bDNA与RT_PCR方法检测艾滋病患者病毒载量结果对比研究_张淑琼
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差异显示RT-PCR技术在我国毒理学研究中的应用第27卷第1期!生月赣南医学院JOURNALOFGANNANMEDICALUNIVERSITY,0Z.27Ⅳ0.1FEB.溯差异显示RT—PCR技术在我国毒理学研究中的应用胡恭华,罗江洪,李舒梅(赣南医学院预防医学教研室,江西赣州341000)巾躅分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1001—5779(2007)01—0158—03高等生物大约有10万个不同的基因,但只有15%的基在任何个体的细胞中都表达.基因表达是调节细胞生物学行为的陔心,因为它决定了生命过程中的许多重要环节,如:细胞增殖,分化,应激,细胞周期的调节以及细胞凋亡等.探讨处于不同作用条件下细胞内基因表达上的差异,有利于人们了解生命现象的本质,从而找到疾病发生的根源.因此.如何使用高效的技术手段来鉴别,分离基因以及寻找到新基因,一直是生命科学关注的热点.传统的基因分离方法主要有扣除杂交和差异杂交等技术.虽然用这些技术已成功分离出许多重要的基因,但是由于存在着操作复杂,耗时和重复性差等缺点,因此在应用中受到了限制.而差异显示RT~PCR技术克服了这些缺陷,为检测基因的表达差异提供了一种新的途径.目前毒理学已将该技术应用于外源物作用后应激基因的筛选和分离以及毒性作用分子机理的研究,并取得了一些重要的成果.为此,笔者主要就差异显示RT—PCR技术的基本原理,特点及其在我国毒理学研究中的应用作一阐述.1基本原理和操作步骤差异显示RT—PCR(Differentialdisplayreversetranscrip? tiou—polymcrasechainreaction)是由哈佛大学的LiangPeng 在1992年建立起来的一种筛选和克隆受机体内外各种因素影响下差异表达基因的方法.该技术通过基因表达产物mRNA的差异来了解基因的表达情况,从而获得不同类型细胞及处于不同功能状态或不同环境下的同类细胞基因表达的差异.它是以分子生物学上广泛应用的两种技术RT—nR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的.其基本原理为:根据真核细胞巾mRNA均含有poly(A)末端的特点,合成两组引物其中,3'端锚定引物设计成T12MN(N代表4种碱基中的一科I;M为A,G和C三种碱基中的一种,但不能为T),共有l2种引物.5'端引物设计成20条随机引物,每条引物由10个碱基组成.实验证明,至少20种随机引物,可以覆盖所有t~DNA.这样,即使获得很少的总RNA,也可以扩增到足够的带有完整信息的cDNA.将基因背景相同的两个或多个细胞系或组织总RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA,接着用桶宜的3'端引物和5'端随机引物进行PCR扩增,每对引物能扩增50~100个mRNA片段,然后对扩增产物进行凝驳电滚稍放射自显影,通过对X光胶片上的自显影条带进行比较,郾可发现不同细胞或不同处理组细胞中差异表达的基嘲片段.弭从凝胶上回收差异表达的cDNA片段并用相同条件再次扩增,产物用作探针进行Northern杂交以鉴定差异表达的mRNA,随后经克隆和序列分析等过程,最后将获得的差异显示cDNA序列与Genbank数据库中的已知序列进行同源性匹配,即可确定差异表达的基因是已知的基因(表达上调或者表达下调)还是新发现的基因.其主要操作流程图如下.{反转录成c1)lqA设计橹定的弓I物并进行Pac扩增I聚丙烯磷胺凝胶电泳和放射自显影回收差异显示的cIlNA条蒂进行二次扩增lNortl~rn杂交,克隆和测序|r与Ge~ank中己知序列进行'潆l生比较图l差异显示RT.PCR技术主要流程图2差异显示RT.PCR技术的特点差异显示RT.PCR技术克服了以往一些方法如差异杂交和消减杂交的许多不足之处,其主要优点为:①RNA用量少,约fJ,5l3J,这使得材料来源困难的研究成为可能;②能灵敏地用于检测组织或细胞中表达极低丰度的mRNA样品的差异表达,对RNA来源少的标本价值更大;③可同时比较两种以上的RNA样品,即可允许同时进行多组问样本的比较分析;④重现性好,90%~95%的条带能够重显;⑤可同时检测基因的上调和下调表达,这显然有利于基因表达调控方面的研究;⑥操作简单,如RT—PCR技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳技术等都是分子生物学实验的常规技术;⑦操作快速, 实验周期短,仅需两天或更短时间即可获得差异表达的cD? NA谱带,探针的重新扩增到Northern杂交一般只需一周的时间;⑨实验过程中可步步验证比较,即实验者自始至终都可以监测实验的进行情况,从而避免了盲目性.总之,可简单地将差异显示RT—PCR的特点概括为:"3SRV",即"Simplicity,Sensitivity,Speed.Reproducibility.VersatilitY".但在实际应用过程中,差异显示RT—PCR技术也存在着一些作者简介:胡恭华(1972年一),男,讲师,在读硕士研究生,主要从事生化与分子毒理学研究.一i58—一1期胡恭华,等差异显示RT—PCR技术在我国毒理学研究中的应用问题:①假阳性率较高;②检测全部mRNA工作量过大;③对低拷贝mRNA检测能力较差,稀有mRNA的检测水平有待提高;④基因的克隆受mRNA表达的时效性影响;⑤筛选出来的差异表达片段通常为300~500bp,而且大多数位于3'端非编码区,这些序列通常不能真正代表差异表达的基因.3在我国毒理学研究中的应用毒理学作为一门研究外源物对生物体的有害作用及其机制的综合性学科,已成为生命科学的重要组成部分.所以,它必然要用到分子生物学的有关技术.目前,差异显示RT—PER技术已被广泛用于外源物应激基因及其表达调控的研究,外源物毒作用检测终点及其作用机制的探索等.下面着重就近几年来差异显示RT—PCR技术在我国毒理学研究中的应用作一阐述.3.1差异显示RT~PCR技术在放射毒理学研究中的应用在放射毒理学研究方面,差异显示RT—PER技术能够寻找到辐射损伤尤其是辐射致癌的相关基因,并且通过反复筛选和功能鉴定,有可能揭示辐射损伤的分子机制,进而为放射防护提供相应的理论依据.李刚等采用mRNA差异显示的方法比较原代大鼠气管上皮细胞同粒子诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的基因表达差异状况.共克隆到15个差异表达的基因片段,并向Ge~eBank登录了7条新基因序列,结果提示Annexinl,nm23,羧酸酯酶前体物基因和ZG52等可能参与粒子辐射诱发大鼠气管上皮细胞恶性转化的过程.杨梅英等训利用差异显示RT—PCR技术检测了SV40T转染的人胎气管永生化成纤维细胞和该细胞经粒子照射并能在软琼脂上形成克隆的细胞之间的差异相关基因.接着,他们将该技术作了改进并用于粒子辐射诱发肺癌发生的相关基因研究;此后,他们又采用差异显示RT—PER技术研究了锡矿工肺癌切除的癌组织及正常肺组织中差异表达的基因.夏英等""为了研究高氡地区居民肺癌组织中相关未知基因,探讨肺癌发生的机理,应用了mRNA差异显示法从同一例肺癌和正常组织中选出有表达差异的基因片段,经反向NorthernBlot杂交,将肺癌组织表达呈阳性的片段而正常组织呈阴性的片段进行克隆测序,结果发现7 条差异片段,其中NA7与GenbankEST中的AI208667序列同源性达95%以上,NG2与5条基因序列同源性高达98%以上,而CA1可能是一个新的差异基因片段.刘炳辰等利用差异显示RT-PCR技术,分析了不同剂量射线照射及用同一剂量照射后不同时间的H一38细胞的mRNA表达差异,结果得到了l4条表达差异的带型,这为研究遗传不稳定性的分子机制提供了重要的信息.为了寻找肠上皮细胞辐射损伤相关基因,探讨辐射致肠上皮损伤的分子机制,王军平等用该法比较研究了12Gy射线辐射损伤前后小鼠肠上皮细胞间基因表达的异同.发现一条辐射损伤肠上皮细胞特异表达的基因片段RS2,此结果表明小鼠辐射损伤后小肠上皮细胞的基因表达的确发生异常.周晓等以经粒子照射诱导转化的细胞与相应的对照细胞为对比材料,采用该技术对转化早期差异表达的eDNA序列进行了分离与克隆, 结果克隆出2gs3,5gsl,5gs2,2gdl,6gdl共5个差异片段测序, 经文献检索发现除5gsl外均为新序列,已登录到EMBL库中.为了筛选与鉴定电离辐射损伤相关的内皮细胞基因,盛茗等利用mRNA差异显示技术,以正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和电离辐射后的HUVEC为实验材料,筛选与60Co'y电离辐射损伤相关的基因片段.经测序和鉴定,发现基因KIAA0456的两个外显子STSS和GSSS,AR乃基因在辐射后的内皮细胞中表达增加,从而得知内皮细胞由上述两基因介导的细胞分化,信号传导,细胞粘附及增殖功能在辐射后增强.周平坤刮等用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因.结果获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LI~Gx 的eDNA片段,序列同源性比较显示与人染色体20ql1.2—12的一段DNA高度同源(>99%).3.2差异显示RT—PER技术在环境毒理学研究中的应用某些镍化合物具有较强的致癌性.为了阐明氧化镍致癌的遗传机制,吴卫东等采用差异显示RT—PER技术探讨了黑色氧化镍对人胚肺细胞基因表达的影响,发现对照组与处理组相比,其eDNA指纹图500bp处有一明显差异带(pDL),这无疑对阐明镍化合物的致癌机理提供了重要的依据.此后,他们对克隆的eDNA片段pDL进行测序,并经同源性分析,表明该片段与CyelophilinB中的329~195碱基序列完全一致.为探讨过量氟对成骨细胞基因表达的影响,以便揭示氟中毒的分子机制,缪庆等采用了差异显示RT—PCR技术,对染氟2周的成骨细胞与正常成骨细胞之间基因的差异表达进行了比较分析,结果发现,在已克隆到的6 个差异表达的基因片段中,大鼠核糖体蛋白基因,大鼠Na.K一ATP酶基因,大鼠细胞核定位信号蛋白质受体0c2基因和大鼠高尔基体p23基因在染氟成骨细胞中低表达,小鼠遍在蛋白缀合酶基因及1个新发现的基因片段在染氟成骨细胞中表达上调.由于砷化合物具有致癌和致畸性,寻找砷中毒相关基因不仅对慢性砷中毒的发病机理的揭示具有重大意义,而且对于探讨恶性肿瘤的发病机瑷也有一定的意义.武建强等应用mRNA差异显示法对慢性砷中毒病人具有典型皮损的皮肤组织进行了差异基因的筛选,结果发现了25条差异表达的eDNA片段,对其中两条进一步克隆和测序,表明均为未知序列,RNA印迹法显示与PCR结果相符,说明可能为中毒相关序列.3.3差异显示RT—PCR在遗传毒理学中的应用遗传毒理学是--J'q研究化学物质及其他环境因子致突变效应的毒理学分支学科.差异显示RT—PER技术在该领域的应用也略有报道.张小山等用差异显示RT—PER法对猴肾Vem细胞及烷化剂N一甲基一N'一硝基一N一亚硝基胍(MNNG)处理后的Vero细胞进行了差异显示研究,结果表明MNNG可引起Veto细胞一些基因表达的增强和抑制.胡文蔚等也应用该技术观察了MNNG处理的猴肾Veto细胞的差异表达情况,分离到7个表达有差异的片段,其中3个片段的相关基因属于对MNNG处理的初级反应基因,2个属于次级反应基因,另有2个片段的差异表达仅在蛋白合成抑制剂环己亚胺(CHM)合并MNNG处理时才出现;结果提示MNNG或合并环已亚胺(triM)处理可诱导参与倍号传导的基因表达发生改变而影响信息传递.为研究甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化的机制,尹学钧等采用差异显示RT—PER技术,对恶性转化细胞同正常细胞之间基因的差异表达状况进行了比较分析,共克隆到18个差异表达的eDNA片段,其中,17个DNA 片段与已知基因高度同源,另外一个为新基因序列,经North一一159—赣南医学院2007年era杂交证实,分别有8个和3个基因在GMA诱导的恶性转化细胞中表达增加或降低,结果提示,这些基因可能参与了GMA诱导的细胞恶性转化过程,为进一步研究GMA诱导细胞转化及其潜在致癌机理提供了新的线索.4问题与展望近年来,分子生物学的发展为毒理学的研究注入了新的活力,并为之提供了许多新的研究手段和方法,从而使毒理学的研究发生了质的飞跃.差异显示RT—PCR就是其中一种比较灵活的检测外源物作用后组织细胞内基因表达状况的新技术该技术已被用于筛选外源物作用后的相关应激基因,尤其是新的毒作用相关基因.很显然,这将有助于发现关于中毒的早期生物学标志物,同时也有助于揭示急,慢性中毒和"三致效应"(即致癌,致畸和致突变)的分子机制.然而,在我国目前的情况下差异显示RT—PCR在毒理学研究中的应用仅限于上述几个领域之内,因此它有必要与其它一些常见的分子生物学技术如单细胞凝胶电泳技术,DNA测序技术,RNA干扰技术,转基因技术和基因芯片技术等相结合,…起应用于环境中各种外源物所引起的DNA损伤,基因突变等毒性作用分子机制的探讨,从而明显地提高毒理学的研究水平此外,还必须注意的是新基因片段的获得,仅仅是许多步骤中的开始,因为新基因的功能还是未知的.因此,发现新基因片段后,下一步就必须研究差异表达基因的功能,这其中包括了全长cDNA的克隆,表达产物的功能分析及其在外源物发挥毒性作用过程中的功能等.可以预测, 差异显示RT—PCR技术将为分子毒理学的研究作出重大的员献,两其本身也将在毒理学的深入研究中得到不断地发展与完善.参考文献:【l;LiangP,PardeeAB.Differentialdisplayofeukaryotic mcs~ngerRNAbymeansofthep0lymerasechainreac—tion[J].Science,1992,257(5072):967~971.:2]HuG,FanT,MeiX.IdentificationofacDNAclonespe—clfieforthetaxolsynthesisphaseofTaxuschinensisceils bymRNAdifferentialdisplay[J].NatProdRes,2004,18 (4):365~371.[3]GaedeKI,MamatU,SchlaakM,eta1.Aanlysisofdiffer. enfiallyregulatedmRNAainperipheralbloodmonocytesof trsrylliosispatientsafterinvitrostimulation[J].JMolMed,2000,78(5):293.[4】GreenlandKJ,RekarisG,MacLeanHE,eta1.Application ofdifferentialdisplayintheidentificationofandrogen—regulatedgenes[J].EndocrRes,2004,30(1):69~82.[5]BertoliDJ,SchlichterUH,AdamsMJ.eta1.Ananalysis ofdifferentialdisplayshowsastrongbiastowardshigh copynumberMma[J].NucleicAcidsRes,1995,23 (21):4520.【6j李刚,吴德昌,胡迎春,等.高LET辐射致细胞恶性转化相关基因的克隆[J].中华放射医学与防护杂志, 2000,20(1):19~24.[7]杨梅英,叶常青,吴德昌,等.粒子诱发胎气管永生—一J6O~化纤维细胞恶性转化相关基因的分析[J].中华放射医学与防护杂志,1997,17(3):166~168.[8]杨梅英,叶常青,陈剑云,等.差异显示法的建立及其辐射致癌机理研究中的初步应用[J].癌变畸变突变, 1999,11(1):8~l1.[9]杨梅英,叶常青,姚树祥,等.用差异显示法研究云锡矿工肺癌组织相关基因[J].中华放射医学与防护杂志, 1999,19(4):263~266.[10]夏英,杨梅英,冯顺治,等.应用mRNA差异显示法初步研究肺癌相关基因[J].中华放射医学与防护杂志, 2002,22(2):83~85.[11]夏英,杨梅英,张守志,等.高氡地区居民肺癌组织已知基因和相关基因分析研究[J].中国预防医学杂志, 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艾滋病病毒感染实验检测方法研究进展刘凤艾滋病是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的一种获得性免疫缺陷病,是全球主要公共卫生问题。
截至2019年底,全球约有3 800 万人感染,其中仅有67%接受了抗逆转录病毒治疗(ART),仍有710 万感染者甚至不知道自己的感染状况[1]。
随着抗逆转录病毒治疗技术的发展,HIV感染已成为一种可控制的慢性病,感染者能够过上长期的健康生活,寿命与未感染人群无明显差异。
联合国艾滋病规划署的3个90%目标中,首个即是90%的艾滋病病毒感染者知道自己的感染状况,而实验室检测是确定艾滋病感染的唯一办法。
随着科学的进步,HIV检测引入了许多新方法,取得了长足的进步。
本文将近年来艾滋病病毒的血清学检测和核酸检测方法的研究进展综述如下。
1 血清学检测1.1抗体检测或抗体抗原联合检测抗体检测是实验室最常用、最主要也是灵敏度和特异度均较高的HIV 检测方法。
1.1.1酶联免疫吸附试验(ELISA)中国于1985年出现艾滋病病例时开始研制第1代ELISA试剂,至今已发展到第5代,每一代新试剂都旨在克服前一代的不足。
第1代和第2代试剂只能检测IgG抗体,窗口期分别为6~8周和4~5周。
第3代试剂可检测到HIV-1 IgM抗体,窗口期为3~4周。
第4代试剂是一种HIV-1/HIV-2抗体与p24抗原的联合检测方法,窗口期为2~3周。
目前,我国HIV筛查普遍使用第3代试剂,也有部分地区使用第4代试剂,献血员的筛查使用第4代试剂,以提高输血的安全性。
2015年美国FDA批准了第5代试剂BioPlex 2200 HIV Ag-Ab assay用于临床HIV筛查,此试剂采用多重磁珠流式免疫测定的方法,可同时定性检测并准确区分HIV-1抗体、HIV-2抗体和p24抗原,可用于诊断HIV-1急性感染[2],但在公共卫生领域中尚未广泛使用。
第5代试剂目前在中国未获得国家药品监督管理局(NMPA)批准。
甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术尹惠琼;刘松婷;史利军;杨姝;章金刚【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2010(021)002【摘要】目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法.方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验.结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1~H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)<10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好.结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术.【总页数】4页(P244-247)【作者】尹惠琼;刘松婷;史利军;杨姝;章金刚【作者单位】军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850;军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q502;Q78【相关文献】1.实时荧光RT-PCR检测不同标本中甲型H1N1流感病毒核酸的临床意义 [J], 陈双峰;陈海英;张颖新;郑丽丽2.TapMan荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸方法的建立及意义 [J], 高洁;严敏;付婷;邵中军3.检测施马伦贝格病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法 [J], 张永宁;吴绍强;吕继洲;冯春燕;王彩霞;邓俊花;袁向芬;林祥梅4.蓝舌病病毒核酸标准样品的制备及荧光定量RT-PCR方法的研究 [J], 蒲静;乔彩霞;尹羿;高志强;汪琳;任彤;张伟5.荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸的价值分析 [J], 王瑾因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
不同核酸提取方法检测HIV病毒载量和耐药基因的研究刘敏;陈秀英;梅少林;陈沙彬;雷永良【期刊名称】《中国现代医生》【年(卷),期】2016(054)020【摘要】目的比较5种核酸提取法提取HIV RNA的效率.方法收集2015年HIV 病毒感染者血样,使用不同核酸提取方法平行检测Ct值及载量值,分析检测的检出率、敏感性、变异系数、稳定性,并进行耐药扩增.结果 5种提核酸方法检出率国产磁珠法最高,5种方法差异无统计学意义(x2=7.98,P=0.09);Ct值从小到大顺序为:国产磁珠法≥离心柱法>大批量法≥进口磁珠法>试剂盒自带法;重复性比较表明国产磁珠法检测结果较稳定;核酸胶显示国产磁珠法提取RNA浓度最高;提取方法不影响耐药关键位点检测.结论 5种核酸提取方法均能检测HIV信息,国产磁珠法提取病毒核酸进行检测,敏感性和稳定性均较高.【总页数】4页(P111-114)【作者】刘敏;陈秀英;梅少林;陈沙彬;雷永良【作者单位】浙江省丽水市疾病预防控制中心,浙江丽水323000;浙江省丽水市疾病预防控制中心,浙江丽水323000;浙江省丽水市疾病预防控制中心,浙江丽水323000;浙江省丽水市疾病预防控制中心,浙江丽水323000;浙江省丽水市疾病预防控制中心,浙江丽水323000【正文语种】中文【中图分类】R512.91【相关文献】1.不同类型样本对HIV基因型耐药检测研究的影响 [J], 张军; 李祥2.不同类型样本对HIV基因型耐药检测研究的影响 [J], 张军;李祥3.应用HIV-1耐药性基因型检测广东部分地区HIV耐药株 [J], 万卓越;李杰;付笑冰;林萍;鄢心革;刁丽梅4.等温核酸序列扩增检测不同临床阶段的HIV-1感染者血浆病毒载量 [J], 颜苹苹;严延生;邵一鸣;陈舸5.国产实时荧光定量核酸检测试剂测定HIV病毒载量 [J], 马鹏飞;邢辉;魏民;全宇;姜树林;邵一鸣因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
RNA质量对内参基因选择和qRT-PCR结果评价的影响霍雪萍;张琳萍;赵向绒;刘勤社;王海芳【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2018(029)003【摘要】目的:研究RNA质量对内参基因选择和实时定量PCR(qRT-PCR)分析肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导基因表达结果评价的影响.方法:用TNFα刺激体外培养的小鼠血管内皮细胞,采用qRT-PCR技术,以2种常用的管家基因β-actin和GAPDH 为内参,检测细胞间黏附分子1(ICAM-1)基因的表达,探讨RNA纯度对TNFα下游基因表达检测结果的影响.结果:当提取的总RNA纯度很高(D260nm/D230nm>2.0)时,以β-actin和GAPDH为内参基因检测ICAM-1基因表达的结果相近;当总RNA可能被盐及小分子污染(D260nm/D230nm<2.0)时,以β-actin为内参基因检测的ICAM-1基因相对表达量显著高于以GAPDH为内参所得结果.结论:RNA 质量显著影响荧光定量PCR对基因表达的检测结果,因此在RNA质量较低时应选择2个或以上内参基因进行校正,以减少实验结果误差,得到准确结果.【总页数】4页(P415-418)【作者】霍雪萍;张琳萍;赵向绒;刘勤社;王海芳【作者单位】陕西省人民医院中心实验室,陕西西安710068;西安交通大学医学部,陕西西安710061;陕西省人民医院中心实验室,陕西西安710068;陕西省中西医结合心血管病防治重点实验室,陕西中医药大学,陕西西安712046;陕西省中西医结合心血管病防治重点实验室,陕西中医药大学,陕西西安712046【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.人参二醇组皂苷对内毒素休克大鼠脑皮质TLR4 mRNA表达的影响 [J], 王健春;孙晓霞;王志;袁兆新;刘潇;孙连坤;李扬;赵雪俭2.人参二醇组皂苷对内毒素休克大鼠肾脏TLR2和TLR4mRNA表达的影响 [J], 王辉;孙际童;陈耐飞;苏静;周磊;孔祥波;孙连坤;康劲松3.人参二醇组皂苷对内毒素休克大鼠脑皮质I κBα mRNA表达的影响 [J], 王志;李金成;刘潇;刘喜春;赵雪俭;孙连坤4.全员参与分层质量控制管理对内科病区护理质量及护理人员自我评价的影响 [J], 张贞;姚启敏5.6S管理模式对内分泌科护理质量的影响评价 [J], 张丽因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
实时荧光RT—PCR(定量)法对不同手足口病样本病原体检出率比较雷务年;卓训妮【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2013(10)A01【摘要】目的了解和比较不同采集样本对手足口病病原体的检出率,优化样本采集方案和提高检出率,为预防和控制手足口病提供准确的实验室依据。
方法采用实时荧光RTPCR(定量)法对钦州市2011年~2012年采集的不同样本进行检测,并对结果进行统计分析。
结果以疱疹液的检出率为98.46%64/65)最高,大便96.81%(91/94)、肛拭子94.74%(432/456)和咽拭子88.20%(142/161)检出率分列2、3、4位。
而以脑脊液以8.00%(2/25)检出率最低。
结论应采集患者疱疹液或大便(肛拭子),以提高手足口病的检出率。
【总页数】3页(P130-132)【作者】雷务年;卓训妮【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】R714.210.4【相关文献】1.实时荧光定量RT-PCR法检测安徽宿州市手足口病病原体结果分析 [J], 胡雪影;张玲2.荧光定量RT-PCR法检测门头沟区手足口病病原体探讨 [J], 刘海涛;庄国良;王志越;吕秋艳;宋景红3.实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较[J], 沈飚;王忠发;胡兴娟;顾松叶4.实时荧光定量RT-PCR对新型冠状病毒3种不同生物学样本检出率的比较 [J], 查毅;蒋玲玉;简玲;李青峰;魏徵霄5.实时荧光定量RT-PCR对新型冠状病毒3种不同生物学样本检出率的比较 [J], 查毅;蒋玲玉;简玲;李青峰;魏徵霄因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
应用实时荧光PCR检测不同时期艾滋病患者肠道菌群量的变化及意义王丽娜;吴翠松;陈薇薇【摘要】目的应用实时荧光PCR技术分析处于感染各期的艾滋病患者主要肠道菌群的变化,研究艾滋病对肠道微生态的损害及其发病机制.方法收集急性感染期、无症状期、艾滋病期患者大便标本各10份,对照组为观察组的配偶或工友共30例.提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR反应测定双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌、粪肠球菌及屎肠球菌5种细菌的数量.结果较常对照组艾滋病患者组双歧杆菌属、乳酸杆菌属的数量明显减少;而大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌的数量显著增多,形成的差异具有统计学意义(P<0.05).结论艾滋病患者肠道发生微生态失衡,出现微生态紊乱,由此引发内源性感染而危及生命.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2018(016)001【总页数】2页(P33-34)【关键词】获得性免疫缺陷综合征;AIDS;荧光定量PCR;肠道菌群【作者】王丽娜;吴翠松;陈薇薇【作者单位】江苏大学附属镇江三院艾滋病科,江苏镇江212005;江苏大学附属镇江三院艾滋病科,江苏镇江212005;江苏大学附属镇江三院艾滋病科,江苏镇江212005【正文语种】中文【中图分类】R512.91艾滋病(AIDS)是一种获得性免疫缺陷综合征,因较高传染性和不可治愈性引起极高的关注。
艾滋病患者会出现的各种严重并发症及肿瘤,预后极差,使其成为严重威胁我国人民的公共卫生问题。
目前已经影响到了国民经济发展和全社会稳定[1]。
本实验采用实时荧光PCR(real-time fluorescener)方法将艾滋病患者与正常对照者粪便中的五种细菌进行定量检测,与正常对照组进行比较,分析肠道菌群变化的差异,为临床诊疗进行治疗提供一定的理论依据。
1 资料与方法1.1 研究对象1.1.1 观察组:2010年1月至2016 年1月镇江市第三人民医院诊治的急性感染期、无症状期、艾滋病期患者大便标本各10份,共30例,男性22例,女性8例,年龄19~56岁,平均年龄(36.05±8.93)岁,粪便采样前4周内未使用抗生素或微生态制剂;其C淋巴细胞数在(0~676)×106/L,并且无慢性腹泻症状。
1. HIV病毒的分离与培养(该方法用于科学研究,一般不用于临床诊断)
HIV病毒只感染CD4+的T淋巴细胞,并且还要求淋巴细胞处于增殖状态,只有在特定的实验室条件下才能有效地分离和增殖HIV病毒。
并且要求HIV病毒培养要在生物安全三级实验室进行。
2. HIV病毒的核酸检测(一般用于急性期的检测)
最常用的是HIV-RNA定量测定方法,用于检测HIV感染者血浆中病毒的量,称为HIV 病毒载量测定。
目前有三种方法:反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)和分支信号放大系统(bDNA)等。
3. HIV病毒的抗原检测(一般只能用于HIV 感染早期的临床检测)
HIV-P24抗原出现时间较HIV抗体出现的时间更早,因此HIV-P24抗原检测可以用于对HIV早期感染的诊断,在进行HIV抗体检测时,同时进行HIV-P24抗原的检测可以减少假阴性。
除此之外,HIV-P24抗原检测也可以用于体外HIV在细胞培养液中浓度的测定和体外药物实验的效果评价等方面。
4. HIV感染的抗体检测(是诊断HIV感染最常用的方法)
血清学方法进行抗体检测是目前诊断HIV感染的主要检测方法,包括初筛实验和确诊试验。
初筛试验最常用的方法是酶联免疫吸附实验(ELISA),确诊试验用免疫印迹法。
一般用ELISA初筛试验阳性的标本,要进一步用免疫印迹法来确诊后,才能做出最终的诊断结果。
竞争RT-PCR法定量检测多药耐药基因的表达
李勇;王玉芝
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】1997(0)Z1
【摘要】MDR1基因的表达量与肿瘤细胞的耐药性呈正相关且在多种肿瘤组织中都有过度表达。
准确监测肿瘤病人MDR1基因表达情况对选择化疗方案和提高化疗效果有重要作用。
在检测MDR1基因表达的方法中RT-PCR检测MDR1的过程中一般使用β肌动蛋白作为外参照,通过计算MDR1 cDNA与β肌动蛋白cDNA的比值来表示MDR1基因的表达量。
这样只能得到MDR1基因相对β肌动蛋白基因的表达量,而不能测出其绝对表达量。
而且扩增
【总页数】1页(P163-163)
【作者】李勇;王玉芝
【作者单位】军事医学科学院放射医学研究所;军事医学科学院放射医学研究所北京 100850;北京 100850
【正文语种】中文
【中图分类】R346
【相关文献】
1.RT-PCR法半定量检测不同逆境胁迫下TaGSK1基因的表达 [J], 李亚青;葛荣朝;赵保存;沈银柱
2.竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达 [J],
张晓杰;鲁纯平;唐建华;顾善兰;禹虹
3.竞争性RT-PCR定量检测AFP mRMA在肝癌组织中的表达 [J], 杜智;齐之丽;高英堂;王毅军;聂福华;景丽
4.RT-PCR法定量检测恶性淋巴瘤多药耐药基因的表达 [J], 龚福生;汪相如;陈蓉明;谢云青;郑秋红
5.一步法RT-PCR定量检测人IL-1β基因表达方法的建立与应用 [J], 喻凯;金子正之
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DOI:10.13419/ki.aids.2020.12.23•短篇报道•RT-PCR和NASBA方法检测52例HIV/AIDS病人HIV1RNA定量结果的比较严亚军,桂希恩,柯亨宁,冯玲,杨蓉蓉(武汉大学中南医院感染科,湖北武汉430071)关键词:1型艾滋病病毒;反转录荧光定量聚合酶链反应试验;核酸序列依赖性扩增试验中图分类号:R373.9文献标志码:B文章编号:1672-5662(2020)12-1355-021型艾滋病病毒核糖核酸(HIV-1RNA)定量检测,不仅可以预测H1V-1感染者疾病进展、评估抗病毒治疗效果及监测耐药,而且也可作为HIV感染辅助诊断,用于v18月龄婴幼儿的早期诊断、急性期/窗口期及晚期HIV感染者诊断Z。
因此HIV-1RNA定量是艾滋病防治工作中一项重要的实验室检测指标。
目前,国际上检测HIV-1RNA定量的方法主要有:反转录荧光定量聚合酶链反应试验(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增试验(NASBA)及分支脱氧核糖核酸信号放大试验(bDNA),由于这三种方法的原理不同而导致其敏感性均不同[4,o 本研究采用RT-PCR和NASBA方法平行检测52例HIV-1感染者血浆中的RNA定量并进行比较,以探讨两种方法检测HIV-1RNA定量的相关性及一致性。
1对象与方法1.1对象2018年1—12月,武汉大学中南医院感染科收治的HIV-1感染者,所有患者均经酶联免疫吸附试验初筛和蛋白印迹试验确证,共52例。
其中未治疗的(选择新发现HIV-1感染者)42例,治疗的(选择服药依从性好,而且治疗M1年HIV-1感染者)10例。
1.2方法1)用一次性EDTA-K2抗凝真空采血管采集外周静脉血5mL,血样标本在当天6h内3000r/min 离心15min,分离的血浆冻存于-70七超低温冰箱备用检测。
2)RT-PCR法检测HIV-1RNA定量采用美国罗氏公司的COBAS AmpliPrep/COBAS Taqman全自动分析系统及配套的试剂盒,该方法检测靶点为Gag/LTR、最低检测限为20拷贝/mL。
不同核酸提取方法检测HIV病毒载量和耐药基因的研究目的比较5种核酸提取法提取HIV RNA的效率。
方法收集2015年HIV 病毒感染者血样,使用不同核酸提取方法平行检测Ct值及载量值,分析检测的检出率、敏感性、变异系数、稳定性,并进行耐药扩增。
结果5种提核酸方法检出率国产磁珠法最高,5种方法差异无统计学意义(χ2=7.98,P=0.09);Ct值从小到大顺序为:国产磁珠法≥离心柱法>大批量法≥进口磁珠法>试剂盒自带法;重复性比较表明国产磁珠法检测结果较稳定;核酸胶显示国产磁珠法提取RNA 浓度最高;提取方法不影响耐药关键位点检测。
结论5种核酸提取方法均能检测HIV信息,国产磁珠法提取病毒核酸进行检测,敏感性和稳定性均较高。
[Abstract] Objective To compare the efficiency of HIV RNA extracted by five kinds of nucleic acid extraction methods. Methods Blood samples were collected from HIV infected persons in 2015. Used different methods of nucleic acid extraction to detect the Ct value and the load value. The detection rate,the sensitivity,the coefficient of variation,the stability,and the drug resistance were detected. Results Domestic