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等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
TA仪器等温滴定微量热仪Nano ITC是专为来源有限的、纯的、释释的生物样品的结合与动力学研究设计的。
使用Nano ITC，可以在1纳摩尔或更少量的生物聚合物中检测到低至120纳焦耳的热量。
Nano ITC采用一个固态的热电加热和冷却系统来精确地控制温度，并用独特的抽取式注射器来有效精确的进行滴定。
Nano ITC内置且准确的等温功率补偿设计，能在最快的响应时间（12秒）内进行及时的补偿。
Nano ITC等温滴定微量热仪的高灵敏度测量池是采用99.999%的黄金或哈司特镍碳合金制成，以适应绝大多数化学试剂。
圆锤形的设计不仅使清洗变得容易，而且也使溶液的搅拌更为有效。
Nano ITC等温滴定微量热仪的绝热板封装在密闭真空室中，使得仪器不易受环境变化的影响，温度稳定性可达±0.005℃。
独特的、可移动的抽取式注射器其末端包含一个桨状机械搅拌器，搅拌速度极容易调节，以适应样品的物理性质。
纳瓦ITC的这种整体组装的搅拌装置能够保证样品快速充满、样品清理及精确的滴定。
等温滴定微量热仪性能参数：
最低可检测热量0.1微焦耳
最高可检测热量10,000微焦耳
低噪音水平0.004微瓦
基线稳定性0.04微瓦/小时
温度稳定性25℃时0.005℃
工作温度2～80℃
测量池类型固定圆锥形
样品体积 1.0毫升
响应时间12秒。
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用液剂中蛋白药物的稳定的一个重要因素是适当的辅料的选择，适宜的辅料浓度能够在延长药物保质期的同时确保患者的最高的用药安全。
尽管过去十年间的文献报道了维持稳定性的一般准则，但是在存储期间辅料如何提升蛋白药物的稳定性，其机制尚未完全明晰。
为能合理优化蛋白制剂，掌握有关蛋白-辅料相互作用机理的知识十分重要。
通过微量热技术来研究来探索蛋白-辅料的相互作用，因而被越来越多的应用于生物制剂的研发和优化。
通过使用等温滴定量热仪（ITC）和差示扫描量热仪（DSC）等技术，评估与相互作用有关的热力学参数，例如辅料-蛋白的结合，辅料参与下蛋白质伸展等，揭示研发最优制剂所需的重要机理信息。
这里我们列举两个ITC和DSC是怎样辅助蛋白制剂研发的例子。
在第一个例子中，使用ITC揭示了聚山梨酯80（常用表面活性剂，通过降低蛋白表面吸附和聚集以稳定蛋白性质）与蛋白X（ProX）之间的相互作用。
使用单位点模型拟合ITC数据计算得出结合亲和常数（K A）=1430±260 M-1，结合焓（△H）=-6.3±1.1 kcal/mol，每个ProX 分子结合位点数（n）=2.6±0.3。
另外一个例子中，使用DSC和ITC产生的数据集显示在抗菌防腐剂，苯酚存在的条件下，ProX在pH5.7时结构最稳定。
因而在上述两个研究中，来自于GE Healthcare生命科学部的等温滴定量热仪ITC200 和差示扫描量热仪VP-Capillary DSC在探寻制备ProX最佳制剂方法方面提供了非常重要的信息。
由于蛋白质分子内在的不稳定性，包括物理不稳定性（伸展、聚集、吸附）和化学降解性（氧化、脱酰胺、断裂），以基于蛋白质的治疗发展面临着巨大的挑战。
蛋白的不稳定可以导致蛋白活性降低甚至可能产生潜在的免疫原性。
为增加蛋白的稳定性，可以尝试改变蛋白所在溶剂的性质，包括选择缓冲液系统，调节pH值，添加辅料/添加剂，即研发最佳剂型。
