香菇组织分离方法

食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项食用菌菌种分离的方法和操作步骤菌种分离即是进行食用菌菌丝纯化的过程，它是制种工作的重要环节，通俗地讲就是把食用菌菌丝从自然中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯食用菌菌丝的过程。

菌种分离是一项重要而又细致的工作，每个环节都必须严格按照无菌操作规程进行。

食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。

1.组织分离法组织分离法是将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。

其特点：一是属于无性繁殖，能够保持原有菌种的优良特性，是生产中获得纯菌种的常用方法，且简单易行，取材广泛，菌丝萌发快。

二是组织分离操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。

但对银耳、黑木耳等胶质菌因其子实体种菌丝极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

1.1子实体分离种菇要选择朵大盖厚、柄短、八九分成熟的优良品种。

切去菇体基部，在超净工作台用75%的酒精棉球进行擦拭菌盖与菌柄两次，进行表面消毒。

接种时，只要将种菇撕开，用消毒后的小刀在菌柄与菌盖的交界处切取一小块组织，再用接种针将组织块放入PDA培养基的试管斜面中间。

置于24℃温度下培养3-5天就可以看到组织块上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。

如香菇、平菇等可以使用此方法。

1.2菌核组织分离茯苓、猪苓、雷丸等食用菌的子实体不易采集。

而常见的是它储藏营养的菌核。

用菌核分离，同样可以获得菌种。

方法是将菌核表面洗净，用酒精消毒，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，在24℃下培养，产生菌丝后进行分离纯化。

应注意的是，菌核是储藏器官，大部分是多糖类杂质，只有少量的菌丝，因此挑选的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分离出菌种。

1.3菌索分离法菌索分离常用于蜜环菌分离。

方法是选新鲜的活菌索，用75%酒精棉球将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀切成小段，接入PDA斜面培养基上，在24℃下培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。

关键环节。

干燥温度越高,豇豆接收的热量越高,水分蒸发的越快,干燥速度越快。

但高温会导致豇豆干制品色泽呈现黄褐色,影响成品的质量。

此工序操作要点:将烘房的温度升高至50℃,将预处理好的豇豆推进烘房,每2小时增加5℃直至60℃保持恒温。

当豇豆水分降到8%以下即可停止干燥。

9.包装干燥后的豇豆进一步挑选,剔除不符合外观要求的豇豆干,按重量要求称重,装入复合食品包装袋并封口,或使用聚乙烯复合包装袋真空包装。

二、产品标准1.感官指标产品色泽正常、清洁;均匀一致、无黏结;具有原豇豆的气味和滋味,无异味;无病虫害、机械伤,无肉眼可见外来杂质;95℃热水浸泡2分钟基本恢复脱水前状态。

2.理化指标水分≤8%,总灰分(以干基计)≤6%,酸不溶性灰分(以干基计)≤1.5%,砷≤0.5毫克/千克,铅≤0.2毫克/千克,镉≤0.05毫克/千克,汞≤0.01毫克/千克,亚硝酸盐≤4毫克/千克,亚硫酸盐≤30毫克/千克。

3.微生物指标菌落总数≤100000CFU/克,大肠菌群≤300MPN/100克,致病菌(系指肠道致病菌及致病性球菌)不得检出。

4.净含量允差应符合国家质量监督检验检疫总局第75号令《定量包装商品计量监督管理办法》规定。

(收稿日期：2014-11-26)香菇母种制种方法宋燕(拜城县赛里木镇农业技术推广站,拜城842300)香菇又叫冬菇,它香味浓郁、味道鲜美,内含有多种氨基酸和人体必需的微量元素。

在拜城县栽培,使用麦秆、稻壳等农作物秸秆作原料,生产出的产品为绿色、无公害产品,不仅营养丰富、口感鲜嫩,而且具有一定的保健作用,深受广大消费者青睐。

在生产实践中,一般采用孢子分离法、组织分离法、基质内菌丝分离等方法繁殖母种。

一、材料准备菌种灭菌仪、酒精灯、卫生棉、试管斜面PDA培养基、香菇较成熟的子实体、75%酒精、接种针、超净工作台、解剖刀、玻璃漏斗、纱布、搪瓷盘等。

二、组织分离法制作母种利用香菇子实体内部组织,进行无性繁殖而获得母种的简便方法,即组织分离法。

菌种分离与培养（1）人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过程叫做菌种分离。

从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。

在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。

一、母种培养(一)菌种分离菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。

1.孢子分离法孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。

(1)孢子的采集①种菇的选择用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、无病虫害、八成熟的菇体。

