引物设计教程课件

• 较长的引物（28-35bp)
• 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用 于产生一些突变位点
PPT学习交流
7
• Tm值的计算 • 一般的公式 • Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) • 对于长一些的引物可用更为准确的
• nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）
（composition），等等。必要时还需对引物
进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进
突变等。
PPT学习交流
6
一般原则
• 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp， 但不应大于38。
• 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物 长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。
• 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存 在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个 长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点 只有1/400个.
PPT学习交流
12
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点， 应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定。
PPT学习交流
13
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
PPT学习交流
14
常用的引物设计软件
• Oligo 6 （引物评价）* • Primer Premier （自动搜索）* • Vector NTI Suit • Dnasis • Omiga • Dnastar • Primer3 （在线服务）*
7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）
8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
PPT学习交流
17
Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence
Preimer Premier 启动界面
PPT学习交流
18
基本信息
Original sequence
PPT学习交流
8
一般原则
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续 碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率 增加。
PPT学习交流
9
一般原则
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效 率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此 应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外， 引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反 应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此 常用来引进修饰位点或标记物。
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）
2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Msma）
4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）
5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）
6、一般标准（Standard）
PPT学习交流
10
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。
不同的算法推荐45-55%或50-60%
PPT学习交流
11
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该 值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超 过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引 物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配 位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 （能值越高越容易结合）
temperature)，引物与模板形成双链的内部 稳定性(internal stability, 用∆G 值反 映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹
结构（duplex formation and hairpin）的
能值，在错配位点（false priming site）
的引发效率，引物及产物的GC 含量
PPT学习交流
15
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
PPT学习交流
16
简并引物设计
• 根据氨基酸序列来设计引物DNA引物
Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使 用的偏好选择
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
PPT学习交流
3
PCR引物设计
• 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使 用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表 现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引 物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。 现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页，得到设 计好的引物，也可以在本地计算机上运行引 物设计专业软件。
PCR引物设计及相关软件使 用
PPT学习交流
1
主要内容
• 背景 • PCR引物设计原则 • 常用PCR引物设计软件 • Primer Premier 5.0 介绍 • Oligo 6.22 介绍 • 在线Primer3 介绍
PPT学习交流
2
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复性好、易自动化等突 出优点；能在一个试管内将所要研究的目的 基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃 至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一 根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足 量的DNA供分析研究和检测鉴定。
PPT学习交流
4
引物设计的原则
• 引物与模板的序列要紧密互补 • 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发
夹结构 • 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合
反应(即错配)。
PPT学习交流
5
具体因素
• 如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting