primer 6.0 引物设计教程

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中，找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象.2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5,点击File—New—DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内(选择As），此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索"、“引物编辑"以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度.在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300~500bp。

③点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后,会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况: 3'不要出现连续的3个碱基相连的情况,比如GGG或CCC，否则容易引起错配.此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间,GC％应该在45％～55％间,上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好.该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置.若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好.但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。

引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。

选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。

GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。

避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。

可以使用软件工具检查引物的这种可能性。

避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。

选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。

此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。

使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。

这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。

实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。

引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。

请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。

引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。

引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。

因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。

步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。

这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。

确定目标序列后，我们可以继续设计引物。

步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。

这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。

引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。

过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。

GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。

在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。

Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。

Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。

避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。

引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。

步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。

这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。

此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。

步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。

这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。

特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。

PCR引物设计流程详解本文目的：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因,即IL—4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类(Homo sapiens）2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式,并将序列保存到文档二、使用primer premier 5。

0设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为：1—200、201-248、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100—150bp，故设定上游引物位置为201—248,下游引物位置为249—425,产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况(上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中三、使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收4、同理,录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物GC％8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、分析PCR整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入NCBI主页,并选择blast2、选择primer blast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击get primer进行对比4、查看blast结果Blast 结果显示，尽管IL—4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。

Oligo使用方法介绍作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1，直接用键盘输入：a，点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；b，此时即可键入DNA序列；c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。

点击Edit菜单中的“Readback on”即可。

2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word 文件.html格式，这个功能就显得很有用了。

在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。

当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。

3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。

进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。

一，普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。

我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。

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3个弹出窗口
Melti第n2g8页t/e共m38p页erature
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∆G Internal Stability
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Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
参数选择
突变碱基
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Premier的主要功能：
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感谢您的观看！
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酶切位点分析
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Oligo使用方法介绍作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1，直接用键盘输入：a，点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；b，此时即可键入DNA序列；c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。

点击Edit菜单中的“Readback on”即可。

2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo 不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。

在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo 会自动去除非碱基字符。

当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。

3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo 就可以直接打开序列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。

进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。

一，普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。

我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。

PCR引物设计方法及步骤查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。

接下来，我们将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。

PCR（polymerase chain reaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。

PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。

引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过T aq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

引物设计步骤与要点引物（primer）是在 DNA 或 RNA 聚合酶链式反应（PCR）或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）中使用的短的 DNA 或 RNA 片段。

引物通过与目标序列的互补配对，为 PCR 或 RT-PCR 提供起始点，使得复制过程能够在目标序列上进行。

引物的设计是 PCR 或 RT-PCR 的关键步骤，影响其特异性和效率。

下面将介绍引物设计的步骤与要点。

引物设计的步骤如下：1.确定目标序列：首先要明确所需扩增的目标DNA或RNA序列。

例如，目标序列可以是特定基因的编码区域，或者是需要检测的病原体的DNA片段。

2. 引物长度：引物的长度通常在 18-30 bp 之间。

长度较长的引物可能会导致非特异性扩增，而较短的引物可能会导致不够稳定，产生非特异性扩增产物。

在设计引物时，应注意避免引物间或引物与模板间的互相互补性。

3.GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。

GC含量过高可能导致引物之间的二聚体形成，而GC含量过低可能导致引物的稳定性不足。

4.特异性：引物应与目标序列的特定部分互补配对，以确保特异性扩增。

在设计引物时，通常选择序列中的保守区域作为互补匹配的区域，以确保其在各物种或基因型中的适用性。

此外，可以通过使用在线工具，如NCBIBLAST，对引物进行特异性检测，以避免与非目标序列互补匹配。

5. 引物之间的互补配对：在 PCR 扩增中，引物通常成对使用，所以引物之间不应存在互补配对，以避免二聚体形成。

另外，引物对之间的距离应合适，通常在 100-300 bp 之间。

6.引物的末端设计：引物的末端设计直接影响PCR的效率和特异性。

在设计引物时，应注意避免末端的一些特定的串扰序列，如GGGG、CCCC、AAAA、TTTT等。

此外，引物的末端可以添加一些特定的序列，如引物标记和引物序列的识别序列，以便进一步的实验操作。

引物设计的要点如下：1.使用专业软件或在线工具进行辅助设计：可以使用一些专业的引物设计软件或在线工具来辅助引物的设计。

primer 6.0 引物设计教程首先，需要知道基因序列，如，我们要设计rat的 CK18 mRNA 检测的引物，我们先到这个网站查找CK18 mRNA的基因序列，首先选择Nucleotide 然后在搜索栏输入基因序列号（如果不知道基因序列号则输入 rat CK18）如图然后点击搜索，就会出现rat CK18 mRNA的基因序列基因序列号现在，往下拉就会看到基因序列将这个序列复制到primer 6.0中就可以进行引物设计，我们先打开peimer 6.0破解版打开会出现这个对话框，关闭即可将序列复制至这个对话框点击新建点击 Add点击这个图标出现下面对话框，这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物，我一般不更改，也就是引物可以设计在整个序列，你也可查一下序列有几个区，一般引物应该跨两个区。