一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。

不同的食用菌选择的具体要求是：香菇菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八成熟的子实体。

双孢蘑菇菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单生菇。

草菇菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。

平菇出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而无病虫害的子实体。

木耳选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。

银耳朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。

猴头形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。

金针菇出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。

②种菇的消毒子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。

对子实体层未外露的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。

实验五菌种组织分离法
目前食用菌主要栽培种类如平菇、香菇、草菇等生产上多采用组织分法制备菌种。

一、目的：
了解和掌握食用菌组织分离法的方法步骤，制备出栽培用菌种。

二、实验器材：
1、平菇或香菇等子实体。

2、接种箱、解剖剪、解剖刀、镊子、试管斜面、75%酒精、酒精棉球、无菌水、培养皿、紫外线灯、或硫磺。

三、实验方法：
1、菌种的选择：在出菇场要选择肉厚肥大、鲜嫩，出菇早、菇形整齐、菌柄短且无病害的做种。

2、将种菇表面用清水冲洗干净，放在接种箱（或无菌室内）进行表面消毒。

用镊子将种菇放在培养皿内，用另一反镊子夹75%酒精棉球（或0.1%升汞棉球）对种菇进行表面消毒，然后移入另一培养皿内再用无菌水反复洗涤三次，洗净残留的消毒剂。

3、用解剖刀或鲜剖剪蘸酒精进行火焰消毒，冷却后把自己消毒的种菇纵切开，然后用菌盖笔菌柄交界处，切取长宽的0.3-0.5厘米的菌肉组织块，用接种针移到斜面培养基上，置24℃恒温箱中培养。

4、每天检查试管斜面菌落生长情况，如从分离的菌肉组织块上长出正常的白色菌丝，即分离成功，及时将生长出来的菌丝转移新的试管斜面。

若在组织块附近或其他地方出现其他颜色杂菌生长应予以淘汰。

四、作业：
叙述组织分离的方法步骤，体会和注意事项，观察记载斜面菌落生长速度和成功率。

香菇的组织分离和培养一、实验目的1、了解食用菌的基础知识。

2、了解、掌握食用菌培养基的配置原理。

3、通过平菇栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法。

二、实验原理（食用菌的组织分离法）食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。

利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。

三、实验材料1、原种制作实验材料（1）食用菌：香菇。

（2）培养基：PDA培养基斜面。

（3）仪器或其他用具： 75%酒精棉球、接种针记号笔等。

2、食用菌的组织离2、食用菌的组织分离（1）试剂：棉籽壳、麸皮、蔗糖、CaCO3（2）仪器或其他用具：平菇菌种、香菇菌种、金针菇菌种、姬菇菌种、茶树菌种、台秤、盆子、聚丙烯塑料袋、颈圈、封口膜、橡皮筋、高压蒸气灭菌锅、pH试纸（pH 5.5—9.0）、记号笔、麻绳等四、实验步骤1、原种制作实验材料（1）拌料按培养料配方准确称取所需棉籽壳和麸皮放入大盆中用手搅拌混合均匀，将所需的蔗糖和CaCO3溶于水中，然后泼洒在棉籽壳和麸皮上，边加水边搅拌，直至均匀。

搅拌好后，焖30分钟，使培养料吸水均匀。

（2）侧培养水分培养料搅拌好后，用于抓一把培养料握在手中，攥紧，手指缝中有水印但无水滴滴下，这时的含水量适合，为60%—62%，若含水量不足，可再加少量的水，充分搅拌均匀，在检测，直至含水量合适为止。

（3）装袋边加边将培养料压实，装至3/4左右，袋口套上颈圈，用木棒在培养料中打一洞，盖上封口膜，用橡皮筋扎紧。

（4）灭菌 126 ℃高压蒸气灭菌90分钟。

（5）接种栽培袋冷却到25℃左右，在超净工作台上用镊子或接种枪夹取所需菌种（1个鸡蛋大小）放入培养料袋的洞中。

（6）培养接种后的栽培袋，放入23- 25℃培养室，堆放高度三至四层，空气湿度60%-65%，每周翻堆一次，使上下发菌一致，同时挑出污染的栽培袋丢弃，一般30-40天，菌丝即可长满菌袋。

