双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_

双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。

37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。

一、实验目的1. 了解荧光素酶和荧光素酶报告基因系统的基本原理。

2. 掌握双荧光素酶实验的操作方法。

3. 学习如何分析双荧光素酶实验结果。

二、实验原理荧光素酶（Luciferase）是一种能够催化荧光素（Luciferin）和氧气反应产生荧光的酶。

在生物化学和分子生物学研究中，荧光素酶报告基因系统被广泛应用于基因表达和信号转导的检测。

双荧光素酶实验是利用两种荧光素酶（荧光素酶和Renilla荧光素酶）的特性来检测细胞内基因表达和信号转导。

实验中，将荧光素酶和Renilla荧光素酶的编码基因分别构建在两个不同的载体上，共同转染细胞。

荧光素酶催化荧光素产生绿色荧光，而Renilla荧光素酶催化荧光素产生红色荧光。

通过比较两种荧光的强度，可以定量地分析细胞内基因表达和信号转导。

三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞、293T细胞等。

2. 载体：荧光素酶报告基因载体、Renilla荧光素酶报告基因载体、质粒载体等。

3. 荧光素酶底物：荧光素、Renilla荧光素等。

4. 实验试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、DMSO、Trizol等。

5. 仪器：荧光显微镜、酶标仪、离心机等。

四、实验步骤1. 细胞培养：将HeLa细胞或293T细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养。

2. 载体构建：将荧光素酶报告基因载体和Renilla荧光素酶报告基因载体分别构建在质粒载体上。

3. 转染：将构建好的载体转染至细胞中，采用脂质体法或电穿孔法等。

4. 培养细胞：转染后，将细胞置于培养箱中培养。

5. 收集细胞：待细胞生长至一定密度后，收集细胞。

6. 提取细胞裂解物：将细胞裂解，提取细胞裂解物。

7. 添加底物：向细胞裂解物中加入荧光素酶底物和Renilla荧光素酶底物。

8. 酶标仪检测：将处理后的细胞裂解物置于酶标仪中，检测绿色荧光和红色荧光的强度。

9. 结果分析：比较绿色荧光和红色荧光的强度，分析细胞内基因表达和信号转导。

五、实验结果与讨论1. 实验结果在双荧光素酶实验中，通过比较绿色荧光和红色荧光的强度，可以定量地分析细胞内基因表达和信号转导。

双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_实验材料和仪器：1. 双荧光素酶系统底物：荧光素酶底物（Luciferin）和共价链接的荧光素酶底物（Coelenterazine）。