等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究龚丽娜;李天佐【摘要】目的:采用等温滴定量热法探讨镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用,并明确可否同一装置给药.方法:根据临床用药习惯把试验样品分成四组,采用等温滴定量热法观察临床常用的术后镇痛药舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及止吐药昂丹司琼的相容性.模拟手术室温度为25℃,测定各药物的热力学参数吉布斯自由能ΔG和结合常数焓变ΔH和熵变ΔS,得到相应的反应活性图谱,通过比较|ΔH|与T|ΔS|,结合数据绘图定性分析来判断溶合反应类型.结果:四组试验样品两两溶合过程中均为|ΔH|<T|ΔS|,反应活性谱热量变化(<0.05μJ)为熵驱动反应,未发生质变.结论:舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及昂丹司琼结合未发生化学反应,临床上的联合应用是安全可靠的,可在同一给药装置配泵给药.【期刊名称】《中国医院用药评价与分析》【年(卷),期】2019(019)004【总页数】7页(P393-398,402)【关键词】术后镇痛药;同一装置给药;相容性;等温滴定量热法【作者】龚丽娜;李天佐【作者单位】首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089;首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089【正文语种】中文【中图分类】R969.2随着外科手术量的逐年增长、快速康复外科理念的影响及人们对术后舒适度的要求不断提高，术后镇痛泵的应用越来越多，应用的药物种类也在增加，多模式镇痛和联合用药已成为趋势[1-2]。
目前主要使用阿片类药物[3]、非甾体药及止吐药等。
理论上，根据不同药物的作用靶点不同的机制可使镇痛更加完善，减少各药物的不良反应[4]。
但临床实际应用中，各药物之间是否发生成分的改变尚不清楚，特别是术后镇痛泵中经常加入4种甚至更多药物在同一装置给药。
联合用药在具有优势的同时[5-7],也存在着风险和危害[8-9]。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011008921.4(22)申请日 2020.09.23(71)申请人 上海理工大学地址 200093 上海市杨浦区军工路516号(72)发明人 徐斐 张坤 阴凤琴 袁敏 曹慧 叶泰 吴秀秀 (74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限公司 31204代理人 郁旦蓉(51)Int.Cl.G01N 25/48(2006.01)G01N 24/08(2006.01)G01N 31/16(2006.01)(54)发明名称等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法(57)摘要本发明提供一种等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法，用于测定金属离子与生物小分子结合过程中的热力学参数和具体结合位点，包括：S1，配制缓冲溶液；S2，采用缓冲溶液分别配制一定浓度的金属离子溶液以及功能单体溶液，而后进行超声处理、冷冻离心，得到处理后的金属离子溶液以及处理后的功能单体溶液；S3，将处理后的金属离子溶液以及处理后的功能单体溶液分别加入等温滴定量热仪的滴定针和样品池中，并设置相关试验参数，而后测定处理后的金属离子溶液中的金属离子与处理后的功能单体溶液中的生物小分子之间结合的热力学参数；S4，利用核磁共振光谱仪测定金属离子与生物小分子之间结合的具体结合位点。
权利要求书2页 说明书4页 附图2页CN 112113998 A 2020.12.22C N 112113998A1.一种等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法，用于测定金属离子与生物小分子结合过程中的热力学参数和具体结合位点，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，配制一定浓度的缓冲溶液；步骤S2，采用所述缓冲溶液分别配制一定浓度的金属离子和功能单体溶液，而后进行超声处理、冷冻离心，得到处理后的金属离子溶液以及处理后的功能单体溶液；步骤S3，将处理后的所述金属离子溶液以及处理后的所述功能单体溶液分别加入等温滴定量热仪的滴定针和样品池中，并设置相关试验参数，而后测定处理后的所述金属离子溶液中的金属离子与处理后的所述功能单体溶液中的生物小分子之间结合的热力学参数；步骤S4，利用核磁共振光谱仪测定所述金属离子与所述生物小分子之间结合的具体结合位点。