（7）出菇管理（8）采收2、食用菌的组织分离1、整菇插种法（1）选择种菇：选择肥壮菇体作种菇；（2）种菇消毒：取1张菇片，用 70%的酒精轻擦表面进行消毒；（3）菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA试管斜面上；（4）培养：将试管斜面置于15～30℃下培养； 2、贴附法（1）、将接种针在酒精灯上灼烧，然后将接种针迅速插入斜面培养基的中间位置，使产生的水蒸气冷凝到试管壁上，再用接种针勾取香菇小片刚破膜的成熟菌褶，贴附于斜面相对应的试管相对应的试管内壁上，并使试管斜面朝上，平放在培养箱内，12—24h 后，在试管斜面上就落下许多孢子。

菌种的分离与培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。

所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。

菌种分母种、原种、栽培种。

(一)母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为袍子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。

1.袍子分离法袍子分离法，是用食用菌的有性袍子或无性袍子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。

这种菌种生活力较强，但袍子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。

(1 )单袍分离法：是每次或每支试管只取一个担袍子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。

蘑菇和草菇用单袍分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。

单袍分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多袍分离法。

(2)多袍分离法：就是把许多袍子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。

具体操作方法，有以下几种：①种菇袍子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。

在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。

培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12-20小时，菌褶上的袍子就会散落在培养皿内。

形成一层粉末状袍子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色, 香菇、金针菇袍子印白色）。

用接种针沾取少量袍子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。

待袍子萌发，生成菌落还可用袍子采集器收集袍子。

方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在袍子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。

随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。

并在纱布上倒少许升汞或无菌水。

移入20对左右恒温箱培养。

时，选袍子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。

②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇,用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的袍子，再在培养基上划线接种。

野生香菇：菌种分离操作步骤野生香菇是可以分离出菌种的，但分离出的菌种是不是能够成活，能够成活，是否在人工种植中能够适应人工模拟的生长环境，也具有着不确定性。

如果要它成为人工种植中能使用、并且具有优良的抗性、出菇性能、产量性能、质量性能还需进行无数次的驯化，驯化成功才能被作为新品种进行推广使用。

对野生香菇进行分离并不难，其中最容易的就是采用组织分离法。

所谓的组织分离法，简单的说就是利用香菇组织能再生菌丝的特性，取一块香菇的新鲜组织，放进装有培养基的试管中，再把试管放置在适于香菇菌丝体生长的恒温环境中，进行菌种培育，详细操作步骤如下。

一、PAD培养基制作用组织分离法制作菌种，必须先制作好PDA培养基备用。

1.所用原料马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15克、水1000毫升。

2.制作马铃薯洗净去皮，切成小颗粒，放入铝锅中，加入1000毫升水，进行蒸煮至沸腾。

沸腾状态下保持30分钟后，关火。

用三层以上纱布对锅中的马铃薯进行过滤，把经过过滤得到的马铃薯溶液倒入量杯中。

接着，把葡萄糖、琼脂放入量杯中，并把量杯中的水补足1000毫升后，进行搅拌均匀，使葡萄糖和琼脂充分溶解。

如溶液温度过低，不能充分溶解，可对量杯进行加热，直至全部溶解。

3.灌装试管就是把调节好的培养基趁热用漏斗灌装进早就准备好的试管中，灌装量是试管容积的1/5~1/4，灌装完毕，试管盖紧胶塞，每7支为一组为一组进行捆扎。

4.灭菌把试管放进高压灭菌锅中进行灭菌。

灭菌温度121℃、压力0.105Mpa，灭菌时长30分钟，灭菌过程中，要注意排净高压灭菌锅中的冷气。

灭菌后，锅内温度降至80℃时，放净锅中蒸汽，取出试管。

5.摆放试管斜面。

灭菌锅中取出的试管放置在平台上，试管开口端用物垫起，让试管内培养基形成斜面，使试管内培养基最高处处于试管的1/2位置，试管上覆盖毛巾或棉垫类物品，避免试管内出现冷凝水。

