克隆与功能研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｈｔａｎｇ２００５＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因与植物的生长和对环境胁迫的抗性密切相关ꎬ被认为是作物改良的关键因子ꎮ在本研究中ꎬ我们通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术从麻风树中克隆了１个ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因ꎬ命名为ＪｃＨＤＺ２８ꎮＪｃＨＤＺ２８基因包含１个８８２ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码１个含有２９３个氨基酸的蛋白质ꎮ氨基酸序列分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８含有高度保守的同源结构域和亮氨酸拉链(ＬＺ)基序ꎮ表达模式分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因在种子中的相对表达量最高ꎬ且盐胁迫下调该基因的表达ꎮ亚细胞定位分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因编码１个核定位蛋白ꎮ过表达ＪｃＨＤＺ２８基因增加了转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性ꎬ且在盐胁迫条件下ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥ꎬ相对电导率显著高于野生型拟南芥ꎬ非生物胁迫相关基因在转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥中的表达也显著低于在野生型拟南芥中的表达ꎮ本研究结果可以为进一步阐明ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因ＪｃＨＤＺ２８在麻风树生长发育和响应非生物胁迫中的功能提供理论依据ꎮ关键词:㊀麻风树ꎻＪｃＨＤＺ２８ꎻＨＤ￣Ｚｉｐꎻ盐胁迫ꎻ转基因拟南芥中图分类号:㊀Ｓ５１１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０１￣００３９￣０８ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ＴＡＮＧＹｕｅ￣ｈｕｉꎬ㊀ＺＨＡＯＹｕ￣ｆａｎꎬ㊀ＪＩＡＮＧＸｉｎ￣ｙａｎꎬ㊀ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ￣ｙｉｎｇꎬ㊀ＷＡＮＧＨａｎꎬ㊀ＢＡＯＸｉｎ￣ｘｉｎꎬ㊀ＦＡＮＹｕ￣ｊｉｅꎬ㊀ＬＩＴｏｎｇ(ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＡｇｒｏｎｏｍｙꎬＺｈｏｕｋｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｏｕｋｏｕ４６６００１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｇｅｎｅｓｏｆＨＤ￣Ｚｉｐｆａｍｉｌｙａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄａｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ.ＩｎｔｈｅｓｔｕｄｙꎬｗｅｃｌｏｎｅｄａＨＤ￣ＺｉｐｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ｕｓｉｎｇＲＴ￣ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄｎａｍｅｄＪｃＨＤＺ２８.ＴｈｅＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｅｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ８８２ｂｐꎬａｎｄｅｎｃｏｄｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ２９３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪｃＨＤＺ２８ｃｏｎｔａｉｎｅｄａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｈｏｍｏｌｏｇｕｓｄｏｍａｉｎａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ(ＬＺ)ｍｏｔｉｆ.ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｓｅｅｄｓꎬａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄａｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ.Ｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓａｌｓｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｗｉｌｄｔｙｐｅ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＨＤ￣ＺｉｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅＪｃＨＤＺ２８ｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒ￣ｃａｓＬ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ꎻＪｃＨＤＺ２８ꎻＨＤ￣ＺｉｐꎻｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎻｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ９３㊀㊀非生物胁迫如干旱㊁高温㊁低温㊁氧化胁迫㊁高盐等都会降低作物产量ꎬ给农业生产造成重大的经济损失ꎮ为了适应这些极端环境条件ꎬ植物在生理㊁代谢㊁形态和分子水平上进化出复杂的调控机制ꎬ通过激活或者抑制胁迫相关基因的表达使得植物在这些极端条件下能够更好地生存[１]ꎮ研究结果表明ꎬ一些转录因子如ＭＹＢ㊁ＮＡＣ㊁ＨＤ￣Ｚｉｐ㊁ＡＰ２/ＥＲＦ㊁ＷＲＫＹ㊁ｂＺＩＰ等家族成员参与调控植物生长发育和逆境胁迫的调控[１￣６]ꎮＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白是植物特异性转录因子ꎬ具有１个由６１个氨基酸组成的高度保守的同源结构域(ＨＤ)ꎬ以及１个与ＨＤ的羧基端紧密相连的亮氨酸拉链(ＬＺ)元件ꎮＨＤ负责特异性ＤＮＡ序列结合ꎬ调控下游基因的转录ꎮＬＺ元件协助ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白特异性识别目标ＤＮＡ序列ꎬ起到二聚化的作用[１ꎬ７]ꎮ植物ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子最先在玉米中被发现ꎬ编码１个涉及叶片发育的ＨＤ￣ＺｉｐＩ类的转录因子[７]ꎮ之后ꎬＨＤ￣Ｚｉｐ基因在不同的植物中被发现ꎬ并通过构建这类基因的功能缺失突变体或功能获得突变体对其功能进行了研究ꎬ结果表明ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白在植物生长发育和逆境胁迫的调控中扮演重要的角色[６￣８]ꎮ例如ꎬＴａＨＤＺｉｐｌ￣２正调控小麦花期和穗的发育[９]ꎻｏｓｈｏｘ３３突变体通过改变ＧＳ１和ＧＳ２的表达呈现出叶片衰老的表型[１０]ꎻＡｔＨＢ１２是一种潜在的关键调节因子ꎬ参与植物叶片发育的调节[１１]ꎮ除此之外ꎬ许多研究结果表明ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白也参与调节植物对非生物胁迫的响应[１２￣１３]ꎮ提高ＴａＨＤＺｉｐＩ￣５基因的表达水平增强了转基因小麦对干旱胁迫和冷胁迫的抗性[１２]ꎻ提高ＯｓＨＯＸ２４基因的表达水平增强了转基因水稻抗旱㊁抗盐能力[１３]ꎻ玉米ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因Ｚｍｈｄｚ１０通过调控干旱胁迫相关基因的表达正调控转基因拟南芥对干旱胁迫的响应[１４]ꎮ尽管许多物种ＨＤ￣Ｚｉｐ基因家族成员已被克隆并进行功能分析ꎬ然而ꎬ麻风树中参与生长发育和胁迫调控的ＨＤ￣Ｚｉｐ基因仍然有待挖掘和进一步研究ꎮ麻风树又名小桐子ꎬ由于其具有生长快㊁适应性强㊁耐贫瘠㊁耐干旱㊁耐盐碱㊁种仁含油量高等特点成为生产生物柴油的明星物种ꎬ越来越引起科学家的重视[１５]ꎮ因此ꎬ本研究拟从麻风树中挖掘响应盐胁迫的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因并对其调控的分子机制进行研究ꎬ以期为麻风树耐盐品种的培育提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与胁迫处理试验材料为麻风树自交系品种ＧＺＱＸ０４０１和拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０ꎮ选取６叶期麻风树的根㊁茎㊁叶㊁花和授粉后３５ｄ的种子进行ＪｃＨＤＺ２８基因组织特异性表达分析ꎮ盐胁迫试验ꎬ对６叶期麻风树直接浇灌１５０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＮａＣｌ溶液ꎬ选取胁迫处理０ｈ㊁２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ的第４片叶ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因序列分析麻风树ＪｃＨＤＺ２８序列和该基因在别的物种中的同源基因均来自于ＮＣＢＩ(美国国立生物技术信息中心)ꎬＪｃＨＤＺ２８在拟南芥中的同源基因来自ＴＡＩＲ数据库ꎮ采用ＤＮＡＭＡＮ９.０软件进行蛋白质氨基酸序列分析ꎮ１.３㊀ＪｃＨＤＺ２８基因亚细胞定位以麻风树叶片ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术克隆获得不含终止密码子的ＪｃＨＤＺ２８编码序列ꎬ随后将其连接到ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体构建ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ融合表达载体ꎮ将构建好的ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体和ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体通过聚乙二醇(ＰＥＧ)介导转入拟南芥原生质体细胞ꎬ在共聚焦扫描显微镜(ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８)上获得定位样品的荧光图像ꎮ聚乙二醇介导的转化和原生质体制备参照文献[１６]的方法进行ꎮ１.４㊀基因克隆与转基因植株构建以麻风树叶片ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术克隆获得ＪｃＨＤＺ２８基因的全长编码序列ꎬ测序后ꎬ将测序正确的序列连接到ｐ１３０１载体ＫｐｎＩ和ＸｂａＩ的酶切位点之间ꎬ构建３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ｐ１３０１植物表达载体ꎮ然后通过ＧＶ３１０１介导的花序浸染法将３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ｐ１３０１载体转化到拟南芥中获得转基因植株[１４]ꎮ通过潮霉素㊁β￣葡萄糖苷酸酶(ＧＵＳ)染色和ＲＴ￣ＰＣＲ确定有效ＪｃＨＤＺ２８转基因植株用于后续试验研究ꎬ以期为麻风树耐盐品种的培育提供理论依据ꎮ１.５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因植株盐胁迫分析首先用潮霉素将野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株种子消毒ꎬ４ħ暗处理２ｄ后ꎬ将拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０(ＷＴꎬ野生型)和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株种０４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期子点播到１/２ＭＳ和含有１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ的１/２ＭＳ培养基中ꎬ置于２２ħ生长间中生长(１６ｈ光照/８ｈ黑暗)ꎬ２０ｄ后观察表型ꎮ１.６㊀生理指标分析选用盐胁迫处理１５ｄ的野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株叶片进行相对电导率和脯氨酸含量测定ꎮ相对电导率的测定方法参照文献[１４]ꎬ脯氨酸含量测定方法参照文献[１７]ꎮ１.