ipt 基因定位表达对转基因烟草育性的影响

烟草叶片衰老相关基因作者：高晓明郭永峰来源：《中国烟草科学》2016年第04期摘要：烟草（Meotiana tabacum L.）是一种叶用经济作物，以成熟变黄的叶片为收获对象，其叶片成熟度和叶片变黄过程对烟叶产品的质量起到决定性的影响。

简述了植物叶片衰老相关基因的研究概况，归纳了近年来烟草中叶片衰老调控相关基因的研究进展，总结了部分外源基因对烟草叶片衰老的影响。

分析表明，研究烟草叶片衰老相关基因，对提高烟叶品质和烟草育种具有重要意义。

关键词：烟草：叶片衰老：调控基因中图分类号：$572文章编号：1007-5119（2016）04-0097-04 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.017衰老是植物生长发育的最后一个阶段，植物衰老是植株在细胞、组织、器官或整株水平上生长衰退的过程，它由基因调控并受内外因素的影响，最终导致整株植物的死亡。

叶片衰老是植物衰老的主要表现形式，在正常条件下，叶片衰老主要与叶片年龄有关，是叶片的自然衰老。

除此之外，叶片衰老也可以被一系列外部环境因素如光照不足、干旱、极端温度、病原体物侵染等诱导和调节。

叶片衰老还与植物激素水平有密切的关系，植物内源激素如细胞分裂素、赤霉素等具有延缓衰老的作用，而乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等则具有促进衰老的作用。

叶片衰老过程中，叶绿体是第一个被分解的细胞器，因叶绿素降解导致的叶片黄化是叶片衰老的主要标志。

叶绿体被分解之后，叶片的光合效率下降，其降解产物形成丰富的氮源，此时叶片的主要功能不再是进行光合作用，而是将蛋白质、脂肪、核酸等生物大分子降解形成的氮素及其它营养元素输送至茎尖、果实、幼叶等新生器官，供进一步生长发育或储存。

1.植物叶片衰老相关基因研究概述叶片衰老是一种程序性细胞死亡（programmedcell death，PCD），是细胞在一定的生理条件下，为更好的适应生存环境而发生的一种由基因控制的细胞自主有序死亡的过程。

