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一、实验原理随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱与16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,rRNA 基因由保守区与可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,仅几十bp,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎就是16S rRNA的两倍,分子量太大,分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右,较为适合PCR扩增,又具有保守性与存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因就是16SrDNA,但就是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16S rDNA鉴定细菌,其技术路线如下:PCR实验原理即聚合酶链式反应,就是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
就是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker,溶菌酶、dNTP与E、coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE(pH 8、0)三、操作方法1、细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中,180 r/min,37 ℃培养过夜,按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术，它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分，它在所有细菌和古细菌中都存在，并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此，通过对16s rDNA序列进行测序和比对，可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的DNA，然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序准备，最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展，现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序，大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后，接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考，通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外，还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等，从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析，可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外，16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落，例如肠道菌群的研究，有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径，对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善，相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
一、 实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16SrDNA 序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5SrRNA 、16SrRNA 、23SrRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
16SrRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16SrDNA 。
5SrRNA 虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp ，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA 含有的核苷酸数几乎是16SrRNA 的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16SrRNA 相对分子量在2kb 左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16SrDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA 的过程。
是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、TaqPolymerase、DNAMarker，溶菌酶、dNTP和感受态细胞、pMD18-TVector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（）三、操作方法1.细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
(1)菌体收集：取新鲜的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃净上清，收集菌体。
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
16s rdna测序原理16S rDNA测序是一种常用的微生物多样性分析方法，通过对16S rDNA基因的测序和分析，可以揭示微生物群落的组成和结构，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16S rDNA测序的原理及相关内容。
1. 16S rDNA基因简介。
16S rDNA是细菌和古细菌的小亚基核糖体RNA基因，其序列在细菌中高度保守，但又存在一定的变异性，这使得16S rDNA成为研究微生物系统发育和分类的理想分子标记。
在细菌和古细菌中，16S rDNA一般由9个高度保守的区域（称为conserved region）和10个变异区域（称为variable region）组成，其中变异区域的序列差异较大，可用于微生物的分类和鉴定。
2. 16S rDNA测序原理。
16S rDNA测序的原理是通过PCR扩增获得16S rDNA基因片段，然后对扩增产物进行测序，最后对测序结果进行分析和解读。
首先，从样品中提取微生物DNA，然后利用通用或特异引物对16S rDNA基因进行PCR扩增，得到所需的16S rDNA片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序，通常采用Sanger测序法或高通量测序技术（如Illumina、454、Ion Torrent等）。