试管中的培养基凝固，试管斜面培养基制作完成。

6.杂菌测试。

食用菌是指可以食用并具有药用价值的真菌类食物，如蘑菇、姬松茸等。

而食用菌的孢子分离和组织分离则是对食用菌进行研究和培育的重要步骤。

在食用菌的育种工作中，为了培育出更好的品种，更高产的果实，需要对食用菌的孢子和组织进行分离，以便于选育和培育工作的进行。

下面将从孢子分离和组织分离两个方面进行详细介绍。

一、食用菌孢子的分离方法食用菌的孢子是食用菌繁殖的重要途径，通过对孢子的分离研究可以得到更多的信息，为食用菌的培育提供更多的可能性。

食用菌孢子的分离方法主要有以下几种：（一）取材准备：首先需要选取新鲜的食用菌菌丝体，将其移植到含有蔗糖和琼脂的琼脂培养基上进行培养，使其长出菌丝。

（二）孢子成熟：待菌丝长成成熟后，可以使用电镜或显微镜观察孢子的成熟情况，判断孢子是否已经成熟，如果孢子已经成熟，则可以进行下一步的提取和分离工作。

（三）孢子提取：将成熟的孢子用生理盐水进行冲洗，得到高纯度的孢子悬浮液。

（四）孢子分离：通过对孢子进行稀释和悬浮，可以使孢子在琼脂培养基上形成分立的克隆菌落，方便后续的研究工作。

二、食用菌组织的分离方法食用菌的组织分离是为了研究食用菌的生长发育规律，以及进行病原菌的筛查和检测等工作。

食用菌组织的分离方法主要有以下几种：（一）细胞分离：通过组织分离酶的作用，可以将食用菌组织细胞从整个菌体中分离出来，得到高纯度的细胞悬浮液。

（二）组织培养：将分离出的食用菌组织细胞进行培养，可以观察到组织的生长和分化情况，并进行相关的研究工作。

（三）组织切片：将食用菌组织进行切片处理，通过显微镜观察组织的结构和形态，为后续的研究提供可靠的数据基础。

（四）组织冻存：将分离出的食用菌组织进行冷冻保存，以备后续的实验和研究。

通过以上对食用菌孢子分离和组织分离的方法进行详细介绍，可以看出，食用菌孢子分离和组织分离是食用菌育种和研究工作中重要的前期准备工作。

通过不断改进和优化这些分离方法，可以为食用菌的培育和研究工作提供更多的可能性和便利。

食用菌组织分离法实验报告食用菌母种的制作——组织分离法实验报告实验目的：学习和掌握食用菌的组织分离法；一、实验原理：食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。

利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。

二、实验器材：1. 食用菌：香菇、平菇。

2. 培养基：PDA培养基斜面。

3. 仪器或其他用具：75%酒精棉球、接种针记号笔等。

三、实验方法：1. 选择种菇：选择肥壮菇体作种菇；2. 种菇消毒：取1张菇片，用 70%的酒精轻擦表面进行消毒；3. 菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA试管斜面上；4. 培养：将试管斜面置于15～30℃下培养；五、注意事项1. 在整个操作过程中都要注意无菌操作，一切用具都要消毒。

2. 要等刀片冷却后再切取组织块。

六、实验结果与记录第一次实验：10月16日上午进行接种，两试管都以肥壮的双孢菇为种菇，10月13日观察培养基结果分析：本次实验全班只有一人成功，大部分都被杂菌污染，最有可能的原因就是制作的PDA培养杂菌没有菌落产生基本身受到污染，但是又有培养基根本没有菌落产生，那么一方面可以看做是空白对照，得到培养基本身没有问题而是我们操作都有问题，没有做到避免污染，规范的无菌操作，另一方面也有可能是在接种过程，接种针，试验刀酒精灯上灼烧后未冷却直接接触种菇，使待接种的菌块高温致死。

第二次实验：10月30日上午进行接种，记号笔标记的两支试管为双孢菇，标签纸标记的两只试管为香菇进行实验，10月9日观察实验基本成功，试管下端有少部分红棕色杂菌无杂菌，也无目的菌落实验成功，无杂菌，斜面上均为雪白的菌丝结果分析：培养基本身无污染，接种香菇菌块的过程中可能由于接种针和实验刀未完全冷却导致目的菌块高温致死，培养基上无菌落产生。