烟草抗病毒基因工程研究烟草作为一种重要的经济作物，在全球范围内广泛种植。

然而，烟草病毒病是烟草生产中面临的重要问题，给烟农带来巨大经济损失。

传统抗病毒方法如化学防治和物理防治等存在诸多弊端，而烟草抗病毒基因工程作为一种新型的防控技术，具有高效、安全、环保等优势，近年来备受。

本文将介绍烟草抗病毒基因工程的基本概念、研究现状、研究方法及实验结果与分析，并展望未来发展趋势。

烟草抗病毒基因工程是通过基因克隆、表达和分析等技术，将外源抗病毒基因导入烟草，使其在体内表达出抗烟草病毒的蛋白质，从而提高烟草对病毒的抗性。

该技术可有效解决传统抗病毒方法存在的问题，为烟草生产带来新的防控策略。

自20世纪90年代以来，随着分子生物学技术的迅速发展，烟草抗病毒基因工程研究取得了一系列重要成果。

例如，植物抗病毒基因的克隆与功能分析、抗病毒基因的转化与表达、抗病毒基因工程品种的选育与应用等。

然而，在实际应用过程中，仍存在转化效率低、基因沉默现象严重等问题。

烟草抗病毒基因工程研究的主要方法包括基因克隆、表达、分析等。

基因克隆技术通过对植物抗病毒基因的筛选、克隆和鉴定，为抗病毒基因的表达提供基础。

在基因表达方面，采用农杆菌介导、基因枪轰击、微注射等转化方法，将抗病毒基因导入烟草细胞中，实现基因的高效表达。

同时，利用分子生物学技术如RT-PCR、Southern blot等，对转基因烟草进行分子水平上的检测与鉴定。

通过基因克隆、表达和分析等技术，研究人员已成功获得多个具有抗病毒活性的转基因烟草品种。

这些品种在田间试验中表现出良好的抗病毒效果，有效降低了病毒对烟草的侵染和危害。

研究人员还发现，导入的抗病毒基因在烟草中能够稳定遗传，为抗病毒烟草品种的大规模繁殖和推广奠定了基础。

然而，在实际应用过程中，仍存在转化效率低、基因沉默现象严重等问题。

为了解决这些问题，研究人员尝试通过优化转化条件、筛选高效转化方法、选用适当的启动子等方式，提高抗病毒基因的表达水平和转化效率。

烟草育种学试题及答案期末考试一、选择题（每题2分，共20分）1. 烟草育种的主要目标不包括以下哪项？A. 提高产量B. 改善品质C. 增加烟草的有害成分D. 增强抗逆性2. 下列哪项不是烟草育种中常用的育种方法？A. 杂交育种B. 诱变育种C. 基因工程育种D. 克隆育种3. 烟草的遗传多样性主要来源于：A. 人工选择B. 自然选择C. 基因突变D. 基因重组4. 烟草的花型属于：A. 单性花B. 两性花C. 无性花D. 异花传粉花5. 烟草的遗传改良主要通过以下哪种方式？A. 物理方法B. 化学方法C. 生物技术D. 环境调控二、填空题（每空2分，共20分）6. 烟草的育种周期一般为________年。

7. 烟草的花药培养技术属于________育种。

8. 烟草的抗病性育种中，常用的分子标记技术是________。

9. 烟草的抗旱性育种可以通过________基因的表达来提高。

10. 烟草的杂交优势利用中，常用的杂交方式是________。

三、简答题（每题10分，共30分）11. 简述烟草育种中常用的诱变育种技术及其原理。

12. 阐述烟草育种中分子标记辅助选择的优势。

13. 描述烟草育种中基因工程育种的一般流程。

四、论述题（每题15分，共30分）14. 论述烟草育种中遗传多样性的重要性及其在育种中的应用。

15. 讨论烟草育种中环境因素对育种效果的影响。

五、案例分析题（共30分）16. 某烟草育种公司希望通过育种改良烟草的抗病性，请你设计一个育种方案，并说明其可行性。

参考答案一、选择题1. C2. D3. D4. B5. C二、填空题6. 3-57. 组织培养8. RAPD或SSR9. 抗旱相关10. 人工控制三、简答题11. 诱变育种技术是通过物理或化学诱变剂处理烟草种子或幼苗，诱发基因突变，然后通过筛选和选择，获得具有优良性状的新品种。

原理是诱变剂能够改变烟草的DNA结构，导致基因突变。

12. 分子标记辅助选择可以快速、准确地定位控制特定性状的基因，提高育种效率，减少育种周期，同时可以避免环境因素对性状表现的影响。

根据ERF 转录因子的结构特征可以将其分为四个亚类。

第I 亚类：AP2/ERF结合域由59 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的中部，转录调控域位于蛋白N 端；第II 亚类：AP2/ERF 结合域由58 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的N 端，蛋白的C 末端存在一个EAR 基序；第III 亚类：AP2/ERF 结合域也由58 个氨基酸组成，其N 和C 两端各有一个酸性激活域，蛋白C 末端还有一个MAPK 作用位点。

第IV 类：AP2/ERF 结合域同样由58 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的N 端，转录调控域位于C 端，此外N 末端还具有一个保守的MCGGAI(I/L)元件[68]ERFs类转录因子可以受到多种胁迫的诱导表达,同时参与不同胁迫信号转导途径的交叉应答,所以它在非生物胁迫中有十分重要的调控作用番前的?STE/JF/基因可以提高番莉根系发育过程中的耐盐性,还可以在转基因植株中表现较高的相对含水量和较低的丙二酸含量及电解质外渗,同时可以积累游离脯氨酸和可溶性糖含量,此外还调节抗逆相关基因、P5CS、DREB3】、的激活表达(Lu et al.,2011)。