2. 荧光素酶标记的目标蛋白质：目标蛋白质的N端或C端与荧光素酶（Luciferase）基因融合。

3. 共表达的荧光素酶底物荧光素酶基因：常用的是荧光素酶2（Luciferase2，Luc2）。

4.表达目标蛋白质的载体：供慢病毒或质粒转染目标细胞。

5.反应体系：包括含有目标蛋白质的细胞或细胞组织、荧光素酶底物溶液和荧光计。

操作步骤：1.细胞培养和转染：将目标蛋白质的载体转染至目标细胞中，经过选择培养形成稳定表达目标蛋白的细胞系。

此步骤应根据目标细胞类型和实验要求进行优化。

2.收集细胞：将转染好的细胞培养至适当的数量并收集。

收集的方式因实验要求而有所差异，可以直接培养盘中收集，也可以经过离心将细胞沉淀后收集。

3.荧光素酶底物处理：加入适量的荧光素酶底物溶液至细胞悬液中，通过处理细胞后激活荧光素酶。

4.检测荧光强度：将含有荧光素酶底物的细胞悬液转移至荧光计中，通过测量荧光强度来评估目标蛋白质的表达水平和相互作用。

5.分析和解释结果：根据实验要求和荧光素酶底物的不同，可以进行数据分析和结果解释。

例如，可以通过对细胞中不同亚基的荧光强度进行比较来研究蛋白复合物的组成与结构。

实验注意事项：1.选取合适的目标细胞系和转染条件，以确保目标蛋白质的高表达和稳定性。

2.根据实验要求调整荧光素酶底物的浓度和处理时间，避免荧光饱和和快速衰减的情况。

3.在处理荧光素酶底物前，确保细胞中没有存在荧光素酶活性的底物或成分，以免影响荧光素酶底物的初始浓度和稳定性。

4.对于共表达的荧光素酶底物荧光素酶基因，可以调整目标蛋白质与荧光素酶的比例来研究不同蛋白质的相互作用。

总结：双荧光素酶系统（BRET）是一种通过荧光素酶底物的处理来研究蛋白质相互作用和表达水平的实验技术。

第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。

通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。

本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。

一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。

在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。

FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。

二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。

将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。

通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。

三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。

（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。

2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。

（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。

3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。

（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。

4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。

（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。

四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。

荧光素酶检测方法步骤一、引言荧光素酶检测方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生物医学研究、生物工程、环境监测等领域。