７㊀ＲＮＡ提取和定量ＰＣＲ分析ＲＮＡ采用ＴＲＩｚｏｌ试剂进行提取ꎬ采用ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆转录酶试剂盒合成第一链ｃＤＮＡꎬ具体操作方法参照试剂盒使用说明书进行ꎮ采用ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ试剂盒和ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０定量ＰＣＲ仪进行ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎮ基因相对表达量采用２－әәＣｔ方法进行计算ꎮ本研究所用引物信息见表１ꎮ表１㊀本研究所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ基因㊀㊀㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀目的ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＧＣＧＧＴＣＣＣＲ:ＣＧＡＡＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＴＧ基因表达量检测Ｐ５ＣＳ１Ｆ:ＧＣＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＴＲ:ＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡ基因表达量检测ＳＮＡＣ１Ｆ:ＧＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＡＴＧＣＲ:ＣＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡ基因表达量检测ＡｔＣＡＴＡＦ:ＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＧＲ:ＴＧＧＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡ基因表达量检测ＬＥＡ３Ｆ:ＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＣＲ:ＣＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＴＣ基因表达量检测ＪｃＡｃｔｉｎＦ:ＴＡＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＲ:ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣ内参基因ＡｔＡｃｔｉｎ２Ｆ:ＧＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＧＲ:ＡＡＣＣＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＡ内参基因ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＲ:ＴＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧ编码区序列片段克隆ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＲ:ＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣ亚细胞定位片段克隆２㊀结果与分析２.１㊀ＪｃＨＤＺ２８基因的生物信息学分析设计特异性引物ꎬ以麻风树叶ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ克隆获得ＪｃＨＤＺ２８基因编码区序列ꎬ测序并通过ＮＣＢＩ比对ꎬ结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因编码区序列(ＣＤＳ)全长８８２ｂｐꎬ编码２９３个氨基酸ꎮ我们进一步通过ＤＮＡＭＡＮ软件对ＪｃＨＤＺ２８及其与在别的物种中的同源基因的相似性进行了分析ꎬ结果表明ꎬ麻风树ＪｃＨＤＺ２８蛋白与拟南芥㊁玉米和水稻中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族成员高度同源ꎬ且均含有高度保守的ＨＤ和ＬＺ基序(图１)ꎮ２.２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因的表达模式分析为了进一步研究ＪｃＨＤＺ２８在植物生长发育中的作用ꎬ我们使用ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析了ＪｃＨＤＺ２８基因在根㊁茎㊁叶㊁花和种子中的表达模式ꎬ结果表明ꎬ在所有被检测的器官中都检测到ＪｃＨＤＺ２８的表达ꎬ且ＪｃＨＤＺ２８基因在生殖器官(花和种子)中的相对表达量较高(图２ａ)ꎮ我们进一步检测了ＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫下的表达模式ꎬ结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ的相对表达量均显著低于盐胁迫０ｈ的相对表达量ꎬ且盐胁迫２４ｈ的相对表达量相比盐胁迫６ｈ㊁１２ｈ有所提高(图２ｂ)ꎮ该结果进一步表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因也许在植物响应盐胁迫中起重要的调控作用ꎮ２.３㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白的亚细胞定位为了检测ＪｃＨＤＺ２８蛋白的亚细胞定位ꎬ我们构建了３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ融合表达载体ꎮ随后将构建好的质粒连同３５Ｓ::ＧＦＰ质粒一起转化到拟南芥原生质体细胞ꎬ在共聚焦扫描显微镜上获得定位样品的荧光图像ꎮ结果(图３)表明ꎬ３５Ｓ::ＧＦＰ质粒在所有细胞中都可以检测到荧光信号ꎬ然而ꎬ１４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＦＰ质粒只在细胞核中检测到了明亮的绿色信号ꎮ这些结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８蛋白定位于细胞核中ꎮＯｓｈｏｘ１表示水稻中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎻＺｍｈｄｚ２５表示玉米中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎻＡｔＨＢ２表示拟南芥中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎮ图１㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白质氨基酸序列分析Ｆｉｇ.１㊀ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｐｒｏｔｅｉｎａ:ＪｃＨＤＺ２８基因组织特异性表达ꎻｂ:ＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫条件下的表达模式分析ꎮ∗∗表示在盐胁迫２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ与０ｈ相比差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因表达模式分析Ｆｉｇ.２㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ２.４㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥表型分析为了进一步研究ＪｃＨＤＺ２８基因的功能ꎬ我们构建了过表达转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥植株ꎮＲＴ￣ＰＣＲ结果表明ꎬ检测到ＪｃＨＤＺ２８基因在转基因株系中高表达ꎬ在野生型中没有检测到表达(图４ａ)ꎮ表型分析结果表明ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８不影响拟南芥地上部分生长发育(图４ｂ)ꎮ开花时间统计结果表明ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因植株开花时间与野生型相比没有显著差异ꎬ表明过表达ＪｃＨＤＺ２８不影响拟南芥开花时间(图４ｃ)ꎮ这些结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因不影响转基因拟南芥地上部分的生长和发育ꎮ２.５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥盐胁迫抗性分析ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明盐胁迫抑制ＪｃＨＤＺ２８基因的表达(图２ｂ)ꎬ因此我们推测ＪｃＨＤＺ２８也许参与植物对盐胁迫的响应ꎮ为了证明这个假设ꎬ我们进２４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期图３㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白亚细胞定位分析Ｆｉｇ.３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｐｒｏｔｅｉｎａ:ＪｃＨＤＺ２８基因在野生型拟南芥和转基因拟南芥中的表达情况ꎻｂ:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株表型分析ꎻｃ:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株开花时间统计ꎮＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ图４㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥表型分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ一步检测了野生型和转基因植株对盐胁迫的抗性ꎮ我们将消毒后的野生型和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株直接点播到１/２ＭＳ和含有１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ的１/２ＭＳ培养基中生长２０ｄꎮ结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转基因拟南芥植株大小明显小于野生型拟南芥植株大小ꎬ叶片白化更严重(图５ａ)ꎬ存活率极显著低于野生型拟南芥(图５ｂ)ꎮ生理指标测定结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转基因拟南芥植株叶片相对电导率极显著高于野生型拟南芥(图５ｃ)ꎬ脯氨酸含量极显著低于野生型拟南芥(图５ｄ)ꎮ这些结果表明ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８降低了转ＪｃＨＤＺ２８基因植株对盐胁迫的抗性ꎮ２.６㊀盐胁迫条件下非生物胁迫相关基因表达为了进一步阐明ＪｃＨＤＺ２８调控拟南芥响应盐胁迫的分子机理ꎬ我们通过ｑＲＴ￣ＰＣＲ技术检测了ＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡＴＡ㊁ＬＥＡ３㊁Ｐ５ＣＳ１等胁迫相关基因的表达ꎮ结果表明ꎬ在正常生长条件下ꎬＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡ￣ＴＡ㊁ＬＥＡ３㊁Ｐ５ＣＳ１在野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥植株中的相对表达量没有显著差异ꎬ然而ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ这些基因在转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南３４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析芥植株中的相对表达量显著低于在野生型拟南芥中的相对表达量(图６)ꎮ这些结果表明ꎬ盐胁迫条件下ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８增加转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性也许是通过改变这些非生物胁迫相关基因的表达引起的ꎮａ:野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在正常生长和盐胁迫(１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)条件下的生长分析ꎻｂ:成活率分析ꎻｃ:相对电导率分析ꎻｄ:脯氨酸含量分析ꎮＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ∗∗表示在盐胁迫条件下转基因植株与野生型植株相比差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥对盐胁迫的抗性分析Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ图６㊀盐胁迫条件下相关基因的表达水平Ｆｉｇ.６㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ４４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期３㊀讨论ＨＤ￣Ｚｉｐ基因是植物特异性转录因子基因ꎬ这些转录因子基因在植物生长发育(如胚胎发生㊁分生组织调控等)和非生物胁迫(如高盐㊁干旱等)过程中发挥重要的作用[１]ꎮ尽管许多ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因在拟南芥㊁水稻和别的物种中的功能已经被阐述ꎬ但是ＨＤ￣Ｚｉｐ基因在大戟科尤其是麻风树中的研究较少ꎮ在本研究中ꎬ我们克隆了麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因(１个ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因的成员)并分析了该基因的功能ꎬ在拟南芥中超表达ＪｃＨＤＺ２８增加了转基因植物对盐胁迫的敏感性ꎮ前人研究结果表明ꎬ超表达ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因能够改变转基因植物对非生物胁迫的抗性[１２￣１５]ꎮ在水稻中ꎬ过表达ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因增加了转基因水稻对非生物胁迫的敏感性[１５]ꎮ与此相似ꎬ在本研究中ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在盐胁迫条件下的植株大小和存活率均低于野生型拟南芥ꎮ前人研究结果表明ꎬ当植物遭遇非生物胁迫的时候ꎬ其体内的一些生理指标迅速变化使得植物能够更好地应对这些极端环境条件[１２￣１４]ꎮ因此ꎬ生理指标可以用来衡量植物对非生物胁迫的抗性ꎮ相对电导率是植物遭受逆境胁迫时其细胞膜损伤程度的重要评价因子[１５]ꎮ本研究结果表明ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在盐胁迫条件下的相对电导率极显著高于野生型拟南芥ꎬ该结果进一步表明ꎬ盐胁迫对转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥细胞膜的破坏程度显著高于野生型拟南芥ꎮ脯氨酸能够用来作为稳定剂降低高盐㊁干旱等极端环境胁迫对植物的危害[１６￣１７]ꎮ本研究结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥叶片脯氨酸的含量显著低于野生型拟南芥ꎬ该结果进一步表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ脯氨酸也许是一个导致转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥具有更高敏感性的因子ꎮ以上结果进一步表明ꎬ盐胁迫对转基因拟南芥的破坏程度显著高于野生型拟南芥ꎮ除了上述生理指标外ꎬ转基因植物对盐胁迫敏感性的增加也归因于非生物胁迫响应基因的下调表达[１８]ꎮ例如ꎬＨｓｆＡ３ｓ通过降低非生物胁迫响应基因的表达增加了转基因植物对盐胁迫的敏感性[１８]ꎮ与此类似ꎬ在我们的研究中ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ一些非生物胁迫应答基因(ＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡＴＡ㊁ＬＥＡ３和Ｐ５ＣＳ１)在转基因拟南芥中的相对表达量显著低于在野生型拟南芥中的相对表达量ꎮ综上ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８降低了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性可能是因为降低了非生物胁迫相关基因的表达ꎮ本研究结果将有助于我们进一步了解ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因ＪｃＨＤＺ２８在麻风树中的生理功能ꎮ参考文献:[１]㊀ＬＩＹＸꎬＹＡＮＧＺＲꎬＺＨＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｓｏｆＨＤ￣ＺＩＰｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｌａｎｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１３:１０２７０７１.[２]㊀沈㊀丹ꎬ杨㊀莉ꎬ胡㊀威ꎬ等.柑橘胁迫响应基因ＷＲＫＹ４７的克隆与表达分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(１):１２９￣１３８. [３]㊀董舒超ꎬ凌嘉怡ꎬ赵丽萍ꎬ等.转录因子调控番茄抗旱性研究进展[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２３ꎬ５１(９):９￣１６.[４]㊀ＪＩＡＯＭＹꎬＺＨＡＮＧＪꎬＣＨＥＮＧＷＷꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡＰ２/ＥＲＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｏｆＥｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].３Ｂｉｏｔｅｃｈꎬ２０２３ꎬ１３(７):２５９.[５]㊀ＷＡＮＧＨＬꎬＣＨＥＮＧＸꎬＹＩＮＤＭꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅ￣ｓｅａｒｃｈｏｎｐｌａｎｔＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏｅｘｔｅｒｎａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＩｓｓｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２３ꎬ４５(４):２８６１￣２８８０.[６]㊀ＪＯＯＨꎬＢＡＥＫＷꎬＬＩＭＣＷꎬｅｔａｌ.Ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｓｏｆｂＺＩＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ２２(１):４￣１５. [７]㊀ＡＲＩＥＬＦＤꎬＭＡＮＡＶＥＬＬＡＰＡꎬＤＥＺＡＲＣＡꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒｕｅｓｔｏｒｙｏｆｔｈｅＨＤ￣Ｚｉｐｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ１２(９):４１９￣４２６.[８]㊀ＬＩＺＱꎬＺＨＡＮＧＣꎬＧＵＯＹＨꎬｅｔａｌ.Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ￣ｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅＨＤ￣Ｚｉｐｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒｅｇｕ￣ｌａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏａｂｏｒｔｉｏｎｉｎｇｒａｐｅｓ(ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ.)