Gao等(Gao et al.,2008)将番燕基因转入水稻,经过干旱和高盐处理后,同对照相比转基因植株的抗旱以及耐盐能力增强,并积累了脯氨酸含量,降低了叶片的水分流失。

另外,基因不仅可以影响含有GCC-box或DRE/CRT顺式元件的Z//>5、Wcor413L OsPrx和等胁迫相关的功能基因表达,还影响Os-CDP欠7、OsCDPKlS和OsCDP欠/9等调节基因的表达。

ERF类基因WXPl和WXP2可以使叶蜡积累并提高拟南芥的抗旱性(Zhangetal.,2007)。

己有许多研宄表明胁迫相关基因可以受外源的诱导表达,也有-?些基因虽然ABA对其表达无影响,但是确可以受到干早和低温等的诱导,这就又涉及到ABA依赖和ABA非依赖的非生物胁迫的信号转导途径,Zhu等(Zhu ct al.,2010)通过EMSA试验证明RAP2.6可以与CE丨顺式元件结合,进而可以调控AtABI4等ABA相关基因的特异表达。

LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性白血病抑制因子（LIF）信号通路可以维持小鼠胚胎干细胞多能性。

尽管Jak-Stat3在介导LIF信号传递中发挥重要作用，但始终不清楚这些信号是怎样与干细胞多能性相关的转录因子如Oct3\4,Sox2,Nanog联系起来的。

我们发现两条LIF相关的信号通路通过转录因子相连。

在小鼠胚胎干细胞中，Klf4主要是通过JAK-STAT3信号通路被激活，再优先激活Sox2 ；然而Tbx3主要是通过PI3K-ATK和MAPK-ERK信号通路被激活，再激活Nanog .在没有LIF时，只要维持Oct3\4表达，Klf4或者Tbx3表达就足够维持胚胎干细胞的全能性。

很显著的是，没有Klf4和Tbx3活性时，Nanog 过度表达就可以使小鼠胚胎干细胞仅依靠LIF通路维持自我更新。

所以Klf4和Tbx3可以介导LIF信号传递到核心通路，但并不直接参与维持干细胞多能性。

因为在特别情况下，没有Klf4和Tbx3表达就可以维持干细胞全能性。

传统培养条件下，小鼠胚胎干细胞自我更新依赖于LIF激活信号转导因子Gp130 ;没有LIF就会导致干细胞分化。

但是若有人为激活Stat3或Nanog过表达就足以维持干细胞自我更新。

Stat3通过与Gp130相关的Jak激酶被激活，但是其与Nanog间的关系还不是很清楚。

生物信息学研究一些转录因子可以假定为核心转录因子的靶标。

在这些转录因子中发现在没有LIF时，Klf4和Tbx3有能力维持OCRG9细胞（来源于E14tg2a的Rex1-Gfp-BSD\Oct3\4-Ecfg-pac胚胎干细胞），与Nanog类似。

这些干细胞在有嘌呤霉素的条件下生存说明Oct3\4启动子有效促进转录翻译表达，但是绿色荧光蛋白的表达量要比原来的ES低。

Klf4编码锌指转录因子，作为与Oct3\4和Sox2辅助因子激活一系列靶基因，用于维持体细胞多能性，延迟胚状体培养条件下的细胞分化。

《利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究》篇一利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究一、引言随着现代生物技术的飞速发展，基因编辑技术已成为科学研究领域的重要工具。

其中，CRISPR/Cas9系统因其高效、精确的基因编辑能力，在植物遗传学、农业生物技术以及医学研究中得到了广泛应用。

本氏烟草作为一种重要的模式植物，其基因编辑研究对于理解植物基因功能、改良作物品质以及抗病抗虫等方面具有重要意义。

本文将详细介绍利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究。

二、CRISPR/Cas9系统概述CRISPR/Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑工具，其工作原理类似于自然界中的免疫防御机制。