magnetic bead method had the highest detection rate in five kinds of nucleic acid method,there was no statistically significant difference of 5 kinds of method (χ2=7.98,P=0.09). Ct values from small to large order:domestic magnetic beads≥centrifugal column method>large quantities of extraction method≥imported magnetic beads>phenol/chloroform cracking. Repeatability tests showed that domestic magnetic beads was stable;Nucleic acid gel showed domestic magnetic beads to extract RNA concentration was highest;Extraction method did not affect the detection of drug resistance. Conclusion Five kinds of nucleic acid extraction methods are able to detect HIV information. The viral nucleic acid extraction using magnetic beads method,sensitivity and stability are higher.[Key words] Nucleic acid extraction;Quantitative PCR;HIV load;Resistance gene;Magnetic beads;HIV RNA人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)已在全球肆虐40余年。
论著·临床辅助检查中国社区医师·医学专业2010年第29期(第12卷总第254期)191 b D N A 与R T -P C R 方法检测艾滋病患者病毒载量结果对比研究张淑琼 吕 浩 穆剑强 李 婷丁 恒661100云南红河州第一人民医院d o i :10.3969/j .i s s n .1007-614x .2010.29.201近几年来,艾滋病(A I D S )呈上升趋势,艾滋病(H I V )感染者人数近100万,因此,对A I D S 病例的及时治疗及疗效观察是当务之急的大事。
艾滋病病毒载量是艾滋病人抗病毒治疗中,疗效观察的两个重要指标之一,并可用于艾滋病人确诊后预示疾病演变,提示开始治疗时间。
目前艾滋病病毒载量检测方法主要有b D -N A 方法(分枝D N A 杂交试验)、N A S B A (自主核酸序列复制)、R T-P C R (逆转录-聚合酶链反应),b D N A 及N A S B A 方法只能用进口仪器及配套试剂进行检测,R T-P C R 方法有多种改进方法,可用进口或国产设备进行检测,我省大部分检测用b D N A 方法。
b D N A 方法检测费用昂贵。
我州属于艾滋病重灾区,为了寻找费用低廉,检测结果准确,重复性检测一致性好、稳定的艾滋病病毒载量检测方法,用于临床艾滋病病人抗病毒疗效观察,红河州第一人民医院用费用较低的巢式P C R 方法进行艾滋病病毒载量检测,并与b D N A 方法检测结果进行比较。
材料和方法标本来源:标本来自红河州第一人民医院2009年1月~2010年6月临床治疗病人250例,男199例,女51例,年龄20~72岁,平均37岁。
所有病人均经过云南省疾病预防控制中心艾滋病确认实验后,或由红河州疾病预防控制中心艾滋病确认实验确认感染H I V-I 。
病人抽静脉血5~10m l 置于以E D T A 真空采血管内颠倒混匀5~10次,1500r p 离心1~5分钟分离血浆,将血浆分装于2~5个冻存管内,立即放-80℃冰箱保存,检测前将标本用冷水解冻后立即进行检测。
检测仪器及试剂方法:使用拜耳公司生产的Q 340荧光讯号测计仪,采用配套H I V-I 载量试剂检测,严格按使用说明书操作。
仪器采用达安公司生产的D A-7600扩增仪,试剂采用达安公司生产的人类免疫缺陷病毒I 型(H I V-I )巢式核酸扩增(巢式P C R )荧光定量检测试剂盒。
严格按使用说明书操作。
检测方法:b D N A 方法:浓缩提纯样本,加50m l 粉红色浓缩指示剂及1000μl 病人样本于1.5m l 离心管内,以相同方法加6个标准品,低阳、高阳质控品,阴性对照品于离心管内,立即置低温高速离心机4℃23000×g 离心1小时,取出离心管弃去上清液,留下20μl 浓缩标本放-80℃冰箱半小时。
裂解病毒及捕捉病毒核酸:从冰箱取出样本加裂解液120μl ,置63℃水浴箱内裂解2小时,裂解后经短暂离心及混匀,加100μl 裂解处理后的标本于包被有捕捉探针的微孔内,放入b D N A 检测仪内53℃孵育16小时。
进行信号放大、测量、计算结果:孵育后进行以下操作,由仪器对微孔清洗,手工加入100μl 前放大器,孵育30分钟;清洗,加入100μl 放大器(b D N A ),孵育30分钟;清洗,加入100μl 碱性磷酸酶,孵育45分钟;清洗,加100μl 荧光底物,孵育30分钟;仪器检测荧光强调,由同时测定的标准曲线计算出标本内病毒载量,结果以C o p i e s (拷贝)/m l 表示,检出限50C o p i e s /m l 。
结果有效性判断,标准曲线呈一条斜向右上的光滑曲线,低阳及高阳质控品检测结果在规定范围,阴性质控检测结果小于检出线。
结果表示:H I V R N A 含量小于检测线50C o p i e s /m l 只报<50,H I V R N A 含量大于50C o p i e s /m l ,报具体数值。
检测方法:巢式P C R 方法:提取R N A :取灭菌的0.5m l 离心管加入10μl R N A 提取液A 及100μl 血浆,再加入200μl R N A 提取液B ,振荡混匀,室温放置5分钟,8000r p m 离心1分钟,吸去上清液。
加200μl R N A 提取液B ,充分混匀。
加预冷的75%乙醇400μl 充分混匀,8000r p m 离心1分钟,弃去上清液,打开管盖,65℃干燥10分钟,盖上盖待用。
逆转录:向干燥后的沉淀管加入18μl 逆转录反应液及逆转录酶系2μl ,37℃放置45分钟,95℃加热3分钟,8000r p m 离心1分钟,待用。
第1次P C R 扩增:取蓝色P C R 反应管(内装扩增体系),加入逆转录产物5μl ,8000r p m 离心数秒,放入仪器样品槽。
循环条件:50℃5分钟,93℃3分钟,93℃30秒……95℃30秒,72℃30秒,15个循环。
第2次P C R 扩增:取无色P C R 反应管(内装扩增体系),加入第1次扩增产物5μl ,同时在外反应管加定量参考品5μl (4个浓度),8000r p m 离心数秒,放入仪器样品槽。
循环条件:93℃2分钟、93℃45秒、55℃60秒……10个循环,93℃30秒、55℃45秒……30个循环。
分析条件设置:根据分析后图像调节B a s e l i n e 的S t a r t 值设定阈值,使S t dc u r v e 窗口下的标准曲线图达到最佳,即C o r r e t -e l a t i o n 数值介于-0.97到-1.0,在A n a l -y s i s 分析菜单下选择A n a l y z e 自动分析结果。
质量控制:阴性质控品为阴性,阳性质控品:全部阳性,临界值阳性质控品值在1.000×102I U /m l ~2.500×103I U /m l 范围。
阳性定量参考品:全部阳性,且0.97≤︱r ︱≤1。
以上要求需在同一次实验中同时满足,否则本次实验无效,全部实验应重新进行。
结果判定及表示:阴性结果判定:如果增长曲线不呈S 型曲线或C T 值≥30,则实验结果判定为样品的H I VR N A 含量小于检测限100I U /m l ,只报<100I U /m l ;阳性结果判定:如果增长曲线呈S 型曲线,C T 值<30,则判定为阳性,定量由仪器根据同时测定的标准曲线或自动计算,报告具体数值,病毒载量单位:I U /m l 。
结 果两种方法检测艾滋病标本250例,在250份样本中,以b D N A 方法检测结果参照,在b D N A 方法检出250份,巢式P C R 方法检出250份中,检出率达96.8%,见附表。
结果重复性:用巢式P C R 方法20例标本检测2次,检测重复性较好。
详见表1。
讨 论艾滋病病人在抗病毒治疗中,需对病人体内艾滋病病毒载量进行测定,以观察疗效,因此,不仅要求准确的定量结果,而且要求检测结果稳定,以便对比。
b D N A 方法采用信号放大的原理,用覆盖H I V-I 基因全长的捕捉探针包被微孔,捕捉标本内H I V-I 核酸,捕捉的H I V-I 核酸经b D N A 放大并用荧光标记,用荧光测计仪检测荧光,荧光强度与标本内H I V-I 含量成正比,经同时测定的标准曲线,计算论著·临床辅助检查C H I N E S EC O M M U N I T YD O C T O R S 192 中国社区医师·医学专业2010年第29期(第12卷总第出标本内H I V-I 含量,即艾滋病病毒载量。
由于采用信号放大,并使用H I V-I 基因多个保守区多条寡核苷酸探针,能够与H I V-I m 群的A-F 亚型结合,减少基因变异对实验准确性的影响,因此,检测艾滋病病毒载量结果准确可靠,重复性好。
目前在国内较多的用于艾滋病病人抗病毒疗效观察。
但b D N A 方法必须使用进口的配套试剂,检出费用高。
P C R 采用稳定引物,将H I V-I 核酸片断成几何级数扩增,经荧光标记进行检测,同时测定标准曲线,返算出标本内原始拷贝艾滋病病毒载量,巢式P C R 方法采用两次扩增,在第1次扩增15个循环,再将扩增产物加入新的扩增体系扩增40个循环,以提高检测灵敏度,能检出标本中较低拷贝数的病毒。
巢式P C R 方法与b D N A 方法对艾滋病病毒载量检测结果进行对比。
巢式P C R 方法相对于b D N A 方法符合率96.8%,巢式P C R 方法检测试剂稳定性,经过1年多的使用,及对同一标本对次检测结果进行分析,检测结果较稳定。
研究采用的巢式P C R 方法检测试剂盒为国产试剂,费用仅相当于b D N A 方法的1/9。
每次检测附加费用少,易于小批量标本检测,缩短检测周期,及时出报告。
H I V-Ⅰ的病毒感染、传播及A I D S 病程的发展至关重要。
当前全球A I D S 流行日趋严重,特别是在发展中国家。
我国A I D S 的流行正在进入高速发展期,采取有效的预防和治疗措施十分必要。
依据H I V-Ⅰ感染者的疾病状态,对他们进行适时合理的的治疗是预防治疗A I D S 的重要措施。
本次实验提供了两种方法检测艾滋病病毒载量结果客观数据,为临床实际选用检测、及时提供了更多的选用依据。
效益分析:进口试剂的国产化是我国医学检验发展的重要任务之一[1]。
该试剂应用一年余,与进口试剂比较及临床应用效果观察,表明国产试剂完全可以代替进口试剂。
因此,有推广的价值,获得准确结果,起到了与进口试剂同样的作用。
与进口试剂相比,其成本仅为进口试剂的1/9,具有良好的社会效益和明显的经济效益,值得推广应用。
今后努力的方向:经与进口试剂比较及应用,该试剂结果稳定、重复性好,易于小批量标本检测,缩短检测周期,及时发出报告。
我们将采取多种方式积极推广使用,使该项目在我省发挥显著的社会效益和经济效益。
参考文献1 丛玉隆.当代血液分析技术与临床.第1版.北京:人民卫生出版社,1997,12:113-122.表1 250例病毒载量检测结果比较仪器例数检测符合数不符合数符合率%0340荧光检测仪250250096.8P A -7600扩增仪2502428论著·社区中医药温阳解表法治疗肥厚性鼻炎64例吕国洪 王 磊136200辽源市中医院摘 要 目的:通过中药温阳解表法治疗肥厚性鼻炎,免除患者手术之痛苦及其所带来的创伤。
方法:口服中药汤剂,发汗祛风,饮食调理。
结果:通过临床应用,80%患者得到治愈。
结论:温阳解表法对治疗肥厚性鼻炎有显著效果。