本文将介绍荧光素酶检测方法的步骤，包括基本原理、实验准备、检测流程以及数据分析等内容。

二、基本原理荧光素酶检测方法是一种利用荧光素酶催化荧光素底物生成荧光信号的技术。

荧光素酶是一种天然存在于某些生物体内的酶，能够将荧光素底物氧化为产生荧光的产物。

荧光素酶检测方法通过检测荧光素底物转化为荧光产物的荧光信号来定量分析样品中的荧光素酶活性。

三、实验准备1. 准备荧光素酶底物：根据实验需要选择合适的荧光素底物，常见的有荧光素、二甲基荧光素等。

2. 调配荧光素酶反应缓冲液：根据实验要求配制荧光素酶反应缓冲液，确保适宜的pH值和离子浓度。

3. 样品处理：根据实验目的，对待测样品进行处理，如提取靶标蛋白、纯化荧光素酶等。

四、检测流程1. 预处理样品：将待测样品加入适量的荧光素酶反应缓冲液中，进行预处理，以提高荧光素酶的活性和稳定性。

2. 加入荧光素底物：将适量的荧光素底物加入反应液中，使荧光素酶与底物发生催化反应，生成荧光产物。

3. 反应体系优化：根据实验需求，优化反应体系的温度、反应时间等参数，以获得最佳的荧光信号。

4. 荧光检测：使用荧光分析仪器对反应体系中的荧光信号进行检测，记录荧光强度或发射光谱。

5. 数据分析：根据荧光信号的强度或光谱特征，进行数据分析，如计算样品中荧光素酶的活性或浓度。

五、数据分析荧光素酶检测方法的数据分析主要包括荧光强度计算、活性或浓度计算等。

常用的数据分析方法有标准曲线法、内标法、比较阈值循环法等。

根据实验设计和样品特点，选择合适的数据分析方法进行结果解读。

六、实验注意事项1. 严格控制实验条件：包括温度、pH值、反应时间等，以确保实验结果的准确性和可重复性。

2. 合理选择荧光素底物和荧光素酶：根据实验目的选择合适的底物和酶，以获得最佳的检测效果。

3. 保护荧光素底物的稳定性：荧光素底物易受光照、氧化等因素影响而降解，应储存和操作时避免光照和氧气接触。

植物双荧光素酶报告基因实验步骤引言：植物双荧光素酶（dual-luciferase reporter gene）是一种广泛用于研究基因表达和调控的实验技术。

这种技术主要基于荧光素酶酶促反应原理，通过测量两种荧光素酶的活性来评估靶基因的调控效应。

本实验将详细介绍植物双荧光素酶报告基因实验的步骤。

材料：1.载体DNA：包含荧光素酶的荧光素酶基因、荧光素酶底物和载体DNA。

2.受试基因DNA：靶基因的DNA序列。

3.发光底物：用于检测荧光素酶活性的底物。

实验步骤：1.载体构建a.将荧光素酶基因和荧光素酶底物的DNA序列分别克隆到载体DNA 上，构建荧光素酶报告基因载体。

b.对构建好的载体进行测序，确认序列的准确性。

2.细胞培养a.选择合适的植物细胞系进行培养，如人类表皮细胞（HEK293细胞）或真菌菌株（酵母）。

b.在无菌条件下，将细胞培养在含有适当培养基和抗生素的培养皿中。

3.转染a.将刚构建好的荧光素酶报告基因载体和受试基因DNA利用合适的转染试剂转染至目标细胞中。

b.转染条件需要根据所选细胞系的特性进行优化，如转染剂浓度、转染时间和转染温度。

4.荧光素酶检测a.收集转染后的细胞，以适当的方法裂解细胞膜并提取细胞内的蛋白质。

b.在离心管中先加入荧光素酶底物A，然后加入荧光素酶底物B，并加入含有缓冲液的发光底物。

c.利用荧光素酶检测仪测量反应体系的发光强度。

d.记录发光强度，并进行数据统计和分析。

5.数据分析a.根据荧光素酶底物的发光强度计算荧光素酶活性。

b.根据测得的荧光素酶活性，分析靶基因的调控效应。

c.可以利用多种方法对数据进行统计学分析，如方差分析和配对t 检验。

结论：植物双荧光素酶报告基因实验是一种有效的研究基因调控的实验技术。

通过测量荧光素酶的活性，我们可以评估靶基因在特定条件下的表达水平。

这项实验可以帮助我们更好地了解基因调控机制，为相关研究提供重要的数据支持。

双荧光素酶报告实验是一种重要的生物技术手段，主要用于基因表达调控研究。

其详细原理如下：
双荧光素酶报告实验主要利用萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海洋腔肠荧光素酶（如Renilla luciferase）这两种具有不同底物和发光颜色的酶。

在实验中，Firefly luciferase和Renilla luciferase被用作报告基因，通过检测它们产生的荧光信号，可以监控和证实微观层面上的分子间相互作用。

实验开始时，将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游。

这样，Firefly luciferase的表达就会受到靶基因转录调控元件的调控，从而反映靶基因的表达情况。

同时，为了消除实验中的误差，如细胞转染效率的差异等，通常会引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参。

Renilla luciferase的表达不受靶基因的影响，因此其荧光信号可以作为实验的基准，用于校正其他因素引起的变化。

在实验过程中，给予细胞不同的处理后，裂解细胞并加入底物荧光素（luciferin）。

Firefly luciferase和Renilla luciferase能催化荧光素发出荧光，其发光强度与酶的表达量成正比。

通过检测两种荧光信号的强度，可以判断不同处理组对靶基因转录调控元件的影响。

综上，双荧光素酶报告实验通过结合萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶的特性，提供了一种高灵敏度和高特异性的方法，用于研究基因表达调控的微观机制。

双荧光素酶实验具体步骤及说明设计理念在检测一个报告基因测量结果的变化时，实验的准确性常被一些客观实验因素影响，如：细胞数目不均一、细胞代次不统一、转染效率不一致等等。

引入一个内参报告基因，以此来标定检测用报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的。

系统工作原理双荧光素酶报告系统包括两个报告基因，一个检测用报告基因A 与一个内参用报告基因B。

一般是将检测用报告基因A 序列与调控启动子序列偶连在一起，或将报告基因A 序列与待检序列串联，报告基因A 荧光强度的相对改变与偶联的调控启动子的活性或待检序列的改变相关。

内参用报告基因B 与一个组成型启动子偶联，这个启动子不受各种实验条件变化的干扰，所以报告基因B 的荧光为组成型表达，可以作为内参。

检测用报告基因A、内参用报告基因B 可以装在不同的载体上，共同转染细胞，通过这种方法，把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小。

有的载体上同时含有检测用报告基因A 和内参用报告基因B，这样使实验操作更加准确、简便、快捷。

常用载体（Promega ）实验用报告基因：pGL3 Luciferase Reporter Vectors （pGL3-Control Vector 、pGL3-Basic Vector 、pGL3-Promoter Vector、pGL3-Enhancer Vector）；psiCHECK TM Vector（psiCHECK TM -1 Vector、psiCHECK TM -2 Vector*）；pmirGLOVector*。