该系统主要由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）以及Cas9蛋白组成。

通过将目标DNA序列与crRNA进行碱基配对，Cas9蛋白能够识别并切割DNA，从而实现基因编辑。

三、本氏烟草基因编辑实验设计1. 靶标基因选择：根据研究目的，选择本氏烟草中具有重要功能的基因作为靶标。

2. 设计CRISPR/Cas9系统：根据靶标基因序列设计合适的crRNA和tracrRNA，并与Cas9蛋白组合成CRISPR/Cas9系统。

3. 转化本氏烟草细胞：将CRISPR/Cas9系统通过遗传转化方法导入本氏烟草细胞中。

4. 筛选阳性转化体：通过PCR、测序等方法筛选出成功整合CRISPR/Cas9系统的阳性转化体。

5. 观察基因编辑效果：对阳性转化体进行表型观察、DNA测序等分析，以评估基因编辑效果。

四、实验结果与分析1. 阳性转化体的筛选与鉴定：成功筛选出多株阳性转化体，并通过PCR和测序等方法确认CRISPR/Cas9系统已成功整合到本氏烟草基因组中。

2. 基因编辑效果评估：对阳性转化体进行表型观察和DNA 测序分析，发现靶标基因发生了预期的突变，包括插入、删除和点突变等。

广西植物Guihaia　24(1):49-51 2004年1月　水稻谷蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的表达申佩弘,乔越美,黄　胜,武　波＊(广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530005)摘　要:利用农杆菌系统介导,采用叶盘转化法,将在水稻谷蛋白启动子驱动下的外源ipt基因导入烟草植株中,经过抗生素筛选、PCR与测序分析检测出转基因植株。

成熟的转基因烟草种子经过ELISA细胞分裂素试剂盒检测,发现iPAs含量为对照的2.43倍,此外,种子的重量也增加了7.8%。

关键词:ipt基因;水稻谷蛋白启动子;种子;iPAs中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2004)01-0049-03Ipt gene driven under a gluteline promoter ofrice seed expressed in transgenic tobacco plants SHEN Pei-hong,QIAO Yue-mei,HUANG Sheng,WU Bo(College of Life Science and Technol ogy,G uangxi University,Nanning530003,China)Abstr act:An ipt gene driven under the gluteline prom oter of rice seed w as introduc ed into tobacco plants by A.tumefaciens mediated t ransformation.After selected using antibiotics,PCR and sequenc ing analysis confirmed that ipt gene ha s integrated into the genomes of the tobac co plants.Cytokinin level in se eds was determined by ELISA kit.The result show ed that the iPAs level of transgenic seeds is about2.43fold tha n CK,at the same time,the w eight of seed has increased by7.8percent.Key wor ds:ipt gene;rice gluteline promoter;iPAs;seed w eight Ipt基因是农杆菌A.tumefaciens Ti质粒上的一段序列,编码异戊烯基转移酶,该酶是调节、催化C TKs合成的第一步关键酶,它能催化异戊烯基焦磷酸腺苷的分解,产生异戊烯基单磷酸腺苷,也就是所有细胞分裂素的前体。