接种双孢菇菌块过程中基本做到了无菌操作，实验较为成功。

实验感想：本实验原理目的简单，操作过程方法在微生物学中也有接触，但是容易杂菌污染，第一次实验结果几乎全军覆没，几乎所有培养基都受到了污染，第二次实验在总结前一次的基础上，大部分做到了无菌操作，看到了培养基中雪白的菌落。

香菇母种繁育技术用香菇的组织、孢子或菇木的菌丝经分离、纯化和转管培养出来，再用于繁殖原种或保存用的菌种，称为母种。

但具体如何繁育？有以下几项要点。

一、菌种分离1、组织分离要培养出优良的菌种，必须要有好的母种，好的母种又来源于健壮的香菇个体，因此，首先必须选择发育正常、个体健壮、没有虫咬的新鲜菇蕾作为分离的材料。

菇蕾采回后，不需用水洗，也不需用药水消毒。

放入干净的培养皿内，用消毒过的手或解剖刀将香菇从中剖开，在盖与柄接触的部分切取黄豆大小的菌肉，放在已准备好的培养基上，塞上棉花即可。

2、孢子分离选择个体强壮，八分成熟的香菇，除去菌柄，菌褶朝下挂在玻璃漏斗上一条特制的铁丝钩上，漏斗盖住培养皿(培养皿放在一只垫有纱布的搪瓷盆中)，静放12-20小时，菌褶上的孢子(种子)便大部分落在培养皿内，形成一层白色粉末状物，即可作为分离培养使用。

孢子接种时，用接种针取出少量孢子，用无菌水配制成孢子悬浮液。

再用接种针，取出少量悬浮液，用划线的方法接种于培养皿内的培养基上，待孢子萌发，生成菌落后，选择孢子最先萌发并生长最好的菌落进行纯化转管繁殖。

3、菇木菌丝分离选取未出过菇或刚出过菇不久、但已恢复菌丝生长的菇木(肉眼看不见杂菌)一小段，拿回室内，不需表面消毒，用皮带冲在要分离的部分，将树皮取掉，然后用酒精消毒皮带冲，冲口在酒精灯火焰上灭菌，灭菌后，即时打入菇木已取皮的部分，迅速取出皮带冲，用灭过菌的小剪刀在冲口菇木块中间，剪下黄豆粒大小的一块，接入培养基上即可。

以上三种分离法，整个过程均应在无菌室内进行，一切用具均应经过严格消毒，以防杂菌污染。

无菌室事前要用5%的石炭酸喷射，有条件的再经过紫外线灯照射20-30分钟。

接种台上最好铺上一块用2%的来苏尔消毒过的湿纱布。

二、培养菌种分离接种后，放在25℃左右条件下培养，两三天即可看见白色棉花状的菌丝从菇肉或木块上长出，三、四天便可看见从孢子萌发出的白色菌丝，十多天整个试管长满菌丝。

香菇组织分离方法
随着东北地区香菇栽培面积的不断扩大，香菇品种也在逐年更新。

组织分离方法是一种香菇无性繁殖方法，这种分离母种方法，操作简便，其繁殖的后代变异小，能保持原菌株的优良特性，因此大多数科研院校及制种单位，在品种审定后，都采用这种方法来保持菌株的优良种性，并用其原始母种扩繁原种及栽培种，并应用于生产。

一般3～4年后，菌株才开始逐渐表现出衰老退化现象。

1.分离用种菇的选择在优良品种出菇选择单菇重量大、菌盖圆整、菌柄细短、菌肉厚实、颜色鲜、有鳞片且无病虫害的单菇，要求开伞度在7～8分正处在正常生长中的种菇。

2.种菇的消毒处理选好的种菇带入接种室内，剪去菇根，用消毒镊子夹住菌柄，并用1%的升汞水或用75%的医用酒精擦拭消毒2～3遍，然后将分离用工具用常规法消毒后移入无菌分离区。

3.分离种菇的组织块在无菌条件下，用酒精擦手消毒后，用手纵向将种菇掰开，迅速用接种刀将掰开菇的菌盖和菌柄的交界处菌肉上横划两刀，并在划口中间每隔2毫米竖划一刀，及时用镊子夹取组织块，迅速接入试管斜面培养基中间部位，并用镊子稍压一下，以保证组织块与培养基充分接触。

