双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_

6. 测量完毕后，请将最后检测的EP管取出后，关闭仪器。 7. 实验结果的处理与分析：采用双样本等方差 t检验进行处 理，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
四、注意事项
由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达 到室温后再进行测定。
Renilla荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配 制成工作液后长期保存。
Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反复冻融，保证每 次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20 度可稳定一 个月，在-70度 可稳定一年。
试剂保存和使用时都应避光。 为取得最佳测定效果，测定时，样品和测定试剂混合后到 测定前的时间应尽量控制在相同时间内（1-2秒）。 使用过程中切勿接触操作屏（程序会被终止或取消）。 平时尽量不要移动仪器，防止触摸屏走位。
三、操作程序与结果判定
A．检测前相关试剂配制
1. 1X PLB裂解缓冲液配制：将4×体积水或PBS加入1× 体积5X PLB裂解缓冲液。（使用前在室温平衡1X 缓冲液， 平衡需2-3 min）。 2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：将Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后， 分装，置于-20℃避光保存。（一次配好，分装成小管， 避免反复冻融），使用前将配好的LAR II从-20℃拿出，并 平衡至室温（需20-30min）。
双荧光素酶报告系统
一、概述
报告基因 (reporter gene):是一种编码可被检测的
蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容 易被鉴定的基因。 一般的，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融 合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，从而利用它 的表达产物来标定目的基因的表达调控。
二、实验原理
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣 的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly 构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞， luciferase）的上游， 适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶 活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
C．双荧光素酶检测（Promega GLOMAX）
(注：系统运行时请勿触摸操作屏)
1. 重新设定系统：Tools
Protocols
Settings
Reset
DLR-O-INJ OK
2. 双荧光素酶检测程序的设定： Run Promega Protocol
3.将50μl LAR II加入1.5ml EP管中（专用的进口EP管），取 10μl 细胞裂解液加入装有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3 次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击 “Measure” 开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。 （使用前LAR II要混匀，并平衡到室温）
刺激物处理 启动子-Luc 转染细胞 未处理对照 细胞内目的基因 的转录被激活 启动子-Luc的 启动子被激活
启动子
Luc的转录 测得的荧光值 Luc表达量
LUC
同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目 和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确 性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase） 的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转 染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验 条件变化的干扰。 在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂II (LARII)时产 生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基 因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入 Stop & Glo® 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾 荧光素酶反应，同时进行第二次测量。
在动物基因表达调控的研究中，报告基因被广泛应用。如 绿色荧光蛋白(GFP）和荧光素酶。
荧光素酶（Luciferase）：是能够催化不同底物氧化
发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶。
荧光素酶报告基因的优点
蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。 在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效 率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检 测不到背景发光。 检测快速，每个样品只需几秒钟。
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4. 测量结束后，取出EP管，再加入50μl Stop & Glo® Reagent， 吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪， 点击“Measure” 开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强 度）。（Stop & Glo® Reagent 现配现用，不能保存） 5. 记录读数: 每个样品会有3个数值：RLU1——萤火虫荧光 素酶反应强度, RLU2——内参海肾荧光素酶反应强度, Ratio——RLU1/ RLU2。一般记录Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率， 也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。
3. Stop & Glo® Reagent配制：现用现配，先将Stop & Glo® Buffer放在37度温箱中平衡至室温（15-30min），再 将1倍体积的50X Stop & Glo® Substrate加入49倍体积的将 Stop & Glo® Buffer中。
B．样品制备
1. 仔细地将生长培养基从待检细胞孔中吸出。用1XPBS漂洗 细胞2-3次。此过程必须仔细，并尽量将漂洗用PBS 吸尽 （防止细胞掉落）。 2. 24 孔板每孔加入100-150μl 1X 裂解缓冲液PLBห้องสมุดไป่ตู้覆盖细胞。 然后将24孔板置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全 裂解细胞。