转基因烟草检测标准转基因烟草是指经过基因工程技术改造的烟草植株，其基因组中携带了外源基因或者对内源基因进行了改造。

随着转基因技术的不断发展，转基因烟草的种植和应用已经成为一个备受关注的话题。

为了保障公众健康和市场秩序，对转基因烟草的检测标准显得尤为重要。

一、转基因烟草检测方法。

1. PCR法。

PCR法是目前应用最为广泛的转基因检测方法之一。

通过PCR技术，可以扩增转基因烟草中特定的外源基因序列，从而进行检测。

该方法具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点，能够准确鉴定转基因烟草的存在。

2. 蛋白质检测法。

蛋白质检测法是通过检测转基因烟草中特定的蛋白质来进行鉴定。

这种方法操作简单，且对样品的处理要求较低，适用于大规模的转基因烟草检测。

3. 基因芯片技术。

基因芯片技术是一种高通量的检测方法，可以同时检测多个外源基因的存在。

该技术具有高度自动化和高效率的特点，能够满足大规模样品的检测需求。

二、转基因烟草检测标准制定。

1. 样品采集。

对于转基因烟草的检测，首先需要进行样品的采集工作。

采集样品时要注意避免外源污染，确保样品的纯度和完整性。

2. 检测方法选择。

针对不同的检测目的和需求，可以选择不同的转基因烟草检测方法。

在制定检测标准时，需要明确检测方法的选择和应用范围，确保检测结果的准确性和可靠性。

3. 检测标准制定。

在制定转基因烟草检测标准时，需要考虑到检测方法的灵敏度、特异性、稳定性等因素，确保检测结果能够满足监管和市场需求。

同时，还需要考虑到转基因烟草的种类和用途，对不同类型的转基因烟草制定相应的检测标准。

4. 质控要求。

在转基因烟草检测过程中，需要建立严格的质控体系，确保检测结果的准确性和可靠性。

质控要求包括实验室条件、设备校准、样品处理、数据分析等方面，对每个环节进行严格把控。

5. 结果判定。

针对转基因烟草检测结果，需要制定相应的结果判定标准，明确转基因烟草的存在与否。

判定标准应该具有明确的界限值和判定依据，能够对检测结果进行客观、准确的评定。

４．结果和分析４．１ｆｐ￥基因转化烟草Ｋ３２６及转化植株的获得在光强２０００Ｌｘ，１６ｈ光周期，２５＂（２条件下，散播在峪固体培养基上的Ｊ【３２６种子一个月成苗可用．浸染转化选择培养体系在共培养后第１７天，在叶片边缘开始长出少量小不定芽（图＾），第２５天全部长芽并且完全除菌．未浸染转化的阳性对照第１４天就长出了小不定芽，且长势较侵染转化体系旺盛的多（图Ｂ）．未浸染转化的阴性对照的外植体在选择培养压力下逐渐黄化至灰白色（图ｃ）．可见。

浸染转化选择培养体系的分化频率明显低于阳性对照．阴性对照在Ｉ（ｍ３０的筛选压力下不能分化形成不定芽．待分化芽点出现小叶时，将其剥离，移入生根培养基中．第∞天成苗，颜色浓绿，根系发达，高度至１００ｕＬ三角瓶颈部（图Ｄ）．总共获得了５４棵Ｋａｎ阳性植株．圈２－．转化叶片在ｈｎ为３０Ｉ＾的分化培养基上分化出芽ｂ．阳性对黑：未转化叶片在无Ｖａｎ的分化培养基上旺■分化ｃ．阴性对照：未转化叶片在ｈｎ为３０＿／Ｌ的分化培养基上基本没有分化ｄ．ＫＭ阳性檀株Ｈ善２ｌ，ｌａｍ乜加鲥ｂｎｎ越ｉｏｎｍｄ托簪ＩＩ∞一咖ｔＴｎｍｓｆｏｎｎｃｄｌ茁＂ｄｉｓ嚣ｄｉｆｆｃ删ｍｆｉａｔｅｄＯＩ！ＭＳｉｎｃ击ｕｍｍｐｐｌｅｍｅ，坂１ｗｉｔｌｌ３０毗Ｋ－ｍｂ．Ｎ啊Ｈ帕叽蹭珂如ｐＩ矾面矗ａ霸硼删伽ＭＳｍｅｄｌｍｎ∞ｐＱ￥ｉｌ慨ｃｏｎｒａｉｌ．ａＮ加击锄蹭疵ｐｌａｎｔｄｉｆｆｅｎｍｆｉａ搬ｌＯｎＭＳｍｅｄｉｕｍ蜘印ｋ椒ｍｅｄｗｉｔｈ３０ｍｅ／Ｌｌ【柚ｌ地翻妇∞曲ｄ．正‰婵舯自删∞ＭＳｎｌｃｓ击ｔｌｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ加ｍ叽Ｋｍ４．２转化植株的分子检测４．２．１转化植株的ＰＣＲ检测分别提取５４棵Ｋｍ阳性植株的基因组ＤＮＡ，并对其进行ＰＣＲ检测．分别在株系Ｋ一４；Ｋ－６；Ｋ－１７；Ｋ＿１９；Ｋ一３５中检测到了ｌｋｂ的目的片段，结果如图３。

