差异显示RT-PCR技术在我国毒理学研究中的应用第27卷第1期!生月赣南医学院JOURNALOFGANNANMEDICALUNIVERSITY,0Z.27Ⅳ0.1FEB.溯差异显示RT—PCR技术在我国毒理学研究中的应用胡恭华,罗江洪,李舒梅(赣南医学院预防医学教研室,江西赣州341000)巾躅分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1001—5779(2007)01—0158—03高等生物大约有10万个不同的基因,但只有15%的基在任何个体的细胞中都表达.基因表达是调节细胞生物学行为的陔心,因为它决定了生命过程中的许多重要环节,如:细胞增殖,分化,应激,细胞周期的调节以及细胞凋亡等.探讨处于不同作用条件下细胞内基因表达上的差异,有利于人们了解生命现象的本质,从而找到疾病发生的根源.因此.如何使用高效的技术手段来鉴别,分离基因以及寻找到新基因,一直是生命科学关注的热点.传统的基因分离方法主要有扣除杂交和差异杂交等技术.虽然用这些技术已成功分离出许多重要的基因,但是由于存在着操作复杂,耗时和重复性差等缺点,因此在应用中受到了限制.而差异显示RT～PCR技术克服了这些缺陷,为检测基因的表达差异提供了一种新的途径.目前毒理学已将该技术应用于外源物作用后应激基因的筛选和分离以及毒性作用分子机理的研究,并取得了一些重要的成果.为此,笔者主要就差异显示RT—PCR技术的基本原理,特点及其在我国毒理学研究中的应用作一阐述.1基本原理和操作步骤差异显示RT—PCR(Differentialdisplayreversetranscrip? tiou—polymcrasechainreaction)是由哈佛大学的LiangPeng 在1992年建立起来的一种筛选和克隆受机体内外各种因素影响下差异表达基因的方法.该技术通过基因表达产物mRNA的差异来了解基因的表达情况,从而获得不同类型细胞及处于不同功能状态或不同环境下的同类细胞基因表达的差异.它是以分子生物学上广泛应用的两种技术RT—nR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的.其基本原理为:根据真核细胞巾mRNA均含有poly(A)末端的特点,合成两组引物其中,3'端锚定引物设计成T12MN(N代表4种碱基中的一科I;M为A,G和C三种碱基中的一种,但不能为T),共有l2种引物.5'端引物设计成20条随机引物,每条引物由10个碱基组成.实验证明,至少20种随机引物,可以覆盖所有t~DNA.这样,即使获得很少的总RNA,也可以扩增到足够的带有完整信息的cDNA.将基因背景相同的两个或多个细胞系或组织总RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA,接着用桶宜的3'端引物和5'端随机引物进行PCR扩增,每对引物能扩增50～100个mRNA片段,然后对扩增产物进行凝驳电滚稍放射自显影,通过对X光胶片上的自显影条带进行比较,郾可发现不同细胞或不同处理组细胞中差异表达的基嘲片段.弭从凝胶上回收差异表达的cDNA片段并用相同条件再次扩增,产物用作探针进行Northern杂交以鉴定差异表达的mRNA,随后经克隆和序列分析等过程,最后将获得的差异显示cDNA序列与Genbank数据库中的已知序列进行同源性匹配,即可确定差异表达的基因是已知的基因(表达上调或者表达下调)还是新发现的基因.其主要操作流程图如下.{反转录成c1)lqA设计橹定的弓I物并进行Pac扩增I聚丙烯磷胺凝胶电泳和放射自显影回收差异显示的cIlNA条蒂进行二次扩增lNortl~rn杂交,克隆和测序|r与Ge~ank中己知序列进行'潆l生比较图l差异显示RT.PCR技术主要流程图2差异显示RT.PCR技术的特点差异显示RT.PCR技术克服了以往一些方法如差异杂交和消减杂交的许多不足之处,其主要优点为:①RNA用量少,约fJ,5l3J,这使得材料来源困难的研究成为可能;②能灵敏地用于检测组织或细胞中表达极低丰度的mRNA样品的差异表达,对RNA来源少的标本价值更大;③可同时比较两种以上的RNA样品,即可允许同时进行多组问样本的比较分析;④重现性好,90%～95%的条带能够重显;⑤可同时检测基因的上调和下调表达,这显然有利于基因表达调控方面的研究;⑥操作简单,如RT—PCR技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳技术等都是分子生物学实验的常规技术;⑦操作快速, 实验周期短,仅需两天或更短时间即可获得差异表达的cD? NA谱带,探针的重新扩增到Northern杂交一般只需一周的时间;⑨实验过程中可步步验证比较,即实验者自始至终都可以监测实验的进行情况,从而避免了盲目性.总之,可简单地将差异显示RT—PCR的特点概括为:"3SRV",即"Simplicity,Sensitivity,Speed.Reproducibility.VersatilitY".但在实际应用过程中,差异显示RT—PCR技术也存在着一些作者简介:胡恭华(1972年一),男,讲师,在读硕士研究生,主要从事生化与分子毒理学研究.一i58—一1期胡恭华,等差异显示RT—PCR技术在我国毒理学研究中的应用问题:①假阳性率较高;②检测全部mRNA工作量过大;③对低拷贝mRNA检测能力较差,稀有mRNA的检测水平有待提高;④基因的克隆受mRNA表达的时效性影响;⑤筛选出来的差异表达片段通常为300～500bp,而且大多数位于3'端非编码区,这些序列通常不能真正代表差异表达的基因.3在我国毒理学研究中的应用毒理学作为一门研究外源物对生物体的有害作用及其机制的综合性学科,已成为生命科学的重要组成部分.所以,它必然要用到分子生物学的有关技术.目前,差异显示RT—PER技术已被广泛用于外源物应激基因及其表达调控的研究,外源物毒作用检测终点及其作用机制的探索等.下面着重就近几年来差异显示RT—PCR技术在我国毒理学研究中的应用作一阐述.3.1差异显示RT～PCR技术在放射毒理学研究中的应用在放射毒理学研究方面,差异显示RT—PER技术能够寻找到辐射损伤尤其是辐射致癌的相关基因,并且通过反复筛选和功能鉴定,有可能揭示辐射损伤的分子机制,进而为放射防护提供相应的理论依据.李刚等采用mRNA差异显示的方法比较原代大鼠气管上皮细胞同粒子诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的基因表达差异状况.共克隆到15个差异表达的基因片段,并向Ge~eBank登录了7条新基因序列,结果提示Annexinl,nm23,羧酸酯酶前体物基因和ZG52等可能参与粒子辐射诱发大鼠气管上皮细胞恶性转化的过程.杨梅英等训利用差异显示RT—PCR技术检测了SV40T转染的人胎气管永生化成纤维细胞和该细胞经粒子照射并能在软琼脂上形成克隆的细胞之间的差异相关基因.接着,他们将该技术作了改进并用于粒子辐射诱发肺癌发生的相关基因研究;此后,他们又采用差异显示RT—PER技术研究了锡矿工肺癌切除的癌组织及正常肺组织中差异表达的基因.夏英等""为了研究高氡地区居民肺癌组织中相关未知基因,探讨肺癌发生的机理,应用了mRNA差异显示法从同一例肺癌和正常组织中选出有表达差异的基因片段,经反向NorthernBlot杂交,将肺癌组织表达呈阳性的片段而正常组织呈阴性的片段进行克隆测序,结果发现7 条差异片段,其中NA7与GenbankEST中的AI208667序列同源性达95%以上,NG2与5条基因序列同源性高达98%以上,而CA1可能是一个新的差异基因片段.刘炳辰等利用差异显示RT-PCR技术,分析了不同剂量射线照射及用同一剂量照射后不同时间的H一38细胞的mRNA表达差异,结果得到了l4条表达差异的带型,这为研究遗传不稳定性的分子机制提供了重要的信息.为了寻找肠上皮细胞辐射损伤相关基因,探讨辐射致肠上皮损伤的分子机制,王军平等用该法比较研究了12Gy射线辐射损伤前后小鼠肠上皮细胞间基因表达的异同.发现一条辐射损伤肠上皮细胞特异表达的基因片段RS2,此结果表明小鼠辐射损伤后小肠上皮细胞的基因表达的确发生异常.周晓等以经粒子照射诱导转化的细胞与相应的对照细胞为对比材料,采用该技术对转化早期差异表达的eDNA序列进行了分离与克隆, 结果克隆出2gs3,5gsl,5gs2,2gdl,6gdl共5个差异片段测序, 经文献检索发现除5gsl外均为新序列,已登录到EMBL库中.为了筛选与鉴定电离辐射损伤相关的内皮细胞基因,盛茗等利用mRNA差异显示技术,以正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和电离辐射后的HUVEC为实验材料,筛选与60Co'y电离辐射损伤相关的基因片段.经测序和鉴定,发现基因KIAA0456的两个外显子STSS和GSSS,AR乃基因在辐射后的内皮细胞中表达增加,从而得知内皮细胞由上述两基因介导的细胞分化,信号传导,细胞粘附及增殖功能在辐射后增强.周平坤刮等用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因.结果获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LI~Gx 的eDNA片段,序列同源性比较显示与人染色体20ql1.2—12的一段DNA高度同源(>99%).3.2差异显示RT—PER技术在环境毒理学研究中的应用某些镍化合物具有较强的致癌性.为了阐明氧化镍致癌的遗传机制,吴卫东等采用差异显示RT—PER技术探讨了黑色氧化镍对人胚肺细胞基因表达的影响,发现对照组与处理组相比,其eDNA指纹图500bp处有一明显差异带(pDL),这无疑对阐明镍化合物的致癌机理提供了重要的依据.