[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１８:７４４.[９]㊀ＫＯＶＡＬＣＨＵＫＮꎬＣＨＥＷＷꎬＳＯＲＮＡＲＡＪＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｈｏｍｅ￣ｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴａＨＤＺｉｐＩ￣２ｆｒｏｍｗｈｅａｔｒｅｇｕｌａｔｅｓｆｒｏｓｔｔｏｌｅｒａｎｃｅꎬｆｌｏｗｅｒｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｓｐｉｋｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｒ￣ｌｅｙ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１６ꎬ２１１(２):６７１￣６８７.[１０]ＬＵＡＮＷＪꎬＳＨＥＮＡꎬＪＩＮＺＰꎬｅｔａｌ.ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＯｓＨｏｘ３３ꎬａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｃｌａｓｓⅢｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙꎬａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａ￣ＬｉｆｅＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓꎬ２０１３ꎬ５６(１２):１１１３￣１１２３.[１１]ＨＵＲＹＳꎬＵＭＪＨꎬＫＩＭＳꎬｅｔａｌ.Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｈｏｍｅｏｂｏｘ１２(ＡＴＨＢ１２)ꎬａｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｐｒｏｔｅｉｎꎬｒｅｇｕｌａｔｅｓｌｅａｆｇｒｏｗｔｈｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１５ꎬ２０５(１):３１６￣３２８.[１２]ＹＡＮＧＹＦꎬＬＵＡＮＧＳꎬＨＡＲＲＩＳＪꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌａｓｓＩｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴａＨＤＺｉｐＩ￣５ｉｎｃｒｅａｓｅｓｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｆｒｏｓｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１８ꎬ１６(６):１２２７￣１２４０.５４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析[１３]ＴＡＮＧＹＨꎬＷＡＮＧＪꎬＢＡＯＸＸꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＨＤ￣ＺＩＰｇｅｎｅｓｉｎｐｈｙｓｉｃｎｕｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＪｃＨＤＺ１６ｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９８.[１４]ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥＡꎬＫＨＵＲＡＮＡＪꎬＪＡＩＮＭ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｈｏｍｅｏｂｏｘｇｅｎｅｓꎬＯｓＨＯＸ２２ａｎｄＯｓＨＯＸ２４ꎬａｎｄｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＨＯＸ２４ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１６ꎬ７:６２７. [１５]ＺＨＡＯＹꎬＭＡＱꎬＪＩＮＸＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｍａｉｚｅｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ(ＨＤ￣Ｚｉｐ)ＩｇｅｎｅꎬＺｍｈｄｚ１０ꎬｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｂｏｔｈｒｉｃｅａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ５５(６):１１４２￣１１５６.[１６]ＡＢＤＵＬＬＡＲꎬＣＨＡＮＥＳꎬＲＡＶＩＮＤＲＡＰ.ＢｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓ:ａｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉ￣ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ３１(１):５３￣６４.[１７]ＬＩＵＫＱꎬＴＡＮＧＹＨꎬＴＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.ＥｃｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷＲＩＮＫＬＥＤ１ｉｎｒｉｃｅｉｍｐｒｏｖｅｓｌｉｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｕｔｒｅｔａｒｄｓｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０２２ꎬ１７(８):ｅ０２６７６８４. [１８]ＷＵＺꎬＬＩＡＮＧＪＨꎬＷＡＮＧＣＰꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｌｙＨｓ￣ｆＡ３ｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃｏｎｆｅｒｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｓａｌｔｓｅｎ￣ｓｉｔｉｖｉｔｙｖｉａａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｐｒｏｌｉｎｅｃａｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙꎬ２０１８ꎬ６９(８):２００５￣２０２１.(责任编辑:陈海霞)６４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期。