最左侧为ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００标准条带。

点样孔１，阳性对照ｐＢｉｚｚ４Ｒｆｐｓ质粒扩增出ｌｋｂ的目的片段。

IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是一种化学诱导剂，常用于激活大肠杆菌表达系统中的T7启动子。

通过加入IPTG，可以促进靶蛋白的表达，从而实现对目的蛋白的高效生产。

下面我们来详细了解一下IPTG诱导大肠杆菌表达的原理。

1. T7启动子T7启动子是一种强效启动子，它可以在大肠杆菌中高效转录外源DNA。

T7启动子的活性受到T7 RNA聚合酶的调控，而T7 RNA聚合酶是一种高度特异性的RNA聚合酶，在大肠杆菌中并不存在。

当T7启动子与T7 RNA聚合酶相结合时，便可高效产生目的蛋白。

2. IPTG的作用IPTG是一种结构类似于乳糖的化合物，它可以结合到lac重pressor 蛋白上，从而阻止其对T7启动子的抑制作用。

在含有T7启动子和T7 RNA聚合酶的表达系统中，当添加IPTG后，它与lac repressor蛋白结合，使其失活，进而释放T7启动子，使T7 RNA聚合酶能够充分地转录外源DNA，从而高效表达目的蛋白。

3. IPTG浓度的选择在IPTG诱导大肠杆菌表达的过程中，IPTG的浓度选择非常重要。

一般来说，IPTG的最佳浓度应该能够充分激活T7启动子，同时又不会对大肠杆菌本身的生长造成太大的影响。

通常情况下，0.1-1.0mM的IPTG浓度是比较常用的范围。

4. IPTG诱导的时间和温度除了IPTG的浓度外，诱导时间和温度也会影响大肠杆菌表达系统的效果。

通常情况下，IPTG诱导的时间可以根据不同的目的蛋白进行优化，一般为4-16小时。

而温度则可以选择在37摄氏度左右进行诱导。

5. 相关注意事项在进行IPTG诱导大肠杆菌表达时，还需要注意一些相关的技术细节。

需要对大肠杆菌培养基进行预处理，保证培养基中的IPTG没有降解或者受到污染。

另外，在IPTG诱导的过程中需要监测大肠杆菌的生长情况，及时调整诱导条件，以保证目的蛋白的高效表达。

IPTG诱导大肠杆菌表达的原理主要是通过结合到lac repressor蛋白上，解除其对T7启动子的抑制作用，从而实现T7启动子的高效激活，使T7 RNA聚合酶能够高效转录外源DNA，最终实现对目的蛋白的高效表达。

专利名称：烟草NtAAP3基因在烟草中应用
专利类型：发明专利
发明人：魏攀,王燃,李锋,金立锋,郑庆霞,董臣,徐韶妍,冯明星,孙涛
申请号：CN202110736575.X
申请日：20210630
公开号：CN113373166B
公开日：
20220624
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于烟草基因组基因功能解析技术领域，具体涉及烟草NtAAP3基因在烟草中应用专利申请。