最后，利用生物信息学方法对测序结果进行分析，包括序列比对、物种注释、多样性分析等。
3. 16S rDNA测序分析。
在16S rDNA测序分析中，首先需要对测序结果进行质控和过滤，去除低质量序列和引物污染，然后进行序列比对和物种注释。
序列比对是将测序结果与16S rDNA数据库进行比对，找到最佳匹配的参考序列，从而确定微生物的分类和系统发育关系。
物种注释是根据比对结果，将未知序列注释为已知的微生物分类单元，如属、种等。
此外，还可以进行多样性分析，如Alpha多样性指数（反映微生物群落的丰富度和多样性）、Beta多样性分析（比较不同样品间的微生物群落差异）等。
16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，是通过测定16s rDNA基因所编码的16s rRNA的序列而得到的。
在分子生物学和微生物学领域，16s rDNA序列被广泛应用于微生物分类、微生物多样性研究和微生物系统进化研究中。
本文将从以下几个方面对16s rDNA 序列进行介绍和分析。
一、成因和结构16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，它是细菌和古细菌核糖体小亚基rRNA基因的一部分，通常有约1500个核苷酸碱基对，可由16s rRNA基因编码。
这一序列在细菌和古细菌的核糖体RNA中起着重要的作用，它能够稳定地与核糖体蛋白结合，形成核糖体的小亚基，并参与到细菌和古细菌的蛋白质合成过程中。
二、意义和应用1. 微生物分类16s rDNA序列在微生物分类中具有重要意义，通过对16s rDNA序列进行测序分析可以鉴定和分类细菌和古细菌的种属和亚属。
这是因为16s rDNA序列在不同种属和不同亚属的细菌和古细菌之间存在一定的变异，可以作为分子生物学特征用于分类鉴定。
2. 微生物多样性研究通过对环境样品中的16s rDNA序列进行测序分析，可以了解微生物裙落的组成和结构，揭示微生物在自然界的分布和多样性。
这对于研究微生物的生态学、环境适应性和生态功能具有重要意义。
3. 微生物系统进化研究利用16s rDNA序列进行系统进化研究，可以揭示细菌和古细菌的系统发育关系和演化过程，为了解细菌和古细菌的起源、多样性和进化提供重要的分子学证据。
三、研究方法1. PCR扩增通常情况下，从细菌或古细菌的DNA中提取16s rDNA序列，然后利用PCR技术进行扩增。
通过选择适当的引物和反应条件，可以特异性地扩增出16s rDNA序列，为后续的测序分析做准备。
2. 测序分析测序是获取16s rDNA序列信息的关键步骤，目前常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序。
通过测序分析，可以获得16s rDNA 序列的具体碱基序列信息，用于后续的分类鉴定和系统进化研究。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和多样性的重要技术。
它通过对细菌和古菌16s rDNA基因的测序，可以揭示微生物的分类和系统发育关系，帮助科学家更好地了解微生物在自然界中的分布和功能。
下面，我们将详细介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
首先，我们需要了解16s rDNA是什么。
16s rDNA是细菌和古菌细胞中的一个重要基因，它编码了16s rRNA，是细菌和古菌的核糖体小亚基的组成部分。
由于16s rDNA在不同的细菌和古菌中存在一定的差异，因此可以作为分类和鉴定微生物的分子标记。
通过对16s rDNA序列的测定和比对，可以揭示微生物的遗传关系和系统发育地位。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的总DNA。
接下来，利用特异性引物对16s rDNA基因进行PCR扩增，得到16s rDNA的扩增产物。
然后，对扩增产物进行测序，获取16s rDNA的序列信息。
最后，利用生物信息学方法对测得的16s rDNA序列进行分析和比对，从而揭示微生物的分类和系统发育关系。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于微生物群落结构和多样性的研究。
通过对不同环境样品中微生物16s rDNA序列的测定和分析，可以揭示微生物在不同环境中的分布和多样性，帮助科学家更好地了解微生物在自然界中的生态功能。
此外，16s rDNA测序还可以用于鉴定和分类未培养的微生物，为微生物资源的开发和利用提供重要的信息。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，可以帮助科学家揭示微生物的分类和系统发育关系，了解微生物在自然界中的分布和功能。
随着测序技术的不断发展和进步，相信16s rDNA测序在微生物学研究中会发挥越来越重要的作用，为我们认识微生物世界提供更多的信息和启示。
16s rdna测序原理16S rDNA测序是一种基于16S rRNA基因的测序方法，该方法用于研究微生物的多样性和进化关系。
16S rRNA基因存在于所有细菌和古细菌的基因组中，它具有高度保守的序列区域和变异的序列区域，可以作为鉴定和分类微生物的分子标记。
16S rDNA测序的原理是通过PCR扩增目标DNA片段，然后将扩增的DNA片段纯化，接着进行测序。
一般来说，测序过程包括DNA提取、PCR扩增、测序反应、分析和比对等步骤。
首先，在样品中提取出微生物的总DNA，包括细胞外和细胞内的DNA。
提取方法根据样品的类型和要求的纯度进行选择，常用的是酚-氯仿法或商业DNA提取试剂盒。
然后，选择适当的引物对16S rDNA进行PCR扩增。
引物的选择需要考虑到引物的特异性和适用范围，常用的引物是通用的16S rDNA引物，例如27F和1492R。
PCR扩增可以通过热循环法进行，其中包括一系列的加热、退火和延伸步骤。
接下来，对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化处理，去除PCR反应中的引物和杂质，以获得纯净的目标DNA片段。
纯化方法可以使用商业的DNA纯化试剂盒或凝胶纯化等。
然后，对纯化后的DNA片段进行测序反应，通常使用链终止法（Sanger测序）或高通量测序技术（如Illumina MiSeq或Ion Torrent）进行。
测序反应产生的测序片段将通过鉴定碱基的荧光信号或电信号来确定碱基的顺序。
最后，通过分析软件对测序结果进行分析和比对，将测序片段与已知的16S rDNA序列数据库进行比对，以识别样品中存在的微生物并进行分类和系统发育分析。
常用的分析软件包括QIIME、Mothur和MEGAN等。
16S rDNA测序方法已成为研究微生物多样性和进化关系的重要工具，其原理简单且经济高效，可以在较短的时间内获得大量的序列数据，为深入了解微生物的生态学、进化和功能研究提供了有效的手段。
16s rdna测序原理
16s rDNA测序原理是基于微生物的基因组学研究，它是
一种用于鉴定微生物物种的方法。
它以16s rDNA（核糖体rDNA）序列作为微生物鉴定的基础。
16s rDNA是一种普遍存
在于细菌和古菌核糖体中的核酸，具有一定的特殊序列，它们在不同物种之间有着显著的差异。
16s rDNA测序技术是一种利用这种序列息分析样本中微
生物组成的高通量分析技术。
它可以准确地检测到各种微生物，从而实现对样本中微生物的识别和定性分析。
细菌和古菌的16s rDNA测序可以从样品中提取16S