拟穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表达及抑菌活性分析徐栋梁;李洁颖;彭永鹤;夏立新;刘志刚【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(000)001【摘要】从拟穴青蟹血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增编码CrusSp成熟肽的cDNA序列,克隆至pET-32a(+)表达载体中,转化至王coli OrigamiTM(DE3)中表达CrusSp蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化获得CrusSp蛋白,表达出的CrusSp 蛋白相对分子量约10.27 ku,等电点为8.54,滤纸片扩散法结果显示CrusSp蛋白抑制绿色木霉.%Hemolyph was collected from Scylla paramamosain.The total RNA extracted from the hemocyte sample was used to amplify the sequence encoding an open reading frame of a mature peptide of CrusSp by RT - PCR.The sequence was cloned into pMD18 -T vector and subjected to DNA sequence analysis.The DNA of CrusSp was isolated from pMD18 -T/CrusSp and was cloned into pET -32a( + ) expression vector to allow expression of CrusSp as a fusion protein in E.coli OrigamiTM ( DE3 ).The fusion protein could be purified effectively by His - Band resin chelating chromatography.The antimicrobial activities of CrusSp were studied by agar diffusion test.Analysis by 15％ SDS - PAGE revealed that the molecular mass of CrusSp is 10.27 ku.The antimicrobial activity revealed that CrusSp exhibited antifungal activity towards Trichoderma viride.【总页数】5页(P93-97)【作者】徐栋梁;李洁颖;彭永鹤;夏立新;刘志刚【作者单位】深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060;深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060;深圳市圣西马生物技术有限公司,广东深圳,518057;深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060;深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,广东深圳,518060【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性 [J], 彭会;刘杰;陈慧芸2.拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性 [J], 许婉芳;谢嘉华;陈慧芸3.鲢抗菌肽 Hepcidin 的基因克隆和表达及抑菌活性分析 [J], 周卫军;刘振兴;柯浩;马艳平;郝乐;徐明芳;4.鲢抗菌肽 Hepcidin 的基因克隆和表达及抑菌活性分析 [J], 周卫军;刘振兴;柯浩;马艳平;郝乐;徐明芳5.拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性 [J], 彭会;刘杰;陈慧芸;;;;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

