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doi:10.16736/41-1434/ts.2021.06.055不同蔬菜中氟虫腈及其代谢物检测方法的确定与比较Determination and Comparison of Detection Methods of Fipronil and ItsMetabolites in Different Vegetables◎ 周玉春1，滕玉娇1，王少龙1，刘 慧1,2，李其亮1，谢文东1，孙娅娜1，黄 华1（1.北京市产品质量监督检验院，北京 101300；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）ZHOU Yuchun 1, TENG Yujiao 1, WANG Shaolong 1, LIU Hui 1,2, LI Qiliang 1, XIE Wendong 1, SUN Yana 1, HUNANG Hua 1(1.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute, Beijing 101300, China;2.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)摘 要：本研究建立了气相色谱-质谱联用仪测定氟虫腈及其3种代谢物的方法，并对比了不同固相萃取柱对氟虫腈及其代谢物回收率的影响。
结果表明，仪器方法选用DB-5MS 毛细管柱（30 m ×0.25 mm ×0.25 μm ），气相色谱-质谱联用仪带负离子化学源（NCI ），最终确定氟甲腈选择监测离子为（m /z ）352，353，354；氟虫腈砜选择监测离子为（m /z ）383，347，416，385；氟虫腈亚砜选择监测离子为（m /z ）384，385，386；氟虫腈选择监测离子为（m /z ）366，333，368，400。
一种禽蛋中氟虫腈及其代谢物残留的快速提取及净化方法
随着我国禽蛋产品在国际市场上的进出口量越来越大，对检测禽蛋中氟虫腈及其代谢
物残留的要求也愈加严格。
为此，快速提取和净化禽蛋中氟虫腈及其代谢物残留是亟待解
决的技术问题。
传统的提取和净化方法，如气相色谱/质谱（GC-MS）和液相色谱/质谱（LC-MS），虽
然准确、高效，但实施困难，耗时较长，且技术复杂，操作繁琐。
为此，在最近几年提出
了快速提取和净化禽蛋中氟虫腈及其代谢物残留的新技术方法。
其一，试剂比色法是容易操作、装置简单的快速提取方法。
实验仪器准备好，将检测
样本置入到多功能电极单元中，并与待测物质反应，形成物质比色反应，然后在比色仪中
读取反应结果，进行定量分析，实验简单、无需预处理和分离技术。
其二，分离电泳法也是一种快速提取的方法，采用两步分析进行处理：分离禽蛋中受
试物以及氟虫腈和其代谢物残留；基于分子量，对受试物和氟虫腈进行电泳纯化，实现对
受试物残留禽蛋中氟虫腈及其代谢物成分的净化。
此外，还有一种介孔树碳快速吸附-树碳多层表面特性吸附（MSPD）技术分析方法，
该方法结合过滤技术和吸附技术，然后使用气相色谱/质谱进行分析，此方法有效、快速，并且具有活性离子和抗腐蚀的特点，同时可以提升样品的检测准确度。
总的来说，对检测禽蛋中氟虫腈及其代谢物残留，虽然传统的GC-MS和LC-MS技术准
确可靠，但是实施较为复杂，耗时长。
而最近几年提出的新技术方法，如试剂比色法和分
离电泳法以及MSPD技术方法，不仅可以快速提取和净化，具有简单操作、成本价低、容
易控制和无污染等优点，对检测禽蛋中氟虫腈及其代谢物残留具有重要意义。
QuEChERS-气相色谱-三重四极杆质谱法测定不同基质中氟虫腈及其3种代谢物残留量陈 浩（常德市食品检验所，湖南常德 415000）摘 要：建立了气相色谱-串联三重四极杆质谱仪测定大米、茶叶、油麦菜和柑橘中氟虫腈及其3种代谢物残留量的方法。
使用改良后的QuEChERS 前处理技术进行样品的提取净化，结合GC-MS/MS 检测，内标法定量。
结果表明，在0.005～0.800 mg·L -1，4种不同基质中氟虫腈及其3种代谢物均呈现良好的线性关系，相关 系数R 2＞0.996。
氟虫腈及其3种代谢物在4种不同基质中均存在不同程度的基质增强效应，在0.01 mg·kg -1、0.05 mg·kg -1、0.10 mg·kg -1 3个添加水平下，氟虫腈及其3种代谢物的平均回收率在88.3%～102.5%，相对标准偏差在2.6%～7.7%，方法定量限在0.5～1.0 μg·kg -1。
该方法操作简单、灵敏、准确，适用于大米、茶叶、蔬菜水果中氟虫腈及其代谢物的快速测定。
