nSMase2单英光素酶报告质粒构建

双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。

37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。

一、荧光素酶报告基因的检测原理荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。

细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。

目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。

萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。

荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。

二、荧光素酶报告基因的检测流程1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。

三、荧光素酶报告基因的优点1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；4、发光检测，检测方便；5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；6、检测范围广，大于7个数量级。

荧光素酶报告基因实验原理一、引言荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，它可以用来研究基因的表达情况。

本报告将介绍荧光素酶报告基因实验的原理、步骤、优缺点以及应用。

二、原理荧光素酶（luciferase）是一种能够将化学能转化为光能的酶，它可以与荧光素底物发生反应，产生强烈的荧光信号。

在荧光素酶报告基因实验中，将荧光素酶基因与感兴趣的基因连在一起，构建成一个重组质粒。

当这个重组质粒被转染到细胞中时，只有在目标基因表达时才会产生荧光信号。

通过测量荧光信号的强度，可以间接地反映目标基因的表达水平。

三、步骤1.构建重组质粒：将荧光素酶基因和感兴趣的基因连接起来，并插入适当的启动子和终止子序列。

2.转染到细胞中：将构建好的重组质粒导入到感兴趣的细胞中，可以使用化学法、电转染法或病毒载体等方法。

3.添加底物：将荧光素底物注入到细胞培养基中，观察产生的荧光信号。

4.测量荧光强度：通过荧光显微镜或流式细胞术等技术测量荧光信号的强度，从而间接反映目标基因的表达水平。

四、优缺点优点：1.高灵敏度：荧光素酶报告基因实验可以检测非常低水平的基因表达。

2.高特异性：只有在目标基因表达时才会产生荧光信号，不会被其他非目标基因影响。

3.实时性：可以在活细胞中进行检测，观察动态变化。

缺点：1.需要构建重组质粒：需要进行DNA重组技术，操作复杂。

2.需要添加底物：需要购买和添加特定的底物，成本较高。

3.受到细胞状态和环境影响：细胞状态和环境对实验结果有一定影响。

五、应用1.研究基因调控机制：通过构建不同启动子或转录因子的荧光素酶报告基因，可以研究基因调控机制。

2.筛选药物：可以使用荧光素酶报告基因实验来筛选和评估药物的效果。

3.检测生物污染：可以将荧光素酶基因插入到细菌或病毒中，用于检测生物污染。

六、结论荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，具有高灵敏度、高特异性和实时性等优点。

它可以用于研究基因调控机制、筛选药物和检测生物污染等领域。

验证内核糖体插入位点IRES序列活性的双
荧光素酶报告系统
自查报告。

题目，验证内核糖体插入位点IRES序列活性的双荧光素酶报告
系统。

本实验旨在使用双荧光素酶报告系统验证内核糖体插入位点IRES序列的活性。

实验中使用了质粒载体，其中包含了IRES序列
以及荧光素酶基因。

通过转染该质粒到细胞系中，观察荧光素酶基
因的表达情况，从而验证IRES序列的活性。

在实验过程中，我们首先进行了质粒的构建和纯化，确保质粒
的完整性和纯度。

随后，将质粒转染到目标细胞系中，并利用双荧
光素酶报告系统检测荧光素酶的表达水平。

通过对转染细胞的荧光
素酶活性进行定量分析，我们得出了IRES序列的活性结果。

在实验结果中，我们观察到在含有IRES序列的质粒转染细胞中，荧光素酶的表达明显高于对照组。

这表明IRES序列的确具有内核糖
体插入位点的活性，能够促进荧光素酶基因的表达。

通过本次实验，我们成功建立了双荧光素酶报告系统用于验证IRES序列活性的方法，并验证了IRES序列的功能。

这为进一步研究内核糖体插入位点提供了可靠的实验手段和依据。

总的来说，本次实验取得了成功的结果，验证了内核糖体插入位点IRES序列活性的双荧光素酶报告系统的可行性和准确性。

同时也为相关领域的研究提供了重要的实验数据和方法。

在今后的研究中，我们将继续深入探讨IRES序列的功能机制，并拓展其在基因表达调控中的应用。

双荧光素酶报告基因实验步骤双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因表达、蛋白质相互作用等生物学过程。