4.母种的培养接种后将试管放在温度23～25℃的培养箱中，经2～3天，可见组织块周围有灰白色放射状的菌丝，再过1～2天菌丝开始蔓延到试管斜面上。

大约12～15天
菌丝可长满整个试管，选择菌丝洁白粗壮、整齐一致平铺于斜面上的试管留作母种，其余淘汰。

母种经低温复壮后就可以扩繁原种、栽培种及进行出菇试验。

一、实训目的本次实训旨在通过食用菌组织分离技术，掌握食用菌菌种分离、纯化、培养和保存的方法，提高学生对食用菌菌种学基础理论和实践技能的理解与应用能力。

二、实训时间2023年X月X日至X月X日三、实训地点XXX大学生物实验室四、实训材料与设备1. 材料与试剂：- 食用菌样品：香菇、金针菇、平菇等- PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）- 酵母提取物、葡萄糖、琼脂粉、氯化钠、琼脂糖、蒸馏水等- pH试纸- 高压蒸汽灭菌器- 灭菌手套、灭菌镊子、酒精灯、剪刀、解剖针、培养皿、移液管等2. 设备：- 电子天平- 高压蒸汽灭菌器- 灭菌工作台- 培养箱- 显微镜五、实训内容与方法1. 食用菌样品的处理（1）选取新鲜、无病虫害的食用菌样品，用无菌剪刀剪去菌柄、菌盖等非菌丝组织。

（2）将菌丝组织置于无菌培养皿中，用解剖针轻轻挑取菌丝，置于另一无菌培养皿中。

2. 菌丝组织的表面消毒（1）用75%酒精对菌丝组织进行表面消毒。

（2）待酒精挥发后，用无菌水冲洗菌丝组织，去除残留的酒精。

3. 菌丝组织的分离与纯化（1）将消毒后的菌丝组织剪成小块，置于无菌PDA培养基上。

（2）将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养。

（3）观察菌丝生长情况，挑选单菌落进行纯化培养。

4. 菌种保存（1）将纯化后的菌种接种于PDA斜面培养基上。

（2）将斜面培养基放入4℃冰箱中保存。

六、实训结果与分析1. 食用菌菌丝组织的分离与纯化在本次实训中，成功分离出香菇、金针菇、平菇等食用菌的纯菌丝。

通过观察菌落特征，如菌落形状、颜色、菌丝密度等，可以初步判断菌种的纯度。

2. 菌种保存在4℃冰箱中保存的菌种，经过一段时间后，仍能保持良好的生长状态，说明菌种保存方法可行。

七、实训总结通过本次实训，我掌握了食用菌组织分离的基本方法，提高了对食用菌菌种学基础理论和实践技能的理解与应用能力。

以下是实训过程中的几点体会：1. 实验操作过程中，无菌操作至关重要，要严格遵守无菌操作规程，避免污染。

菇的菌种分离技术实验香菇 Lentinus edodes (Berk.) Sing, 别名冬菇、花菇、香菌、厚菇等。

在真菌分类学上属真菌门、担子菌亚门、层菌门、蘑菇目、口蘑科、香菇属。

在我国的江西、浙江、湖北、广东、四川、云南、海南、台湾等省均有分布。

香菇迄今为止已有千年的栽培历史。

中国是世界香菇栽培的发源地。

香菇是世界性消费的菇类，是人们喜爱的美味佳食，不但具有清香味鲜的独特风味，而且含有大量对人体有益的营养物质，具有很高的营养价值和经济价值。

国内外市场的需求量很大，有着广阔的发展前景。

袋栽香菇，能进行规模化生产，集约化管理，是今后一个阶段香菇发展的方向。

香菇栽培均以纯丝接种，亦先制备纯菌种。

菌种有固体菌种和液体菌种两大类。

根据香菇生长发育所需营养成分，制成液体培养基，再加入一定量固化剂如琼脂等，即可制成固体培养基。

一、试验原材料野生香菇、PDA培养基、CPDA培养基、刀、剪、镊子、玻拌等。

二、试验方法1、培养基的制作（1）、配方A 马铃薯琼脂培养基（PDA基），马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18~20g，水1 000ml，pH ~6配方B 综合培养基（CPDA基），PDA加磷酸二氢钾3g、硫酸镁、VB1 5~10mg、琼脂18~20g，水1 000ml，pH ~6（2）、配制方法选择质量好的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分。