关键词：QuEChERS ；气相色谱-串联三重四极杆质谱法；氟虫腈；代谢物Determination of Fipronil and Its Three Metabolites in Different Matrices by QuEChERS Coupled with Gas Chromatography-Triple Quadrupole Mass SpectrometryCHEN Hao(Changde Institute for Food Control, Changde 415000, China)Abstract: A gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry method has been established for the determination of fluconazole and its three metabolites residues in rice, tea, rapeseed, and citrus. The improved QuEChERS pre-treatment technology was used for sample extraction and purification, combined with GC-MS/MS detection and internal standard quantification. The results showed that within the concentration range of 0.005～ 0.800 mg·L -1, there was a good linear relationship between fipronil and its three metabolites in four different matrices, with a correlation coefficient of R 2＞0.996. Flufenitrile and its three metabolites exhibited varying degrees of matrix enhancement effects in four different matrices. At three levels of addition of 0.01 mg·kg -1, 0.05 mg·kg -1 and 0.10 mg·kg -1, the average recovery rates of flufenitrile and its three metabolites ranged from 88.3% to 102.5%, with a relative standard deviation of 2.6% to 7.7%, and the quantitative limit of the method is 0.5～1.0 μg·kg -1. The method was found to be simple, sensitive, accurate and suitable for the rapid quantitative analysis of fipronil and its metabolites in in rice, tea, vegetables and fruits.Keywords: QuEChERS; gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry; fipronil; metabolite作者简介：陈浩（1987—），男，湖南常德人，硕士，工程师。
百足之虫-氟虫腈简析氟虫腈，英文通用名为fipronil，商品名Regent锐劲特，化学名称(RS)-5-氨基-1-(2，6-二氯-a，a，a-三氟-对-甲苯基)-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈，其化学式为：氟虫腈是由法国罗纳-普朗克公司开发，获中国专利授权（CN08643），该化合物已在2006年12月19日到期。
氟虫腈于1993年进入美国市场，1994年引入中国。
其在2006年全球销售额为4.2亿美元。
但是因为对蜜蜂的毒性和负面新闻的报道，2004年在法国已暂停登记，2008年意大利停止登记，2009年中国停止登记。
巴西公司Ourofino的阿根廷子公司Ourofino Agrociencia 2016年在大豆、玉米、棉花和豆类作物上登记了Terra Fort。
目前氟虫腈主要的应用领域是在谷物上用于种子处理。
由于其蜂毒以及毒鸡蛋事件的报道，导致世界各国的逐渐禁用，氟虫腈近年来增速缓慢平稳，近几年全球销售额保持在4.5-5亿美元之间。
加速氟虫腈禁用步伐的毒鸡蛋事件2016年荷兰部分禽类养殖业采用氟虫腈作为禽类寄生虫杀灭剂，广泛应用于养殖场中，导致鸡蛋中检测出氟虫腈，这是荷兰近年来所发生的最严重的一起食品安全事件。
“毒鸡蛋”风波的复杂性还在于，荷兰是欧洲禽类产品主要出口国，有许多国家进口荷兰鸡蛋，还有许多国家的农场使用“鸡之友”杀虫服务，而该公司可能从2016年6月起使用的抗虱杀虫剂中就含有氟虫腈。
此次“毒鸡蛋”风波将使荷兰家禽养殖业遭到重创，直接经济损失将达到数百万欧元。
而对于氟虫腈，使其应用状况更加雪上加霜。
由于其高蜂毒和鱼毒，我国已经禁用2009年2月，农业部、工业和信息化部及环境保护部发布第1157号公告规定，除卫生用、玉米等部分旱田种子包衣剂和专供出口产品外，停止受理和批准用于其他方面含氟虫腈成分农药制剂的田间试验、农药登记和生产批准证书；撤销已批准的用于其他方面含氟虫腈成分农药制剂的登记和（或）生产批准证书，并于2009年10月1日起，在我国境内停止销售和使用。
氟虫腈引发的毒鸡蛋风波：氟虫腈是什么东东？近期，荷兰、德国下架了一批鸡蛋，因为荷兰食品安全部门在鸡蛋中检测出高浓度的杀虫剂氟虫腈。
氟虫腈是一种苯基吡唑类杀虫剂，被广泛应用于农作物杀虫、动物健康等用途。
本文简单介绍氟虫腈的基本性质和已有的毒理学资料。
毒鸡蛋风波2017年7、8月，荷兰、德国各大超市纷纷下架一批鸡蛋，荷兰政府也在本国、德国和比利时紧急召回数百万枚鸡蛋。
此次紧急召回，是由于荷兰食品安全部门在147家农场的鸡蛋中检测出杀虫剂氟虫腈，经调查与荷兰一家为农场提供杀虫服务的公司有关。
本次事件是一次严重的公共卫生事件，食品安全再次引起人们的关注。
氟虫腈（fipronil），CAS号120068-37-3，化学结构式见图1，相对分子质量437.15，是一种广谱的苯基吡唑类杀虫剂。
图1 氟虫腈化学结构式1987年，氟虫腈由原法国罗纳-普朗克公司研发上市，1993年进入中国市场。
应用范围广泛，可作为多种作物的杀虫剂，对耐菊酯类、氨基甲酸酯类农药的害虫也有高敏感性。
氟虫腈还可用于杀灭猫、狗身上的跳蚤和虱等寄生虫。
其作用机制是与昆虫的γ-氨基丁酸（GABA）受体结合，阻断GABA控制的氯离子通道，干扰中枢神经系统，导致昆虫神经和肌肉兴奋过度至死亡。
安全管理在全球化学品统一分类和标签制度的危险性分类中，氟虫腈被划分为危险品——吞食有害、皮肤接触有害、吸入可致死、长期接触会对器官造成损伤，对水生生物毒性较大。
美国国家环境保护局（USEPA）基于大鼠的慢性毒性/致癌性研究，提出氟虫腈的最大无作用剂量（NOEL）为0.019 mg/（kg·d），在1998年提出的参考剂量（RfD）是0.0002 mg/（kg·d）。
欧洲食品安全局（EFSA）在2006年推荐的氟虫腈的每日允许摄入量（ADI ）为0.0002 mg/kg，急性参考剂量（ARfD）为0.009 mg/kg，我国在《食品安全国家标准——食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2016）中推荐的ADI也为0.0002 mg/kg。
河南农业2019年第2期（上）随着人们物质生活和文化生活水平的提高，辣椒作为一种低脂肪的健康辛香食品备受人们喜爱，从而有力地促进了辣椒的快速发展和辣椒需求量的不断增加。
由于农户在种植过程中忽视对农药的正确、合理使用，农药超标现象逐年增加。
为保障人们的身体健康，有效控制农药在辣椒生产中的使用和对其残留量进行监控，大力开展农药残留检测技术特别是相关的前处理技术定的毒性，有的毒性甚至高于母体。
一、试验部分（一）主要仪器、试剂与材料1.主要仪器。
液相色谱-串联质谱联用仪，配有电喷雾离子源（美国AB 公司 QTRAP5500）；高速1234510959510100.011577.1100.20.20.20.20.20.2905590901234氟虫腈氟甲腈氟虫腈硫醚氟虫腈砜453.8/436.7 453.8/368.0387.0/351.0 387.0/282.0419.0/383.0 419.0/262.0451.0/282.0 451.0/244.04015101332；1715；3111；3527；450.0080.0940.0140.0096.386.326.416.45453.8/436.7387.0/351.0419.0/383.0451.0/282.015 000 r/min1 min，放入氯化钠的具塞量筒中，mL，盖上塞子剧烈min，在室温下静置20 min，使乙腈相和水相分层。
从上述具塞上层液于复合柱净化管中，混匀器混匀；于8000 r/min，从净化管中准确离心管中，的超纯水，在河南农业2019年第2期（上）氟甲腈氟虫腈硫醚氟虫腈砜9.7×10-71.0×10-67.8×10-70.005~0.0450.005~0.0450.005~0.0450.005~0.045y = 7.222 45e7 x + 3.388 15e4 y = 1.064 05e7 x + 191 5.082 71 y = 6.055 71e7 x + 224 77.624 75 y = 2.257 23e8 x + 1.603 68e5 0.999 830.999 380.998 53mL、0.045 ug/mL系列溶液，经液质联用仪分析测定，检测各个浓度的峰面积。
摘要本论文从不同溶剂（正己烷、乙腈、乙酸乙酯）提取、不同的提取方式（匀浆、超声、振摇）、不同的净化方式（Flotisil硅酸镁、NH2、GCB、PSA、C18）等方面对回收率的影响得出以下主要结果。