南方农业学报　Journal of Southern Agriculture　2024，55（1）：47-56ISSN 2095-1191； CODEN NNXAABDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2024.01.005薄壳山核桃CiSPL2基因克隆、亚细胞定位及表达分析王敏1，2，席东3，莫正海1，张仕杰1，朱灿灿1*（1江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京210095；2上海市农业科学院园艺研究所，上海201403；3上海市青浦区农业技术推广服务中心，上海201700）摘要：【目的】克隆薄壳山核桃SQUAMOSA启动子结合蛋白（SPL）转录因子基因CiSPL2，并对其进行亚细胞定位及表达分析，为探究该基因在薄壳山核桃雌花发育过程的分子机制提供理论依据。

【方法】根据薄壳山核桃基因组数据，采用RT-PCR方法克隆CiSPL2基因编码区（CDS）序列，利用生物信息学软件分析其序列特征和蛋白理化性质，构建pCAMBIA1300-CiSPL2-GFP融合表达载体，瞬时转化烟草后观察荧光信号确定亚细胞定位情况。

基于转录组数据和实时荧光定量PCR检测CiSPL2基因在不同组织及不同雌花芽分化时期的表达模式。

【结果】薄壳山核桃CiSPL2基因CDS长度为1398 bp，共编码465个氨基酸残基，相对分子量为51.78 kD，理论等电点（pI）为8.28，不稳定系数为49.89，脂肪酸氨基酸指数为64.62，平均亲水性平均值（GRA VY）为-0.617，为不稳定的亲水性蛋白，含有SBP结构域（位于第183~257位氨基酸），亚细胞定位于细胞核。

CiSPL2蛋白的二级结构主要由α-螺旋（17.42%）、延伸链（13.55%）、β-转角（1.72%）和无规则卷曲（67.31%）组成。

薄壳山核桃CiSPL2蛋白与核桃JrSPL2蛋白氨基酸序列的相似性最高，为95.05%，其次是光皮桦BlSPL2蛋白，相似性为70.83%。

草酸青霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达本实验主要内容为通过提取草酸青霉(Penicillium oxalicum)S1J 1DNA与RNA,参考斜卧青霉(Penicillium decumberns)β-葡糖苷酶基因设计引物,利用PCR和RT-PCR技术分别克隆出草酸青霉β-葡糖苷酶bgl1和bgl2基因全长及cDNA。

通过测序及生物信息学分析得知bgl1基因全长2963 bp,包含5个内含子、6个外显子,编码861个氨基酸。

bgl2全长1778 bp,包含3个内含子、4个外显子,编码463个氨基酸。

将BGL1的CDS序列与pPIC9K连接后,构建重组表达载体pPIC9K-bgl1。

将线性化的表达质粒电击转化至毕赤酵母GS115中。

通过含有0.25 mg/mL G418抗性平板、含有0.25%七叶苷和0.1%柠檬酸高铁铵平板筛选后,通过菌液PCR 及以阳性转化子基因为模板PCR通过菌液PCR及以阳性转化子基因为模板PCR 验证得到阳性重组工程菌GS115-pPIC9K-bgl1。

重组菌经过1.5%的甲醇诱导表达,粗酶液通过pNPG法检测具有β-葡糖苷酶活性,酶活为0.297 U/mL。

SDS-PAGE电泳结果显示,表达产物约为97KDa。

通过响应面法优化得到最佳诱导发酵培养基配方为酵母粉12.01 g、硫酸铵16.89 g、山梨醇23.41 g、甲醇1.5%,该培养基可提高表达量19.47%。

发酵粗酶液通过冻干浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析除盐、SephadexG100层析分离后,得到纯的BGL1酶液。

BGL1酶学性质分析后,其最佳反应时间为30min,最适反应温度为50℃、最适pH为6.0,存储最佳温度为低温、最佳PH为6.0。

Ba2+离子对BGL1酶活有极大的促进作用、Cu2+离子对BGL1酶活有极大的抑制作用。