之后点击 primer Parameters这里可以设置退火温度、引物长度、产物长度等，我一般只是更改产物长度，我一般设为100到300bp，因为如果产物太大，在染料法中会影响扩增效率，之后点击 Search 之后出现下面对话框点击OK 出现下面引物序列这个时候引物设计完成，我们需要对引物进行验证，我一般到NCBI（）上验证，进去后点击最下面菜单中的BLAST之后点击Primer-BLAST 点击这个图标点击这个图标将前引物复制到图中位置在这输入前引物将后引物复制（注复制前引物用 Copy Sense Primer，复制后引物用Copy Anti-sence Primer 点击右键即出现复制菜单）后引物放到下图位置在这输入后引物之后将图中位置的homo sapiens 删除后输入rat出现上图对话框时选择Rattus（taxid：10114）之后点击Get Primers点这里这时会出现下图情况，因为服务器在国外，请耐心等待之后出现他能扩增很多大鼠基因，如CK18 产物为126bp，Ahsg 产物795bp，但是除了CK18 其他基因扩增是产物较大，而且有点突变，所以在PCR反应时这些东西是扩增不出来的，也就是说这个引物的特异性不错，在扩增时只会扩增出我们需要的CK18这个基因，所以这个引物我们就可以订出去，找公司合成。

红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框
GFP序列(~700bp)
ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT
引物设计的原则
11、引物的5′端
引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰， 引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记 生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质 结合DNA序列；引入点突变、插入突变、 缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物设计的原则
12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳 定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定 (如AT含量较多)的引物
引物设计的原则
7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列
引物自身不应存在互补序列，否则引物 自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引 物本身复性。这种二级结构会因空间位 阻而影响引物与模板的复性结合。
引物设计的原则
8、碱基要随机分布

一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～5 00bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

手把手教你设计引物（图文并茂）不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。

没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。

引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。

这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。

就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。

如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。

以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站/index.html1. 输入目的基因，进入2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS6. 然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断下载后打开的WORD7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。

选取并复制第6和第7外显子序列8. 登陆/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到。

1、打开后的界面如图。

2、点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图3、输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。

4、此主题相关图片如下：选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏此主题相关图片如下：选中OK键，5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶此主题相关图片如下：6、选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。

此主题相关图片如下：7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下8、可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可此主题相关图片如下：9、在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III 酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。

此主题相关图片如下：10、选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。

11、从3端删除7－9个碱基同正义链。

此主题相关图片如下：12、将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。

完成后点analyze，认为可以后点OK。

此主题相关图片如下：13、最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。

GC含量不应超过60％此主题相关图片如下：14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印此主题相关图片如下：15、如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示，同上输入目的基因片段，选SEARCH图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere 中的参数可以不选，为默认设置。

Primer Premier 6.0的使用技巧图文简介2.1.1 功能“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找。

“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。

此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。

有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。

这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。

遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。

“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。

软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物(vertebrates)线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物(vertebrates)线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。

2.1.2 使用步骤及技巧“Premier”软件启动界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。

限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。

引物设计的详细步骤引物设计步骤如下：1.目标序列选择：根据研究目的选择需要扩增或检测的目标DNA序列。

这个目标序列可能是基因的特定区域、启动子区域、外显子、cDNA序列等。

选择一个合适的目标序列对于引物设计至关重要，因为它将决定引物的特异性和扩增产物的大小。

一般而言，目标序列具有良好的保守性和特异性。

2.引物长度和Tm计算：引物通常是15-30个核苷酸长度。

引物长度的选择取决于目标序列的特点以及所使用的实验条件。

合适的引物长度应该综合考虑引物的特异性和扩增效率。

引物的熔解温度（Tm）是指DNA链的两个链断裂开所需要的温度，它是引物设计中一个重要的参数。

Tm可以通过计算引物的碱基组成、盐度和引物浓度等因素来估计，通常约为55-65℃。

3. 引物特异性检查：使用生物信息学工具，如BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）或NCBI（National Center forBiotechnology Information）数据库来检查所设计引物的特异性。

确保引物不会扩增与目标序列不匹配的区域，避免非特异性扩增和假阳性结果。

4.引物序列设计：根据目标序列和引物长度选择合适的引物序列。

引物设计的要求包括：GC含量约为40-60%、避免重复序列和目标序列内部的局部重复、避免碱基偏差和突变等。

此外，引物的碱基组成应该是均匀的，避免多个连续G或C碱基的存在。

6.引物的合成：将设计好的引物交给合成公司进行合成，通常采用化学合成方法。

引物的质量控制非常重要，合成的引物应进行质控检测，如毛细管电泳或质谱分析。

推荐文献：2. Untergasser A, et al. (2024) Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40(15): e115.。

引物设计是分子生物学研究中必不可少的技术之一、通过遵循上述步骤和参考推荐文献，可以设计出特异性高、效率好的引物，为后续实验的顺利进行提供支持。