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农杆菌介导的烟草转基因技术一、实验目的了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。
我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料1、植物材料：烟草无菌苗2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121四、方法步骤1、试剂的配制（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。
（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0（3）烟草共培养培养基：固体MS培养基（4）烟草筛选培养基：MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0（5）烟草生根培养基：固体MS培养基2、农杆菌侵染菌液的制备方法：（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记（5）28℃恒温培养1d-2d（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。
转基因烟草的方法 1.接种单菌落于加有KAN,RIF和STR的3ML液体YEB培养基中，28度培养2天，转接与20ML YEB液体培养基中，28度继续培养至OD600=0.6-0.8。
2.菌液经4000RPM离心10分钟，倒掉上清液，用MS液体培养基重悬菌体，调OD600=0.6-0.8 3.取无菌烟草叶片，去除边缘，主叶脉，剪成大小约1CM*1CM的小块，浸泡在菌体悬浮液中，2-3分钟，期间不断轻轻摇晃。
4.取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L）28度黑暗共培养2-3天。
5.将共培养后的叶片在无菌水和加入羧苄青霉素的无菌水中清洗一遍，灭菌滤纸吸取多余水分，然后转到分化选择培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L，潮霉素10-60MG/L,CARB 500MG/L）25度光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽。
6.将长至2CM以上的不定芽切下并转移到生根培养基上（1/2MS+NAA 0.1MG/L，潮霉素20-100MG/L,CARB 500MG/L）诱导生根。
7.将一次生根的再生苗切取根尖，接种到新的生根培养基上，诱导生根，不能生根的芽丢掉。
叶盘法转基因烟草技术一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。
25℃光照培养20-30天。
MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。
(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。
侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。
将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。
以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。
叶盘法转化烟草的原理叶盘法是一种生物工程技术，用于转化或改造植物基因组以生产特定物质。
在烟草中应用叶盘法可以用于合成表达外源蛋白、开发抗病毒烟草品种以及烟草遗传改良等领域。
叶盘法的基本原理是利用植物的组织再生能力，通过培养植物的叶片组织培养而成的小体，在适当的培养基组合下，通过添加适当的物质和条件，将目标基因组转化至植物细胞中。
叶盘法的实验流程一般可以分为以下几个步骤：1.植物材料的准备：从健康的烟草植株中采集叶片，并将其洗净，并进行无菌处理以确保实验的纯度。
2.建立愈伤组织：将洗净的叶片剪成小碎片，并将其转移到含有激素和培养基中，利用试管内的适宜条件培养愈伤组织。
这一步是为了为后续基因转化做好基础，并培养植物细胞的再生能力。
3.转化基因：将目标基因或转入质粒经过适当的处理和筛选，将其引入培养的烟草细胞中。
目标基因可以是外源蛋白的编码序列，用于生产特定蛋白质。
转入基因的方法包括生物颗粒轰击、体外基因传递和通过细菌介导的转化等多种方法。
4.培养变性细胞：转入基因的组织在适宜的培养条件下进行培养和筛选，以确保它们能够在细胞内稳定表达目标基因。
同时，还可以使用适当的抗生素来抑制未转化细胞的生长。
5.稳定转化的筛选：利用特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的转化细胞。
常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因或镰刀形细菌素酶基因，通过添加抗生素或镰刀形细菌素酶底物来诱导或检测转过的细胞。
6.进一步培育和鉴定：将经过筛选的转化细胞进行进一步培养，培育出大量具有目标基因的烟草植株。
同时，对植株进行鉴定和检测，确认目标基因的稳定性和表达水平。
通过以上步骤，叶盘法能够有效地将外源基因导入到烟草植株的基因组中，并使其稳定表达。
通过优化培养条件和基因的筛选方法，可以进一步提高转化效率和稳定性。
叶盘法的优点在于操作简单、转化效率高、转基因植株易于培养和大规模扩繁等。
然而，叶盘法也存在一些局限性，如转化效率和稳定性的波动性、可能引发的遗传不稳定性等问题，需要进一步的优化和改进。
《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》篇一一、引言黄花苜蓿作为一种重要的农作物，具有丰富的营养价值和生态价值。
近年来，基因工程技术的不断发展为黄花苜蓿的遗传改良提供了新的途径。
本研究以黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因作为研究对象，通过基因转化技术将其导入烟草中，以期提高烟草的抗逆性和耐旱性。
二、材料与方法2.1 材料实验材料包括黄花苜蓿、烟草、MfDREB1和MfDREB1s基因等。
其中，黄花苜蓿为实验材料提供基因资源，烟草作为转化对象进行基因工程改造。
2.2 方法2.2.1 基因克隆与表达载体构建通过PCR扩增和序列测定获得MfDREB1和MfDREB1s基因的序列信息，然后构建表达载体。
2.2.2 烟草的遗传转化采用农杆菌介导法将表达载体导入烟草中，通过组织培养和筛选获得转基因烟草。
2.2.3 转基因烟草的鉴定与分析对转基因烟草进行PCR鉴定和RT-PCR分析，验证基因是否成功导入并表达。
同时，对转基因烟草进行抗逆性和耐旱性分析。
三、实验结果3.1 基因克隆与表达载体构建通过PCR扩增和序列测定成功获得了MfDREB1和MfDREB1s基因的序列信息，构建了相应的表达载体。
经测序验证，表达载体中的基因序列与黄花苜蓿中的基因序列一致。
3.2 烟草的遗传转化采用农杆菌介导法成功将表达载体导入烟草中，经过组织培养和筛选，获得了转基因烟草。
PCR鉴定结果显示，转基因烟草中成功导入了MfDREB1和MfDREB1s基因。
3.3 转基因烟草的鉴定与分析RT-PCR分析表明，转基因烟草中的MfDREB1和MfDREB1s基因得到了表达。
抗逆性和耐旱性分析显示，转基因烟草的抗逆性和耐旱性得到了显著提高。
与未转化的烟草相比，转基因烟草在干旱条件下的生长状况更好，叶片颜色更绿，生长速度更快。
四、讨论本研究成功将黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因导入烟草中，并通过转基因技术获得了转基因烟草。
烟草转基因操作细则烟草无菌苗准备:将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。
转基因步骤：1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）；2 离心收集菌液；3 用25 mL激活培养基(液)悬浮；4 在28o C摇3-5 h；5 转入到培养皿；6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）；7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方；8 在激活培养基中浸泡10 min 左右；9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液；10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）；11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养；12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。
培养基配方激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)；共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8);筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**；生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。
注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。
**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术检测转基因烟草植株中目标基因的整合和表达情况，验证转基因植株的遗传稳定性，为后续的转基因烟草的研究和应用提供科学依据。
二、实验材料1. 转基因烟草植株：含有目标基因的烟草再生植株。
2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、连接酶、T载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒等。
3. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪、显微镜等。
三、实验方法1. DNA提取- 将转基因烟草植株的叶片剪成小块，使用DNA提取试剂盒提取总DNA。
2. PCR扩增- 设计特异性引物，针对目标基因进行PCR扩增。
- 将提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。
3. 电泳检测- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。
4. 测序验证- 对扩增的特异性条带进行测序，验证其序列与目标基因的一致性。
5. Southern blot检测- 使用限制性内切酶酶切转基因烟草植株DNA和野生型烟草DNA。
- 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。
- 显影后观察杂交信号。
6. Northern blot检测- 提取转基因烟草植株RNA，进行反转录PCR，扩增目标基因mRNA。
- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。
- 显影后观察杂交信号。
四、实验结果1. PCR扩增- 转基因烟草植株DNA的PCR产物在预期位置出现特异性条带，而野生型烟草DNA没有扩增产物。
2. 测序验证- 测序结果显示，扩增产物序列与目标基因序列一致。
3. Southern blot检测- 转基因烟草植株DNA的酶切产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草DNA没有杂交信号。
4. Northern blot检测- 转基因烟草植株RNA的RT-PCR产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草RNA没有杂交信号。
植物材料：Nicotiana benthamiana
菌种：GV3101
载体：Cam35S-gfp
第一天：
准备菌液，Culture a single colony in liquid LB + 50 mg/L Kanamycin + 60 mg/L Gentamicin
第三天：
转化
准备植物材料
1.无菌烟草材料，生长4-5周，完全展开叶片；
2.切成0.6cm到0.8cm见方叶盘；
3.用重悬液RM重悬离心收集的农杆菌菌体（2500 g，5 min），重悬至OD600=0.5~0.8；
4.将叶盘转入农杆菌重悬液中，28℃侵染30 min；
5.倒掉农杆菌菌液，将叶盘转到固体RM培养基上，覆盖无菌滤纸。
共培养：
在黑暗中25℃培养3天。
洗涤：
共培养后，将叶盘转到一个50ml圆底离心管中，用含有1000 mg/L特美丁RM溶液洗涤3 min，用RM溶液洗两次，每次3分钟。
筛选和分化培养：
1.用滤纸将叶盘表面吸干；
2.将叶盘放置到筛选RM培养基，10个叶盘一个皿；
3.黑暗中培养2周，转移至光下培养；
4.每3周继代一次。
生根
1.将分化愈伤转移至生根培养基；
2.成苗。
RM培养基：（固体加8 g/L Agar）
MS盐
B5 Vitamins
30 g/L 蔗糖
BA 2.0 mg/L
NAA 0.2 mg/L
PH 5.6
筛选培养基：
除上述成分外，加特美丁终浓度300 mg/L，潮霉素50 mg/L。
烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。
25℃光照培养20-30天。
MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。
(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。
侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。
将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。
以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。
2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。
高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。
加入100ml的MS0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养基上号，26℃下暗培养20-24h。
用加头孢霉素，羧苄青霉素(母液1000倍)的无菌水清洗10分钟，最后用无菌水清洗10分钟，然后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期2-3天继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。
共培养至第一个小芽长出。
转入组培瓶培养待芽长至2厘米时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。
待根长至3厘米时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基。
然后将无菌苗置入土壤，套上透明塑料袋（扎孔），培养大约一周，移到室外。
（最初的3天应在阴暗处生长）。
3．结果与分析3.1无菌苗的培养：图1为K326烟草种子在MS培养基中培养20天与40天左右的烟草幼苗图，每个培养瓶有4-5棵烟草幼苗。
烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。
A B图13.2分化培养图2分别为分化培养初期浸染叶片的培养图、叶片形成愈伤组织图片与愈伤组织上烟草新芽图片。
浸染初期由于叶盘体积小，所以每个培养皿里面的叶小块大概15块。
随着愈伤组织的形成和不断生长，培养皿条件已经不能满足愈伤组织的生长要求，这时将愈伤组织转入培养瓶中，每个培养瓶1-2个愈伤组织。
定期给愈伤组织更换培养基以保证其充足的成长营养。
愈伤组织经过再分化长成了烟草幼芽，此时，用携带AtWRKY22基因的农杆菌浸染的烟草愈伤形成的幼芽长势良好，而对照组的幼芽则被漂白。
A BC图23.3生根图3为愈伤组织上形成的幼芽在生根培养基上的生长图。
从图中可见幼芽生长迅速且未见污染现象，培养基内有长短不一的烟草根长出。
烟草的根呈淡黄色且非常纤细。
此图片说明转基因烟草幼芽已经成功生根。
图33.4转基因烟草的PCR反及分析将移栽的烟草植株在室外条件下生长一段时间，取含有目的基因的转烟草植株叶片和不含目的基因的烟草植株叶片进行PCR反应，反应图谱如下：图4如图所示，M为标记基因电泳结果。
1-6为转基因烟草PCR反应后的电泳图谱，7为非转基因对照组植物叶片的电泳结果。
由图可知转基因植株中检测到了目的基因，这表明AtWRKY22基因已经成功转入烟草植株。
而对照组植株没有检测到目的基因。
4．讨论作为基因工程的模式植物，烟草是进行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。
自1986年以来，已经将烟草花叶病毒（TMV），马铃薯Y病毒（PVY），马铃薯X病毒（PVX）,黄瓜花叶病毒（CMV），苜蓿花叶病毒（AMV），烟草脆裂病毒（TRV）的外壳蛋白基因，PVY复制酶基因，CMV的微卫星RNA，几丁质酶基因、抗菌肽基因、葡糖糖氧化酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因（Bt）和蛋白酶抑制基因[12]等上百种外源基因转入烟草获得表达。
在之前拟南芥基因转化烟草的研究中，郭兆奎等[13]将拟南芥A VP2基因转入烟草研究了此基因对植株吸收钾离子的影响。
另外，付乾堂和余迪求[14]研究了拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析。
对于AtWRKY22基因，尚庆茂等[15]研究了其抗病途径。
本实验用农杆菌介导和叶盘法相结合将拟南芥AtWRKY22基因转入烟草以获得抗病性转基因烟草植株。
许多因素都影响根癌农杆菌介导的基因转化：一是受体；二是农杆菌；三是受体与农杆菌的共培养时间。
各种因素的影响程度不同。
受体叶片的生理状态，它决定了被转化的能力。
本实验采用了无菌培养的烟草苗，这就避免了用栽培苗消毒太彻底而导致叶片死亡或是消毒不彻底而导致培养过程中生长其他细菌、真菌的情况。
烟草苗龄为1-2个月时，分化再生能力和对农杆菌感染的耐受力均较强。
苗龄过短时，不易剪出叶缘和主脉的小块，且这种小块在分化培养基只能够也很容易发白而死亡。
如果苗龄过长，特别是继代的时间过长或是代数过多，会大大增加叶片玻璃化的机率，再生能力和对农杆菌感染的耐受力均下降。
对外植体的预培养促进细胞分裂，分裂后的细胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的转化率[16]。
在对照实验中，不含目的基因的烟草叶盘形成的愈伤组织上产生的新芽被漂白，而转基因愈伤组织上的新芽则正常生长，与赵佩欧等[17]人的实验结果相符合，这主要是因为不含目的基因的新芽不含抗病基因，导致外植体在分化培养基上白化死亡。
本实验用WRKY22基因转化烟草，获得了转基因的烟草植株。
农杆菌介导AtWRKY22基因转化烟草植株的获得为今后研究AtWRKY22基因功能提供了科学依据。
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在这即将毕业的时刻，我想感谢身边的很多人。
首先诚挚地感谢我的论文指导老师李立芹老师。
她在忙碌的教学工作中挤出时间来指导我的整个实验过程，从题目的确定到最后论文的完成，她始终耐心地指导我，并认真审查、修改我的论文。
还要感谢教过我的所有老师们，你们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样。
最后，感谢四年中陪伴在我身边的同学、朋友，感谢他们对我的关爱，感谢他们对我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实地度过四年的学习生活。