烟草NtAAP3与氨基酸转运相关，在将其沉默后，烟草中酪氨酸、脯氨酸和天冬酰胺含量明显下降，总蛋白质含量明显下降；另一方面，烟草NtAAP3基因与烟草中色素类物质含量调节相关，在将其沉默后，烟叶中叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素等色素类物质含量有明显升高。

本申请对NtAAP3基因与氨基酸调控、蛋白质含量调控以及色素含量调控之间的关系进行了初步明确，对于阐述NtAAP3基因对氨基酸的吸收、转运、氮素利用和调控植物抗逆性等方面的功能奠定理论基础。

申请人：中国烟草总公司郑州烟草研究院
地址：450001 河南省郑州市高新区枫杨街2号
国籍：CN
代理机构：郑州联科专利事务所(普通合伙)
代理人：张晓萍
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烟草Ntggpps2基因过表达载体构建及遗传转化李锋;苏珍珠;彭兵;郑庆霞;高其康;楼兵干【摘要】对炯草萜类化合物合成相关的关键基因栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因Ntggpps2(Nicotiana tabacum geranylgeranyl diphosphate synthase gene,Ntggpps)进行克隆,并构建了过表达载体pCAMBIA1302-NT2,通过农杆菌介导的遗传转化,成功获得Ntggpps2过表达的炯草转基因植株.qRT-PCR分析发现,在转基因植株的烟草叶片中,Ntggpps2基因的表达水平是野生型的2.2倍,实现了Ntggpps2在烟草中的高表达,为后续研究炯草Ntggpps基因的生物学功能及其萜类物质合成途径的分子机理提供了研究材料与基础.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2015(027)011【总页数】5页(P1872-1876)【关键词】萜类化合物;牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶;过表达;遗传转化【作者】李锋;苏珍珠;彭兵;郑庆霞;高其康;楼兵干【作者单位】中国烟草总公司郑州烟草研究院,河南郑州450001;浙江大学生物技术研究所,浙江杭州310058;浙江大学生物技术研究所,浙江杭州310058;中国烟草总公司郑州烟草研究院,河南郑州450001;浙江大学农生环分析测试中心,浙江杭州310058;浙江大学生物技术研究所,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S572近年来，人们对萜类化合物及其合成途径的研究不断深入。

萜类物质合成途径起始于五碳化合物异戊烯焦磷酸（IPP），IPP作为基本单元结构与其同分异构体二甲丙烯基焦磷酸（DMAPP），在异戊二烯转移酶作用下，缩合形成十碳牻牛儿基焦磷酸（GPP），衍生为单萜类化合物;GPP与第二个IPP分子在法呢基焦磷酸合成酶催化下缩合形成十五碳的法呢基焦磷酸（FPP），在倍半萜环化酶作用下衍化形成倍半萜及其衍生物;FPP加上第三个单元IPP在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPPS）作用下形成二十碳化合物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），在环化酶作用下形成其衍生物，依次类推形成二萜、四萜、多萜及其衍生物，构成了庞大的萜类物质家族［1-2］。

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草芮鹏环;宋培培;蒋磊;江彤【摘要】[目的]本研究利用dsRNA技术沉默26基因,获得烟草品种云烟85的T1代转基因抗CMV株系.[方法]构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i),以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85.[结果]抗性筛选获得112株T0代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T0代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病.Tas-ELISA检测表明,T0代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株.选取10个T0代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T1代抗病性,发现部分T1代烟株发生一定比例的抗感分离,T1代抗性株率为46.7％～100％.Real-time PCR检测T1代烟株,发现T1代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株.[结论]基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系.【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2019(025)001【总页数】5页(P111-115)【关键词】黄瓜花叶病毒;2b基因;沉默;转基因抗病烟草【作者】芮鹏环;宋培培;蒋磊;江彤【作者单位】安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;山东省平度市农业局,山东平度266700;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036【正文语种】中文黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员[1]，其基因组含3个RNA组分，分别为RNA1、RNA2和RNA3， RNA2 3'端ORF编码2b蛋白，已证明是病毒基因沉默的抑制子[2]。