rDNA序列的基因序列，再利用PCR（聚合酶链反应）技术对16S rDNA序列进行扩增，然后再用测序仪对扩增的16S
rDNA序列进行测序，最后再利用计算机分析软件对测序结果
进行分析，从而得到样品中微生物的物种组成。
16s rDNA测序技术在微生物鉴定中非常重要，它是一种
快速、简便、高灵敏的方法，能够准确地识别出样品中的微生物，而不需要进行其他复杂的分析步骤，极大地提高了微生物鉴定的效率和准确性，可以用于环境监测、食品安全检测、医学检测等方面。
16s rDNA测序技术同时也可以用于微生物群落的多样性研究，可以检测样品中微生物种群的多样性，以及不同微生物之间的相互作用，为生态学研究提供重要的息。
总之，16s rDNA测序技术是一种灵敏、可靠、准确的微生物鉴定技术，它可以用于微生物的鉴定和多样性研究，为环境监测、食品安全检测、医学检测等方面提供重要的息，发挥着重要的作用。
一、实验原理
随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：
PCR实验原理
即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂
PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）
三、操作方法
1. 细菌基因组总DNA的提取
接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
(1)菌体收集：取1.5 mL新鲜的菌液于EP管中，12000 r/min离心30 s，弃净上清，收集菌体。
(2)辅助裂解：加100 μg/mL溶菌酶50 μL，37 ℃处理30min。
(3)裂解：向每管加入200 mL预冷的SDS裂解缓冲液，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。
(4)向每管加入66 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀后，12000 r/min离心10 min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。
(5)将上清转移到新EP管中，加入等体积的Tris-饱和酚，充分混匀，12000 r/min离心3 min，进一步沉淀蛋白质。
(6)取离心后的水层，加等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），充分混匀后，12000 r/min离心3 min，去除苯酚。
(7)小心取上清，用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，13000 r/min离心15 min，弃上清。
(8)用400 μL75%的乙醇洗涤沉淀2次。
(9)室温干燥后，用40 μL 1×TE溶解DNA。
(10)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。
(11)提取的基因组总DNA-40 ℃冰箱保存备用。
2. PCR扩增细菌的16S rDNA
(1)16S rDNA的PCR引物：采用细菌的通用引物27F和1492R
(2)PCR反应体系为（20μL）：灭菌蒸馏水8.9 μL，
10×buffer 2 μL，
10 mmol/L dNTP 0.4 μL，
27F和1492R引物各 4 μL，
DNA模板0.5 μL，
Taq polymerase 0.2 μL。
(3)PCR反应条件：
93 ℃预变性5 min、94 ℃变性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s，循环30次，72 ℃延伸7 min。
(4)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
3. PCR扩增目的片断的纯化
通过PCR扩增出大量的目的片段，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的条带的胶块装入1.5 mL的EP管中，用B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收DNA，操作按说明书进行，方法如下：
(1)加入700 μL溶胶液，55 ℃水浴溶胶，其间偶尔摇动，直至胶块全部溶解。
(2)将溶胶液转移至吸附柱中，12000 r/min离心30 s，重复一次，提高回收率。
(3)向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 r/min离心30 s，倒掉废液，重复漂洗一次。
12000 r/min离心2 min以完全去除漂洗液。
(4)将吸附柱移至一个干净的1.5 mLEP管中，向吸附柱膜中央加入40 μL的洗脱缓冲液，12000 r/min离心2 min收集DNA。
(5)回收DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 16S rDNA目的片断的克隆
PCR纯化产物与pMD18-T载体连接体系（10 μL）：胶回收产物2 μL，pMD18-T载体1 μL，SoulutionⅠ5 μL，无菌去离子水2 μL，16 ℃连接4 h。
转化E. coli JM109
(1)取50 μL E. coli JM109感受态细胞于冰中融化。
(2)将5 μL连接产物加入到已融化的感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30 min。
(3)42 ℃保温90 s。
(4)冰浴2~3 min。
(5)加入450 μL LB液体培养基，轻轻混匀，200 r/min，37 ℃培养40 min。
(6)取适量上述培养液均匀涂布在Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上，37 ℃培养过夜。
5. 转化子的筛选和鉴定
（1）重组菌株的菌落PCR
通过蓝白斑筛选阳性转化子，用灭菌的枪头将白色菌落接种至4 mL LB液体培养基中，200 r/min，37 ℃培养4 h。
取菌液作为PCR模板。
PCR反应体系（20 μL）：灭菌蒸馏水7.4 μL，10×PCR buffer（含15 mmol/L MgCl2）2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，2.5 μmol/L的上游和下游引物各4 μL，菌液2 μL，5 U/μL Taq polymerase0.2 μL。
PCR反应条件：93 ℃预变性5 min、94 ℃变性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s，循环30次，72 ℃延伸7 min。
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
（2）重组质粒的核苷酸序列的测定
对经过鉴定含有目的片断的单克隆菌液加入甘油-40 ℃保存，同时将同一单克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，将测得的序列提交GenBank数据库，根据测序结果，用BLAST搜索软件在NCBI （/）的GenBank数据库中调出相似性较高的16S rDNA基因序列，用ClustalX 1.81软件进行多序列比对，用Phylipwx软件包中的Seqboot，Dnapars和Consense进行同源性分析并构建系统发育树。
四、实验结果提交
鉴定菌株的序列与哪个种最匹配，并构建该菌株的系统进化树。