内参用报告基因（组成型表达海肾荧光素酶）：pRL-TK；pRL-SV40；pRL-CMV；pRL-Null。

注：psiCHECK TM -2 Vector*、pmirGLO Vector* 同时表达萤火虫荧光素酶（Firefly Lucifera se ）及海肾荧光素酶（Renilla Lucifera s e），故无需准备对照pRL 系列内参质粒，可直接进行下游双荧光素酶检测实验。

双荧光素酶报告实验细胞转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm 培养皿中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2 ml PBS洗涤
细胞两次；
2. 加入2 ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，37ºC 放置1-5 分钟；
3. 小心吸去胰酶溶液，加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml。

按5×10 5 细胞/孔的浓度接种12 孔板，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
5. 每1 OD 260 microRNA 用125 μl DEPC-H 2 O 溶解，终浓度约为20 μM；
6. 在1.5 ml EP 管中加入100 μl 无血清培养基，加入10 μl microRNA，再加入对应的双荧光报告载体1 μg，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入100 μl 无血清DMEM，加入4μl lipofectamine 2000，混匀，室温放置5 分钟后将两管混合，室温放置20 分钟；
7. 实验分组：
验证分组为：A. mimic NC+ WT；B. mimic NC+ MUT；C. miRNA + WT；D. miRNA + MUT；E. mimic NC+ miRNA PC；F. miRNA + miRNA PC，各组设3 复孔；
8. 吸去12 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入12 孔板中，混匀后，在培养箱中温育5 小时；
9. 吸弃转染液，加入500 μl 完全培养基。

37ºC 5% CO 2 继续培养24、48 小时，分别收样；
10. 所得细胞用于双荧光素酶系统检测。

双荧光素酶报告基因测定法一、引言双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因测定法是一种常用的非侵入性转录物分析方法，广泛应用于研究基因表达调控、信号传导途径和转录因子激活等生物学过程。

双荧光素酶测定法结合了荧光素酶的双荧光素酶报告基因和育像蛋白的内参基因，通过检测这两种酶的活性比例来分析目标基因的表达水平及其受到的调控影响。

本实验旨在介绍双荧光素酶报告基因测定法的原理、实验步骤和数据分析方法，以及其在科研实验中的应用。

二、原理双荧光素酶报告基因测定法基于两种荧光素酶的差异表达，分别是火萤酶（LUC）和荧光素酶（RLUC）。

在实验中，双荧光素酶质粒将目标基因的启动子或响应元件与火萤酶基因和荧光素酶基因进行融合，构建成双荧光素酶报告基因表达载体。

通过质粒转染或病毒载体介导的基因递送，将双荧光素酶报告基因载体导入细胞内，使其表达成片段性。

当目标基因的启动子或响应元件被激活，通过蛋白质结合、酶诱导或信号通路激活等途径，可导致火萤酶表达增加。

而荧光素酶则作为内参基因，保持其在不受影响的状态下稳定表达。

在此情况下，通过双荧光素酶酶活体系检测细胞总表达情况下火萤酶和荧光素酶的活性比例，从而间接反映出目标基因的表达水平及受到的调控影响。

三、实验步骤（1）细胞培养和质粒转染细胞培养：选择适当的细胞系，并按照细胞培养的常规方法进行培养和传代。

质粒转染：将双荧光素酶报告基因表达载体转染至培养好的细胞中。

一般可采用化学方法如聚乙烯亚胺转染、磷酸钙法转染或电穿孔法转染等。

（2）激活实验将细胞转染后，配置相应的实验处理组和对照组。

对照组可以设置为空缺转染、阴性对照和阳性对照等。

实验处理：对照组和处理组分别按照实验方案进行处理。

如添加激活剂、抑制剂、基因过表达、RNA干扰等。

培养时间：培养细胞至接近稳态，通常培养时间为24-48h。

（3）细胞裂解和双荧光素酶活性检测裂解细胞：用裂解缓冲液加入到细胞培养瓶内，彻底裂解细胞并悬匀。