分子植物育种，２００８年，第６卷，第１期，第５３－５８页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００８，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，５３－５８研究报告ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ菜豆几丁质酶基因Ｂｃｈｉ的克隆及其在转基因烟草中的表达王全伟１曲敏２张海玲１徐香玲１＊１哈尔滨师范大学生命与环境科学学院，哈尔滨，１５００８０；２哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨，１５００７６＊通讯作者，ＸＸＬ８７６１＠１２６．ｃｏｍ摘要本文根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的菜豆几丁质酶基因ｃＤＮＡ序列设计引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ得到一个菜豆几丁质酶基因家族基因Ｂｃｈｉ。

该基因编码一个３２７个氨基酸的多肽，其结构包括信号肽、几丁质结合区、铰链区、催化区和液泡定位多肽，属于ＣｌａｓｓＩａ类内切几丁质酶。

构建该基因的植物表达载体ｐＭＨＬ７１３３－Ｂｃｈｉ，并通过发根农杆菌Ｒ１０００介导转化烟草，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定获得了４株转基因烟草株系。

几丁质酶活性分析表明，转基因烟草几丁质酶活力明显高于对照。

抗真菌实验结果显示，转基因烟草的叶片基本无病斑产生，表明Ｂｃｈｉ基因在烟草中高水平的表达显著提高了烟草对真菌病害的抗性。

关键词菜豆，几丁质酶，克隆和表达，烟草ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＢｅａｎＣｈｉｔｉｎａｓｅＧｅｎｅＢｃｈｉａｎｄｉｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＴｏｂａｃｃｏＷａｎｇＱｕａｎｗｅｉ１ＱｕＭｉｎ２ＺｈａｎｇＨａｉｌｉｎｇ１ＸｕＸｉａｎｇｌｉｎｇ１＊１ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＨａｒｂｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００８０；２ＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｌｌｅｇｅ，ＨａｒｂｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｍｍｅｒｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００７６＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ＸＸＬ８７６１＠１２６．ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｗｅｏｂｔａｉｎｅｄａＢｃｈｉｇｅｎｅｆｒｏｍｔｈｅｌｏｃａｌｂｅａｎ（ＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓＬ．）ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙｔｈｅｃＤＮＡｏｆｂｅａｎｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋｂｙＲＴ－ＰＣＲａｐｐｒｏａｃｈ．ＴｈｅｃＤＮＡｗｏｕｌｄｂｅ－ｌｏｎｇｔｏＣｌａｓｓＩａｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｂｅａｎｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｏｆ３２７ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ｃｈｉｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ｈｉｎｇｅｄｏｍａｉｎ，ｃａｔａｌｙｔｉｃｒｅｇｉｏｎａｎｄａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｌｏｃａｔｅｄｉｎｖａｃｕｏｌｅ．Ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔ，ｐＭＨＬ７１３３－Ｂｃｈｉ，ａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｔｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏｍｅｄｉａｔ－ｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓＲ１０００．ＦｏｕｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｈｉｔｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｗａｓｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅａｎｔｉ－ｆｕｎｇｉａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｌｍｏｓｔｎｏｄｉｓｅａｓｅｓｐｏｔｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｗｈｉｃｈｉｍｐｌｙｔｈａｔＢｃｈｉｇｅｎｅｓｈｏｕｌｄｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｎｔｏｂａｃｃｏａｎｄｍｉｇｈｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｆｕｎｇｉｄｉｓｅａｓｅ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＢｅａｎ（ＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓＬ．），Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ，Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｔｏｂａｃｃｏ几丁质是构成多数真菌细胞壁的主要成分之一，同时也大量存在于昆虫和动物的甲壳中，植物中至今尚未发现几丁质的存在，但几丁质酶却广泛存在于植物中。