切成蚕豆小块称取马铃薯，加水1 000ml，煮沸并保持30min，然后用4层纱布过滤，滤汁内加入琼脂和葡萄糖，在文火上使琼脂融化，加水补足到1 000ml，调pH至~6。

趁热将此汁液装入试管中，每支试管装10~15ml。

试管口用棉花塞塞紧，外面再用双层报纸包扎，以防棉塞受潮，将试管放入高压灭菌锅中，在121℃/30min，灭好菌后，将试管摆成斜面，待培养基冷却后凝成斜面即为斜面培养基。

2、接种室及接种用具的消毒将无菌室内紫外灯及超净工作台上的紫外灯打开照射30min，然后将室内的风扇及超净工作台上的风扇打开通风30min。

大型真菌分离与保存技术这里的大型真菌主要是指蕈菌，通常说的食用菌这块或蘑菇。

(一)、菌种分离及保藏菌种分离是对真菌菌丝的纯化过程，是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。

蘑菇菌种的分离方法有三种：即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。

1. 孢子分离法蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。

孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。

（1）采集孢子采集孢子首先要选好的子实体。

一般选用个体健壮，特征典型的子实体，将选好的子实体采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。

随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩。

这套孢子收集装置需事先进行高压灭菌消毒。

把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20°C的室内,经24-48小时左右，可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。

在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。

在野外时，可用火烧红消毒的刀切割一小块组织，用硅酮粘在培养皿盖子内面上让孢子弹射到培养基上。

2. 孢子分离多孢分离法：即把多个孢子接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易。

实验一、香菇多糖的分离提取一、实验目的让学生了解香菇多糖的理化性质及提取工艺流程，掌握真空浓缩技术。

二、实验原理香菇是一种药食两用真菌，具有提高免疫力、抗癌、降糖等多种生理功能。

水溶性多糖作为香菇主要活性成分之一，主要以©1,3-葡聚糖的形式，分子量从几万到几十万不等。

通过有机溶剂提取，真空浓缩技术进行分离提取。

三、实验材料与试剂原料：干香菇500g试剂：氯仿、正丁醇、医用纱布、浓硫酸、重蒸酚、工业酒精四、实验仪器组织捣碎机、水浴锅、旋转蒸发器、1cm比色皿、751分光光度计、电子天平、台式离心机、试管、量筒、烧杯、玻璃棒五、提取工艺流程1.1kg干香菇切成小块，以1：10 （重量比）加入水，用组织捣碎机进行均质；2.取200mL均质液放入1L烧杯中，再加入300mL蒸馏水，加热至沸后，温火煮沸1小时，（注意：煮沸过程中用玻璃棒不断搅拌，以免烧杯底部发生糊结；并间歇加入少量水，使杯内液体体积保持在500mL左右；3.加热完毕后，将杯内液体用8层纱布过滤，除去残渣，上清液转入另一烧杯中;4.将上清液倒入圆底烧瓶中，在旋转浓缩仪上进行浓缩，浓缩条件为-0.1MPa、60℃,浓缩液体积至100mL左右停止；5.将浓缩液在1义10000g离心10min,将上清液转入另一烧杯，除去残渣；6.上清液中加入等体积的氯仿正丁醇浓液（体积比为4：1）,搅拌5min,静置30分钟；7.将混合液体在1义5000g下离420min,分离水相；8.在水相中加入终浓度为80%的酒精，搅拌均匀，静置20min, 1X5000g下离心10min；9.取出沉淀物，放入已称重的干燥表面皿中，在真空干燥箱中80℃下真空干燥;10.干燥后，称重，计算多糖的产率;11.准确称取干燥后多糖20mg于500ml容量瓶中，加水定容；12.取定容液2ml加入6%苯酚1ml,混匀，再加入浓硫酸5ml,混匀，放置20min后，于490nm测吸光度；13.葡萄糖标准曲线的制定：准确称取葡萄糖20mg定容于500ml容量瓶中，分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及 1.8ml，补水至2ml，依12步骤反应液，并分别测吸光度，根据葡萄糖浓度和吸光度绘制标准曲线；14.根据香菇多糖吸光度和葡萄糖标准曲线，计算多糖纯度。