1、通过溶剂（正己烷、乙腈、乙酸乙酯）对氟虫腈及其代谢物的分析选择乙腈作为最佳提取溶液。
2、考察不同提取方式（匀浆、超声、振摇）对氟虫腈及其代谢物的提取分析选择振摇样品30min为最佳提取方式。
3、根据几种不同的固相萃取柱的作用不同，选择使用Flotisil（硅酸镁）萃取柱进行净化为最佳的净化方式。
4、根据氮吹温度（65~70℃、70~75℃、75℃以上）回收率比较，及氟虫腈及其代谢物性质选择最佳温度为60~70℃。
建立了一种快速提取、净化、使用超高效液相色谱-质谱串联联用（UPLC-MS/MS)对氟虫腈及其代谢物的新方法。
用乙腈作为提取液提取，置于摇床上振摇30min，经过Flotisil （硅酸镁）净化后，使用UPLC-MS/MS仪器的MRM进行分析。
回收率在70~110%之间，相对标准偏差为6.5%，小于10%。
关键词：UPLC-MS/MS；氟虫腈及其代谢物；农药残留；AbstractIn this paper, from different solvents (normal hexane, acetonitrile, ethyl acetate extraction, different extraction methods (homogenate, ultrasound, vibration wave), different purification (Flotisil magnesium silicate, NH2, GCB and PSA, C18) on the recovery rate of the main results are as follows.1) through the analysis of the solvents (hexane, acetonitrile, ethyl acetate) to the analysis of the choice of acetonitrile as the best extraction solution.2) the extraction of different extraction methods (homogenization, ultrasound, vibration) on the extraction and analysis of fluoride and its metabolites were selected as the best extraction method of 30min.3) according to the different role of several different solid phase extraction column, choose to use Flotisil (magnesium silicate) extraction column for the best purification method.4) according to the nitrogen blowing temperature (65~70 degrees C, 70~75 degrees C, above 75 degrees) recovery rate, and the nature of the fluorine and its metabolites to select the best temperature for 60~70.A new method for the rapid extraction, purification and the use of ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) for the detection of fluoride and its metabolites was established. With acetonitrile as extraction liquid extraction, placed in bed shaking for 30 min, after purification Flotisil (magnesium silicate) using UPLC-MS / MS instrument of MRM analysis. Recovery rate in 70~110%, the relative standard deviation is 6.5%, less than 10%.Key words: UPLC-MS/MS; fluorine; cyanide and its metabolites; pesticide residues;目录摘要 (I)Abstract (II)目录 (III)第1章绪论 (1)1.1研究背景 (1)1.2研究目的及意义 (1)1.2.1研究目的 (1)1.2.2研究意义 (2)1.3本章小结 (2)第2章文献综述 (3)2.1农药残留的现状及危害 (3)2.1.1农药的影响 (3)2.1.1.1对环境的影响 (3)2.1.1.2对农药使用者的影响 (3)2.1.1.3食物中的农药残留 (3)2.1.2农药的分类以及危害 (3)2.1.2.1有机磷农药 (3)2.1.2.2有机氯农药 (4)2.1.2.3氨基甲酸酯类农药 (4)2.1.2.4拟除虫菊酯类农药 (4)2.2超高效液相色谱-质谱/质谱联用技术（UPLC-MS/MS)概述 (4)2.2.1UPLC-MS/MS的原理与特点 (5)2.2.2 UPLC-MS/MS技术的展望 (5)2.3氟虫腈及其代谢物概述 (5)2.3.1氟虫腈及代谢物简介 (5)2.3.2氟虫腈及其代谢物在环境的归趋 (6)2.3.2.1 氟虫腈在水体中的降解 (6)2.3.2.2氟虫腈在土壤中的环境行为 (7)2.3.3.3氟虫腈毒性作用机理 (7)2.4 果蔬样品前处理技术 (8)2.4.1固相萃取 (8)2.4.1.1固相萃取法概述 (8)2.4.1.2固相萃取法的基本原理和方法 (8)2.4.2 Qu ECh EＲS 方法(分散固相萃取) (8)2.4.2.1QuEChERS方法概述 (9)2.4.2.3 QuEChERS方法原理 (9)2.4.2.3 QuEChERS方法的优点 (9)2.4.3液相微萃取 (9)2.4.3.1液相微萃取概述 (9)2.4.3.2液相微萃取的特点 (10)2.4.4固相微萃取（SPME） (10)2.4.4.1固相微萃取（SPME）概述 (10)2.4.4.2固相微萃取（SPME）原理 (10)2.5本章小结 (10)第3章实验材料与方法 (11)3.1药品及试剂 (11)3.2仪器设备 (12)3.2.1仪器条件 (13)3.2.1.1液相色谱的分离条件 (13)3.2.1.2质谱的分离参数 (14)3.3试验方法 (15)3.3.1单一农药标准品配制 (15)3.3.2 实验流程 (15)3.4本章小结 (16)第4章结果与分析 (17)4.1提取试剂的选择 (17)4.2固相萃取柱选择 (17)4.2.1固相萃取柱概述 (17)4.2.2固相萃取柱的种类 (17)4.2.2.1以硅胶为基质的固相萃取柱 (17)4.2.2.2以高聚物为基质的固相萃取柱 (18)4.2.2.3以无机材料为主的固相萃取柱 (18)4.2.3各种固相萃取柱的净化效果与选择 (18)4.3氮吹温度的选择 (19)4.4提取方式的选择 (19)4.4.1超声波提取法的原理及其优缺点 (19)4.4.2匀浆提取法的原理及其优缺点 (20)4.4.3振摇提取法的原理及其优缺点 (20)4.5纯混标与基质标（柑橘、番茄、菜心）峰面积的比较 (20)4.5色谱条件优化 (21)4.6质谱条件的优化 (23)4.7方法验证 (23)4.7.1线性范围和检出限 (23)4.7.2添加回收试验 (24)4.8本章小结 (25)结论 (26)参考文献 (27)致谢.................................................................................................................. 错误!未定义书签。
第1章绪论1.1研究背景农药，是如今的农业发展中主要用于防止病、虫与杂草对作物危害不可少的一种特殊物质，它对提高农作物产量具有非常关键的作用。
而伴随着全球农业科技的快速发展与进步，农药的种类与数量也随之不停的增长，化学农药的施用已经逐渐成为预防以及治理病虫害的一种常用方法。
农药被施加到农作物之后，大部分的农药会因为多种其他的原因而被转化，但是作物内部仍然残存着少部分的农药试剂。
人类假如经常性的食用含农药超标的农作物，会严重的损害了人体健康，而这也正是农药试剂残留量问题的缘由。
而在这几年里，因为有不少的农户忽略了对化学农药试剂的正确使用，而使农药残留以及污染问题、状况常常发生；农药的残留量不仅严重超标，而且每一年还有不断增加的倾向。
同时，伴随着种植以及栽培技术的不断创新，农残这一个问题将会变得更加严峻，而这也将会对人类的生命健康构成非常严重的潜在危害与威胁。
农药残留,也就是指：当农药于使用后的一段时间里面，由于没能够被分解而残留于农作物、收获物、生物体以及土壤亦或者大气里的少量农药原体、有毒有害代谢物质、降解物以及杂质在内的一个总称[1]。
被使用在作物中的农药，有一部分会依附在作物上，而一部分又就会散落于土壤、水体以及大气当中；而残留于环境中的农药，又会有一少部分被各种植物所吸收；它们可以直接借助植物蔬果、水体抑或者大气而进入到人体以及禽畜的体内；又或者通过庞大的食物链的流动，最终都会进入到人体以及禽畜体内。
其中氟虫腈作为一种新型农药已被广泛推广使用于各种农作物和蔬菜。
1.2研究目的及意义1.2.1研究目的随着农产品的需求量的增长，为了促进农产品的收成，农药的使用越来越普及、广泛。
其中农药的残留、生态污染、储存和加工过程的污染以及病原体已经成为了食品安全问题最为关键的影响因素。
然而农药的残留不仅仅对于人类的生命健康还带给动植物极大的影响，危害生命健康。
解决农残问题是保障农业产品的食品安全、提高农产品品质的关键。