此后,他们对克隆的eDNA片段pDL进行测序,并经同源性分析,表明该片段与CyelophilinB中的329～195碱基序列完全一致.为探讨过量氟对成骨细胞基因表达的影响,以便揭示氟中毒的分子机制,缪庆等采用了差异显示RT—PCR技术,对染氟2周的成骨细胞与正常成骨细胞之间基因的差异表达进行了比较分析,结果发现,在已克隆到的6 个差异表达的基因片段中,大鼠核糖体蛋白基因,大鼠Na.K一ATP酶基因,大鼠细胞核定位信号蛋白质受体0c2基因和大鼠高尔基体p23基因在染氟成骨细胞中低表达,小鼠遍在蛋白缀合酶基因及1个新发现的基因片段在染氟成骨细胞中表达上调.由于砷化合物具有致癌和致畸性,寻找砷中毒相关基因不仅对慢性砷中毒的发病机理的揭示具有重大意义,而且对于探讨恶性肿瘤的发病机瑷也有一定的意义.武建强等应用mRNA差异显示法对慢性砷中毒病人具有典型皮损的皮肤组织进行了差异基因的筛选,结果发现了25条差异表达的eDNA片段,对其中两条进一步克隆和测序,表明均为未知序列,RNA印迹法显示与PCR结果相符,说明可能为中毒相关序列.3.3差异显示RT—PCR在遗传毒理学中的应用遗传毒理学是--J'q研究化学物质及其他环境因子致突变效应的毒理学分支学科.差异显示RT—PER技术在该领域的应用也略有报道.张小山等用差异显示RT—PER法对猴肾Vem细胞及烷化剂N一甲基一N'一硝基一N一亚硝基胍(MNNG)处理后的Vero细胞进行了差异显示研究,结果表明MNNG可引起Veto细胞一些基因表达的增强和抑制.胡文蔚等也应用该技术观察了MNNG处理的猴肾Veto细胞的差异表达情况,分离到7个表达有差异的片段,其中3个片段的相关基因属于对MNNG处理的初级反应基因,2个属于次级反应基因,另有2个片段的差异表达仅在蛋白合成抑制剂环己亚胺(CHM)合并MNNG处理时才出现;结果提示MNNG或合并环已亚胺(triM)处理可诱导参与倍号传导的基因表达发生改变而影响信息传递.为研究甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化的机制,尹学钧等采用差异显示RT—PER技术,对恶性转化细胞同正常细胞之间基因的差异表达状况进行了比较分析,共克隆到18个差异表达的eDNA片段,其中,17个DNA 片段与已知基因高度同源,另外一个为新基因序列,经North一一159—赣南医学院2007年era杂交证实,分别有8个和3个基因在GMA诱导的恶性转化细胞中表达增加或降低,结果提示,这些基因可能参与了GMA诱导的细胞恶性转化过程,为进一步研究GMA诱导细胞转化及其潜在致癌机理提供了新的线索.4问题与展望近年来,分子生物学的发展为毒理学的研究注入了新的活力,并为之提供了许多新的研究手段和方法,从而使毒理学的研究发生了质的飞跃.差异显示RT—PCR就是其中一种比较灵活的检测外源物作用后组织细胞内基因表达状况的新技术该技术已被用于筛选外源物作用后的相关应激基因,尤其是新的毒作用相关基因.很显然,这将有助于发现关于中毒的早期生物学标志物,同时也有助于揭示急,慢性中毒和"三致效应"(即致癌,致畸和致突变)的分子机制.然而,在我国目前的情况下差异显示RT—PCR在毒理学研究中的应用仅限于上述几个领域之内,因此它有必要与其它一些常见的分子生物学技术如单细胞凝胶电泳技术,DNA测序技术,RNA干扰技术,转基因技术和基因芯片技术等相结合,…起应用于环境中各种外源物所引起的DNA损伤,基因突变等毒性作用分子机制的探讨,从而明显地提高毒理学的研究水平此外,还必须注意的是新基因片段的获得,仅仅是许多步骤中的开始,因为新基因的功能还是未知的.因此,发现新基因片段后,下一步就必须研究差异表达基因的功能,这其中包括了全长cDNA的克隆,表达产物的功能分析及其在外源物发挥毒性作用过程中的功能等.可以预测, 差异显示RT—PCR技术将为分子毒理学的研究作出重大的员献,两其本身也将在毒理学的深入研究中得到不断地发展与完善.参考文献:【l;LiangP,PardeeAB.Differentialdisplayofeukaryotic mcs~ngerRNAbymeansofthep0lymerasechainreac—tion[J].Science,1992,257(5072):967～971.:2]HuG,FanT,MeiX.IdentificationofacDNAclonespe—clfieforthetaxolsynthesisphaseofTaxuschinensisceils bymRNAdifferentialdisplay[J].NatProdRes,2004,18 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