等温滴定微量热仪设备安全操作规程等温滴定微量热仪是一种常见的热分析仪器，广泛应用于材料科学、化学、生物学等领域。
安全操作等温滴定微量热仪，不仅可以保证实验室人员的人身安全，还可以保证实验的准确性和可靠性，避免实验数据受到污染和误差。
本文将介绍等温滴定微量热仪的设备安全操作规程。
一、前提准备在进行等温滴定微量热仪的试验前，需要进行一系列的前提准备工作，以确保实验数据的准确性和人身安全。
1.1 实验室安全标准在进行等温滴定微量热仪的试验前，需要了解实验室的安全标准，并遵守以下规则：•禁止在实验室内吸烟或进食；•禁止在实验室内运动或嬉戏；•禁止携带易燃、易爆、有毒或有害物质进入实验室。
1.2 实验室环境安全检查在进行等温滴定微量热仪的试验前，应对实验室环境进行安全检查，并确保以下环境条件：•实验室内温度、湿度、压力、气氛等相关参数要符合实验要求；•所有电气设备的接地要良好，电源线绝缘要完好；•实验室内要配备灭火器或灭火设备，并放置在易燃物品附近。
1.3 设备安全检查在进行等温滴定微量热仪的试验前，应对设备进行安全检查，并确保以下设备安全条件：•设备的电源安全开关和保险丝要保持完好；•设备外壳和内部结构要保持干燥、清洁、整洁和光滑；•采样管和试样夹要保持干燥，采样管要无油且没有残留。
二、操作步骤在进行等温滴定微量热仪的试验时，应按以下操作步骤进行，并遵守以下实验规则：2.1 准备操作2.1.1 着装要求在进行等温滴定微量热仪的试验前，需要注意以下着装要求：•穿着合适的实验服，避免穿过长、过宽或过紧、过短的衣服；•戴上实验手套和安全眼镜，避免接触试剂和实验注射液。
2.1.2 调试仪器在进行等温滴定微量热仪的试验前，需要进行如下操作：•按照操作手册进行仪器调试，以保证仪器的工作状态正常；•在开始试验前进行基底扫描，以确保实验仪器的准确性和规范性。
2.2 试样操作2.2.1 试样准备在进行等温滴定微量热仪的试验前，需要进行如下操作：•试样应按照实验要求，准确称取或按体积分装，并进行预处理；•简要检查采样管和试样盖的条纹是否清晰、无杂质，并检查试样盖的防尘功能是否正常。
等温滴定量热法浓度优化等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学领域的实验技术。
通过测量反应在等温条件下产生或吸收的热量，ITC可以帮助研究人员了解溶液中分子之间的相互作用，如配体和受体的结合、酶催化反应以及protein-protein 相互作用。
通过优化等温滴定量热法的浓度参数，可以提高实验结果的质量和可靠性。
在优化等温滴定量热法的浓度时，有几个关键因素需要考虑。
首先是实验物质的浓度范围。
选择适当的浓度范围可以确保反应产生的热量在仪器检测范围内，同时减少背景噪音的干扰。
一般来说，对于正常的反应热量，推荐使用0.1-2.0 mM的溶液浓度。
然而，对于特殊的反应系统，需要事先进行一些初步实验，以确定最佳的溶液浓度范围。
其次是选择合适的滴定量。
滴定量是指每一次滴加到反应体系中的试剂量。
在进行等温滴定量热法实验时，滴定量的选择将直接影响到实验的敏感性和准确性。
一般来说，滴定量应尽量小，以确保每一次反应的热效应可以被仪器检测到，同时避免反应溶液的剧烈稀释或稀释不足。
通常情况下，滴定量为0.5-2.5 μL。
还需要考虑实验温度和缓冲溶液的选择。
实验温度应根据实验系统的特性和要研究的反应进行合理的选择。
对于生物体系来说，一般选择25℃或37℃作为实验温度。
而对于非生物体系，可根据需要进行调整。
缓冲溶液的选择应该使得反应体系在所选温度下保持稳定，并且不对测量结果产生干扰。
在实施等温滴定量热法浓度优化实验时，以下是一些有效的实践经验和技巧：1. 从简单到复杂地确定浓度范围。
首先可以进行一些初步实验，选择几个不同浓度的溶液进行测试，进而找到适合体系的浓度范围。
可以根据实验结果调整溶液的浓度，并逐渐扩大范围。
2. 手动混匀溶液，确保均匀分布。
在进行实验前，用手动混匀的方法将溶液均匀混合，以确保反应物质在整个试验过程中处于均一的状态。