下面将介绍双荧光素酶报告基因实验的详细步骤，希望能对您的实验工作有所帮助。

1. 质粒构建。

首先，需要将双荧光素酶报告基因构建到适当的表达载体中。

一般来说，可以选择pGL3基因表达载体，将双荧光素酶报告基因插入到该载体的多克隆位点中。

构建好的质粒可以用于转染细胞进行后续的实验操作。

2. 细胞培养。

接下来，需要选择适当的细胞系进行实验。

常用的细胞系有HEK293、HeLa等。

将选定的细胞系进行培养，直至细胞密度达到要求，可以进行后续的转染实验。

3. DNA转染。

将构建好的双荧光素酶报告基因质粒转染至培养好的细胞中。

可以选择合适的转染试剂，按照试剂说明书的操作步骤进行转染。

转染后，将细胞培养在含有适当抗性筛选剂的培养基中，以筛选转染成功的细胞。

4. 荧光素酶活性检测。

转染后的细胞需要进行荧光素酶活性检测。

首先将培养基抽取，然后加入荧光素底物，测定细胞中荧光素酶的活性。

可以使用荧光素酶检测试剂盒进行操作，按照说明书进行操作。

5. 双荧光素酶报告基因实验结果分析。

最后，根据实验结果进行数据分析。

可以通过比较不同组的荧光素酶活性来研究基因的表达水平，或者研究蛋白质的相互作用等生物学过程。

通过实验结果，可以得出相应的结论并进行讨论。

以上就是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤。

希望对进行该实验的科研工作者有所帮助，也希望大家能够在实验中取得理想的结果。

祝实验顺利！。

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。

3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。

4.掌握利用Cacl感受态细胞的方法。

25.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。

并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。

7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。

将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。

其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。

常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。

本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。

在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。

单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。

荧光素报告质粒简介荧光素报告质粒是一种常用的实验工具，用于检测基因表达或蛋白质表达水平。

该质粒可以通过转染进入细胞，并通过荧光素酶反应产生荧光信号，从而实现对基因表达的定量或定位分析。

本文将介绍荧光素报告质粒的原理、构建方法和应用。

原理荧光素报告质粒基于荧光素酶（luciferase）的反应原理。

荧光素酶是一种寄生在萤火虫体内的酶，与荧光素底物发生化学反应时，会产生可见光荧光。

荧光素底物通常为荧光素（luciferin）和辅酶A（coenzyme A）的缩合物。

荧光素报告质粒一般由多个元件构成，包括启动子、荧光素酶编码序列、转录终止子和选择标记基因等。

其中，启动子决定了荧光素酶基因的表达水平，转录终止子用于停止序列的转录，选择标记基因用于筛选质粒。

构建方法1. 荧光素酶编码序列的选择荧光素报告质粒的关键在于选择合适的荧光素酶编码序列。

常用的荧光素酶有荧光素酶A（LucA）和荧光素酶B（LucB）两种。

选择时需考虑目标细胞系是否对该荧光素酶具有高度敏感性，以及背景荧光的干扰程度。

2. 启动子的选择启动子通常选择具有目标细胞特异性的启动子，以确保荧光素酶基因的表达仅发生在目标细胞中。

常用的启动子包括强启动子CMV、EF1α等。

3. 转录终止子的设计转录终止子用于停止序列的转录，避免读入相邻基因，从而保证目标基因表达的准确性。

常用的转录终止子包括BGH终止子和SV40终止子等。

4. 选择标记基因的引入选择标记基因通常与荧光素酶基因共同构成一个转录单元，用于筛选质粒。

常用的选择标记基因有抗生素抗性基因和荧光蛋白基因等。

5. PCR扩增和质粒构建根据所选择的启动子、荧光素酶编码序列、转录终止子以及选择标记基因的序列设计引物，进行PCR扩增。

然后，将PCR产物与质粒载体进行连接，通过酶切和连接酶的作用，得到目标质粒。

最后，将目标质粒转化入适当的宿主菌中，进行培养和筛选。

应用荧光素报告质粒在基因表达和蛋白质表达研究中具有广泛的应用。

双荧光素酶基因法载体构建双荧光素酶基因法是一种常用的基因标记技术，可以在细胞或物种中标记特定基因，方便研究基因的表达和功能。

该技术将荧光素酶基因和荧光素酶底物相结合，并通过酶学反应产生强烈的荧光信号，从而实现基因标记和检测。

本文将介绍双荧光素酶基因法载体的构建方法。

1、材料双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）双荧光素酶基因调控元件载体（pGL4.32）限制酶EcoRI和XhoIT4连接酶琼脂糖PCR扩增产物模板PCR引物大肠杆菌DH5α感受态细胞2、方法1) 双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）的构建a、制备pGL4.31载体的线性质粒选取pGL4.31载体，使用限制酶EcoRI和XhoI对其进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化出所需大小的线性DNA片段。

b、连接荧光素酶基因将线性质粒与荧光素酶基因进行T4连接酶酶切和连接，构建成双荧光素酶基因报告载体。

a、PCR扩增产物的准备选择所需的基因调控元件序列作为PCR扩增产物的模板，设计一对前后引物，在PCR 反应条件下扩增所需大小的DNA片段。

a、验证载体的构建将构建好的双荧光素酶基因报告载体和基因调控元件载体进行测序验证，确定所构建载体序列的准确性。

将所构建好的载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行筛选和扩增。

通过测序验证构建的载体与所需载体相符，符合要求的荧光素酶基因法载体已构建成功。

二、结论通过双荧光素酶基因法载体的构建，成功将荧光素酶基因和基因调控元件结合构建成标记组合载体，为后续研究基因表达和功能提供了多种方法和途径，有助于深入探究生物学领域的多项研究内容。

荧光素报告基囚的构建1，PCR扩增---------------------的3' UTR模板:正常人DNA引物：pair1 41-2816nSMase2-3’utr-1-sense- GGACTAGTGCAGCCCATCCCTGGGCCA TGTCCCCTCCA nSMase2-3’utr-1-antisense- CGACGCGT TTTTCTCCTCGTTATCCA TCCTTCCTTTCApair2 39-2863nSMase2-3’utr-2-sense- GGACTAGT CTGCAGCCCATCCCTGGGCCATGTCCCCTC nSMase2-3’utr-2-antisense- CGACGCGT TA TTTTCTCCTCGTTATCCATCCTTCCTTT根据每管上标注的nmol数乘以20，计算得出所应加入的水的体积，加入相应体积的水稀释。

反应体系：反应体系体积10×buffer 2μLTaq 酶0.3μLMgCl2 1.2μLdNTP 0.4μL模板DNA 2μL上游引物1μL下游引物1μL水12.1μLStep 1: 95℃5minStep 2: 95℃30sStep 3: 50-60℃1minStep 4: 72℃30s40cycle72℃10min4℃+∞2,PCR产物纯化,琼脂糖胶电泳，切胶纯化电泳切胶回收(试剂盒为QIAquick Gel Extraction Kit,具体步骤参照具体实验所用试剂盒的说明书)1) 1.5%琼脂糖胶，TBE缓冲液，120V电压，电泳;2)在紫外灯下，用刀片将目标条带切出来，在精细天秤上称重后，加入到1.5 mL的EP管中;3)加入3倍体积的Buffer QG(胶重1 OOmg对300}L体积的buffer QG) ;4) 500C水浴10 min后，加入1倍体积的异丙醇;5)将QIA spin quick柱子置入2mL的套管中，将上述胶溶液转移至QIA spinquick柱子中，13000 rpm离心1min;6)弃去2mL的套管中的液体，在QIA spin quick柱子中加入500 }L的BufferQG; 13000 rpm离心1 min，弃去套管中的液体;7)在QIA spin quick柱子中加入750 }.L的Buffer PE;8) 13000 rpm离心1 min，弃去套管中的液体;9)在QIA spin quick柱子中加入750 }.L的Buffer PE，静置2-Smin ;10) 13000 rpm离心1 min，弃去套管中的液体;11）13000 rpm再次离心1 min;12)将QIA spin quick柱子置入一个洁净的1.S mL的EP管，在QIA spin quick柱子底的膜中央，加入20pL BufferEB，停留1 min, 13000 rpm再次离心1 min，将回收至EP管的PCR产物测量浓度。

荧光素酶质粒构建
荧光素酶质粒构建技术是一种利用荧光素酶来构建一个质粒的
新技术，它为我们构建和定制原核和真核质粒提供了有力的工具。

由于质粒的构建超过了普通的克隆技术，它也被称为合成克隆技术。

荧光素酶质粒构建的原理是在原始质粒的基础上，通过荧光素酶将一系列指定的DNA序列，经过PCR扩增后，分离出指定序列碱基变化的新质粒。

此外，质粒构建还可以通过荧光素酶和适当的酶反应来调节新质粒的结构，这极大地提高了质粒的制备速度和效率。

荧光素酶质粒构建的应用范围广泛，主要有两大类。

第一类是基因组构建，它可以应用于基因组工程，如基因合成和基因改造。

第二类是抗性分析，它可以帮助我们了解以往未知的抗性机制，从而有利于抗性基因的有效筛查和抗菌品种的选育。

此外，荧光素酶质粒构建也可以用于肿瘤治疗研究。

例如，用于肿瘤细胞上的特定基因的构建，以及抗肿瘤抗体的表达系统的构建。

这些研究都可以帮助我们了解抗癌的新机制，从而提高抗癌药物的开发效率。

由于荧光素酶质粒构建技术的出现，它使得质粒的制备变得更加简单、快速而有效。

在质粒构建领域，荧光素酶质粒构建技术已经成为一种新的标准，为我们的研究带来了极大的便利。

总之，荧光素酶质粒构建技术是一种重要的技术，它是构建原核和真核质粒的重要工具，其应用范围十分广泛。

通过质粒的构建，我们可以更好地了解不同的生物体的结构和功能，以及促进药物研发的
过程。

在未来，质粒技术将继续发挥重要作用，为研究带来更多便利，助力生命科学的发展。